郭亞楠， 陳 陽， 崔利董， 趙梅杰， 張守濤

(鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 河南 鄭州 450001)

0 引言

CD47，又名整合素相關(guān)蛋白 (integrin associated protein，IAP)，是一種廣泛表達(dá)的抗原.CD47為跨膜糖蛋白,幾乎在所有組織不同細(xì)胞表面表達(dá)，屬于免疫球蛋白超家族成員.在不同物種間，CD47相當(dāng)保守，大鼠、小鼠、牛和人的CD47蛋白中60%～70%的氨基酸序列都是相同的[1].目前研究CD47的免疫調(diào)控機(jī)制及其在腫瘤的免疫監(jiān)視中的功能多采用CD47單克隆抗體，用 CD47抗體來抑制或阻斷細(xì)胞表面CD47抗原與其配體的結(jié)合，從而闡明CD47在病理和生理中的作用機(jī)理[2].為了進(jìn)一步探索研究CD47信號通路在免疫調(diào)控及腫瘤免疫監(jiān)視中的分子機(jī)制，有必要表達(dá)純化CD47，通過CD47融合蛋白發(fā)揮“占位”作用，深入探索CD47的分子機(jī)制.我們構(gòu)建了一個帶有CD47-Fc基因的真核表達(dá)載體pcDNA3.1 (-)-CD47-Fc，它可以在293T細(xì)胞中表達(dá)CD47-Fc融合蛋白，純化后的CD47-Fc可以結(jié)合SIRPα，為進(jìn)一步研究CD47體內(nèi)外分子機(jī)制以及腫瘤、自身性免疫疾病等相關(guān)疾病的治療奠定了基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞 質(zhì)粒pcDNA3.1(-)由本實驗室保存；大腸桿菌(E.coli)DH5α購自康為生物(北京)公司； 293T細(xì)胞株為本室液氮保存.

1.1.2實驗動物 選擇野生型BALB/c純系小鼠5只，雌性，6～8周齡，體重18～20 g，購于河南省實驗動物中心，飼養(yǎng)于本實驗室SPF級動物室.

1.1.3主要試劑Pfu酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ、EcoR1和T4 DNA連接酶購自NEB(北京)；DNA回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自生工生物(上海)公司；DNA、蛋白Marker、瓊脂糖等常用分子生物學(xué)試劑購自康為生物(北京)公司；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體、兔IgG1抗體購自博士德生物(武漢)公司；ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自Sigma(美國)；血清及培養(yǎng)基購自生工生物(上海)公司；引物或基因由金維智生物(北京)公司合成.親和層析柱料購自GE Healthcare(美國).

1.2 方法

1.2.1表達(dá)載體pcDNA3.1(-)-CD47-Fc的構(gòu)建及鑒定 從NCBI數(shù)據(jù)庫中查到家兔IgG1重鏈基因序列(登陸號：K00752.1)，委托金維智生物(北京)公司合成兔IgG1重鏈基因部分序列(編碼氨基酸175～402).以合成DNA序列為模板，序列Fc-For：TTTGGATCCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTG GCGGATCC；Fc-Rev：AACTAAGCTTTCATTTACCCGGAGAGCG為引物，通過PCR擴(kuò)增目的基因；然后分別用BamH1和HindIII對PCR 產(chǎn)物和載體pcDNA3.1(-)進(jìn)行雙酶切，用T4連接酶連接產(chǎn)物；轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α菌株，涂平板、篩選陽性克??；隨后提質(zhì)粒、BamH1和Hind III雙酶切驗證，陽性質(zhì)粒測序，保存測序正確的pcDNA3.1(-)-Fc質(zhì)粒和菌種.提取BALB/c小鼠脾臟RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA文庫，使用引物CD47-For和CD47-Rev.

CD47-For：ATCTCTCGAGATGTGGCCCTTGGCGGCG，CD47-Rev：AATCTGGATCCCGTGCGGTTTTTCAGCTC.

通過PCR擴(kuò)增CD47基因.以pcDNA3.1(-)-Fc為載體構(gòu)建質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-CD47-Fc，構(gòu)建方法同上.保存測序正確的質(zhì)粒和菌種.上述所有引物中下劃線序列皆為酶切位點.

1.2.2CD47-Fc融合蛋白的表達(dá)和純化 用含90%DMEM、雙抗和10%FBS的完全培養(yǎng)基，在5%CO2的37 ℃溫箱中培養(yǎng)293T細(xì)胞.待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿約60%～70%的時候，將陽性pcDNA3.1(-)-CD47-Fc質(zhì)粒通過磷酸鈣法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞.磷酸鈣轉(zhuǎn)染48小時后，每隔一天收集培養(yǎng)基一次，共計收集4次.然后離心，收集上清用0.22 μm膜過濾，使用HiTrap Protein A HP純化柱純化目標(biāo)蛋白(純化步驟按說明書進(jìn)行)，通過SDS-PAGE和Western Blotting檢測蛋白純化結(jié)果.

1.2.3細(xì)胞黏附分析 純化的CD47-Fc(終濃度5 μg/mL)或BSA(5%)使用HBSS稀釋，通過4 ℃過夜孵育固定在96孔ELISA板上.用含10%正常馬血清的HBSS溶液室溫孵育1小時封閉非特應(yīng)性結(jié)合位點，然后每孔加入1×106個BALB/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(腹腔巨噬細(xì)胞分離方法參見文獻(xiàn)[3])室溫孵育30 min.孵育結(jié)束后，每孔用HBSS輕輕洗3次，除去未結(jié)合的細(xì)胞.然后在顯微鏡下分析巨噬細(xì)胞與CD47-Fc或BSA結(jié)合狀況.

1.2.4細(xì)胞標(biāo)記、熒光顯微鏡及流式分析 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞用含5%正常山羊血清的HBSS溶液冰浴封閉1小時，然后用純化的CD47-Fc(終濃度5 mg/mL) 冰浴孵育30 min并標(biāo)記細(xì)胞表面的SIRPα蛋白.孵育結(jié)束后用4 ℃預(yù)冷的HBSS溶液輕輕潤洗3次，用FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗冰浴孵育30 min，標(biāo)記CD47-Fc融合蛋白.孵育結(jié)束后用4 ℃預(yù)冷的HBSS溶液輕輕潤洗3次，然后通過熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀分析標(biāo)記結(jié)果.使用兔IgG1抗體作為陰性對照.

2 結(jié)果與分析

2.1 鼠CD47真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)-CD47-Fc構(gòu)建與鑒定

從NCBI數(shù)據(jù)庫下載委托公司化學(xué)合成家兔IgG1編碼氨基酸175～402的部分Fc DNA序列.為了構(gòu)建pcDNA3.1(-)-Fc重組質(zhì)粒，首先通過PCR擴(kuò)增Fc DNA序列.PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析后，結(jié)果顯示擴(kuò)增條帶大小為750 bp左右，與預(yù)期理論值相符(圖1).質(zhì)粒pcDNA3.1(-)、切膠回收純化的Fc DNA經(jīng)BamH1和Hind II酶切、T4連接酶處理后形成重組載體pcDNA3.1(-)-Fc，反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，氨芐青霉素抗性篩選后挑取陽性單克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切，電泳結(jié)果顯示酶切產(chǎn)物大小與理論值相符(圖1).測序鑒定酶切陽性質(zhì)粒，序列比對結(jié)果顯示與數(shù)據(jù)庫一致，說明質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-Fc正確構(gòu)建.接下來PCR擴(kuò)增CD47 DNA序列，PCR產(chǎn)物電泳分析，顯示條帶大小為470 bp左右，與理論值相符(圖1).質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-Fc、純化PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切、T4連接酶處理后形成pcDNA3.1(-)-CD47-Fc重組載體，載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，氨芐青霉素抗性篩選后挑取陽性單克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切，電泳結(jié)果顯示酶切產(chǎn)物大小與理論值相符(圖1).測序鑒定酶切陽性質(zhì)粒，序列比對顯示結(jié)果與數(shù)據(jù)庫一致，確定質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-CD47-Fc構(gòu)建正確.

a) 兔IgG1 Fc基因的PCR擴(kuò)增；M：DNA marker，1：PCR 擴(kuò)增兔IgG1 Fc基因b) 質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-Fc經(jīng)BamHI、Hind III雙酶切電泳圖；M：DNA marker，1：質(zhì)粒雙酶切c) PCR擴(kuò)增兔小鼠CD47基因；M：DNA marker，1：PCR 擴(kuò)增小鼠CD47基因d) 質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-CD47-Fc 經(jīng)XhoI、Hind III雙酶切電泳圖；M：DNA marker，1：質(zhì)粒雙酶切圖1 構(gòu)建質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-CD47-FcFig.1 Construction of plasmid pcDNA3.1(-)-CD47-Fc

a) SDS-PAGE 檢測純化的CD47-Fc 蛋白b) Western Blotting檢測CD47-Fc 蛋白圖2 分析檢測純化的CD47-Fc蛋白Fig.2 Analysis and detection of purified CD47-Fc protein

2.2 鼠CD47-Fc融合蛋白的表達(dá)和純化

培養(yǎng)293T細(xì)胞，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿約60%～70%的時候，將陽性pcDNA3.1(-)-CD47-Fc質(zhì)粒通過磷酸鈣法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞.質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后，每隔一天收集培養(yǎng)基一次，共計收集4次.然后離心收集上清用0.22 μm膜過濾，使用HiTrap Protein A HP親和層析柱純化目標(biāo)蛋白，通過SDS-PAGE檢測融合蛋白純化結(jié)果，結(jié)果顯示融合蛋白分子量為45 kD，與預(yù)期值相符(見圖2).同時通過Western Blotting鑒定兔Fc，結(jié)果證實鼠CD47-Fc融合蛋白成功表達(dá)(見圖2).

2.3 鼠CD47-Fc融合蛋白活性分析

2.3.1細(xì)胞標(biāo)記及流式分析CD47-Fc活性 大量研究已證實CD47蛋白的配體為SIRPα，而巨噬細(xì)胞高表達(dá)SIRPα蛋白.要想分析純化的CD47融合蛋白活性，可通過CD47與巨噬細(xì)胞表面表達(dá)的SIRPα是否相互作用來檢測.分離的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞用5%血清冰浴封閉，然后用純化的CD47-Fc(終濃度5 mg/mL)融合蛋白冰育標(biāo)記細(xì)胞表面的SIRPα蛋白.隨后用PBS潤洗除去未結(jié)合的CD47-Fc，用FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗冰育標(biāo)記CD47-Fc.孵育結(jié)束后輕輕潤洗除去未結(jié)合的熒光二抗，然后通過熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀分析標(biāo)記結(jié)果.使用兔IgG1抗體作為一抗標(biāo)記的腹腔巨噬細(xì)胞做陰性對照.熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀都顯示：CD47-Fc可以標(biāo)記腹腔巨噬細(xì)胞(見圖3、圖4)，而作為對照的兔IgG1蛋白則不結(jié)合腹腔巨噬細(xì)胞.這些結(jié)果說明純化的CD47-Fc活性較高.

2.3.2細(xì)胞黏附分析CD47-Fc活性 純化的CD47-Fc用HBSS稀釋至終濃度5 μg/mL，通過4 ℃過夜孵育固定在96孔ELISA板上.用含10%正常馬血清HBSS溶液室溫孵育1小時，封閉ELISA板上非特應(yīng)性位點，然后每孔加入1×106個純化的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，室溫孵育30分鐘.孵育結(jié)束后，每孔用HBSS輕輕洗3次除去未結(jié)合的細(xì)胞.用固定的兔IgG1抗體作為陰性對照.然后在顯微鏡下分析腹腔巨噬細(xì)胞與CD47-Fc或兔IgG1結(jié)合狀況.鏡下觀察，顯示大量腹腔巨噬細(xì)胞與固定的CD47-Fc蛋白相結(jié)合，而作為對照的兔IgG1蛋白則幾乎沒有腹腔巨噬細(xì)胞與之結(jié)合.已證實腹腔巨噬細(xì)胞高表達(dá)CD47蛋白的配體SIRPα.大量腹腔巨噬細(xì)胞與固相CD47-Fc蛋白相結(jié)合，不結(jié)合兔IgG1蛋白進(jìn)一步說明純化的CD47-Fc活性較高.

圖3 標(biāo)記腹腔巨噬細(xì)胞表面SIRPα 用CD47-Fc融合蛋白Fig.3 Label SIRPα of peritoneal macrophage cells by CD47-Fc fusion protein

圖4 用CD47-Fc標(biāo)記腹腔巨噬細(xì)胞SIRPα的流式分析結(jié)果Fig.4 Flow cytometry analysis of SIRPα on the surface of peritoneal macrophages by CD47-Fc fusion protein

3 討論

近年來CD47 作為自體識別作用中的關(guān)鍵分子——“細(xì)胞免死”標(biāo)志而引起重視.研究還證實CD47蛋白涉及多種臨床疾病.在多種惡性腫瘤中， CD47蛋白皆呈現(xiàn)高表達(dá)與SIRPα結(jié)合，產(chǎn)生抑制信號使腫瘤細(xì)胞逃避免疫細(xì)胞吞噬殺傷.研究還發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞表面CD47蛋白表達(dá)水平與疾病預(yù)后成負(fù)相關(guān).因此，CD47成為腫瘤靶向治療的一個新靶點[4].已有報道以CD47作為靶點，通過制備CD47的單克隆抗體來阻斷或抑制CD47與SIRPα相互作用，可以治療腫瘤[5-6].但人源化抗體制備耗時較長，成本較高.本文嘗試表達(dá)CD47融合蛋白, 為進(jìn)一步研究移植、自身免疫性疾病治和腫瘤等相關(guān)疾病奠定基礎(chǔ).因CD47胞外區(qū)IgV結(jié)構(gòu)域含有二硫鍵，在大腸桿菌系統(tǒng)中表達(dá)CD47易形成包涵體發(fā)生降解.通過與Trx標(biāo)簽融合，Lin等在大腸桿菌中成功表達(dá)出CD47融合蛋白[7].但大腸桿菌表達(dá)融合蛋白常含有內(nèi)毒素，限制了CD47的應(yīng)用.因此，大多數(shù)研究采用真核細(xì)胞表達(dá)CD47，并用Fc作為融合標(biāo)簽，不僅方便純化，而且有利于提高CD47-Fc融合蛋白在體內(nèi)的半衰期.經(jīng)研究，本文采用真核表達(dá)系統(tǒng)HEK293T細(xì)胞表達(dá)鼠CD47胞外區(qū).HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率非常高，可通過瞬轉(zhuǎn)質(zhì)粒，實現(xiàn)外源蛋白的高表達(dá)，不需要篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，節(jié)約了時間.HEK293T細(xì)胞表達(dá)鼠CD47-Fc后，通過親和層析純化得到了純度較高的CD47-Fc融合蛋白.進(jìn)一步通過免疫熒光染色、流式細(xì)胞技術(shù)和細(xì)胞黏附實驗，檢測融合蛋白CD47-Fc的生物學(xué)活性.結(jié)果顯示，所制備的融合蛋白CD47-Fc具有較高的生物學(xué)活性，可與SIRPα很好地相互作用，為進(jìn)一步研究CD47的生物學(xué)功能以及腫瘤等相關(guān)疾病奠定了基礎(chǔ).

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