韓岳桐， 趙 堃， 王 森， 徐巧燕， 李志偉， 萬一平， 董俊偉， 馬丙瑞， 高孟春??

(1. 中國海洋大學(xué)海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266100； 2. 中國海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島266100)

眾所周知，廢水生物處理系統(tǒng)中大多數(shù)微生物是不可培養(yǎng)的，可分離培養(yǎng)的微生物只占1%左右[5]。近年來，高通量測序技術(shù)以邊合成邊測序技術(shù)為基礎(chǔ)，通過可逆終止試劑方法對(duì)數(shù)百萬個(gè)片段同時(shí)進(jìn)行大規(guī)模平行測序，具有分析結(jié)果準(zhǔn)確、高速等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于污水處理過程中微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性研究[6]。閆媛等[7]采用高通量測序分析了了全程自養(yǎng)脫氮系統(tǒng)不同脫氮效能下的微生物群落結(jié)構(gòu)的變化。Ma 等[8]和Wang等[9]通過高通量測序技術(shù)分別評(píng)價(jià)了Fe3O4納米顆粒和ZnO納米顆粒濃度變化對(duì)序批式生物反應(yīng)器內(nèi)微生物豐度和多樣性的影響。Gao等[10]通過高通量測序解析了單室微生物燃料電池在厭氧污泥或好氧污泥接種情況下陽極生物膜中微生物群落的富集。Liu等[11]利用高通量測序分析了在低溫下厭氧氨氧化反應(yīng)器處理低濃度廢水的微生物特征。Ma等[12]通過Illumina MiSeq高通量測序平臺(tái)考察了鋼鐵廠煉焦廢水處理廠中微生物群落組成。鑒于以往的研究成果，高通量測序技術(shù)應(yīng)用于解析青島海泊河污水處理廠缺氧池的微生物群落結(jié)構(gòu)變化是可行的。因此，本論文基于Illumina MiSeq高通量測序平臺(tái)，系統(tǒng)地研究了不同月份缺氧池內(nèi)微生物豐度和多樣性變化，評(píng)價(jià)了不同月份缺氧池內(nèi)微生物群落的相似性和差異性，從門、綱和屬等水平上解析了缺氧池內(nèi)微生物群落的變化，為進(jìn)一步闡明環(huán)境條件變化下缺氧池中微生物群落結(jié)構(gòu)與其功能的關(guān)系提供一定基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 缺氧池污泥樣品的來源

本研究污泥樣品取自青島市海泊河污水處理廠的缺氧池，取樣時(shí)間分別為1、4、6、8、10和12月，在冰箱中冷凍保存。不同月份污水處理廠進(jìn)水水質(zhì)變化情況如表1所示。

1.2 污泥樣品DNA提取和PCR

利用DNA提取試劑盒(MoBio Laboratories，Carlsbad，CA，USA)按照說明書所列步驟對(duì)缺氧池污泥樣提取DNA，并對(duì)提取的基因組DNA其進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測，核對(duì)基因組DNA的純度與濃度。采用16S rDNA的通用引物515F (5′-GTGCCAGCAGCCGCGGTAA-3′) 和806R (5′-GGACTACCAGGGTATCTAAT-3′) 擴(kuò)增16S rDNA基因。

表1 不同月份污水處理廠進(jìn)水組成

1.3 基于Illumina MiSeq平臺(tái)的16S rDNA高通量測序

基于Illumina MiSeq測序平臺(tái)，利用雙末端配對(duì)測序(Paired-End)的方法對(duì)獲得的DNA樣品構(gòu)建小片段文庫進(jìn)行雙末端測序。為了使分析結(jié)果更加科學(xué)可靠，首先采用QIIME軟件對(duì)上機(jī)得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接過濾，得到有效數(shù)據(jù)。具體步驟如下：(1)去除各樣本中的barcode；(2)去除小于50 bp短片序列；(3)去除低復(fù)雜度序列；(4)提取高質(zhì)量的測定序列?；谟行?shù)據(jù)，設(shè)置97%相似性進(jìn)行OTUs(Operational taxonomic units，簡稱OTUs)聚類和物種分類分析，并將OTU和物種注釋結(jié)合，得到每個(gè)樣品的OTUs和分類譜系。選取相似度為97%的OTU生成稀釋曲線，并利用MOTHUR軟件計(jì)算Good’s coverage、Shannon、Chao 1、ACE和Simpson指數(shù)。通過聚類分析、主坐標(biāo)分析(Principal coordinates ordination，簡稱PCoA)等統(tǒng)計(jì)比較分析，對(duì)比樣品之間的共同性與差異性。本實(shí)驗(yàn)的樣品測序均由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同月份缺氧池內(nèi)微生物豐度和多樣性的變化

表2 不同月份缺氧池中微生物群落的豐富度和多樣性指數(shù)Table 2 Richness and diversity indices of microbial community in the anoxic tank at different months

圖1 不同月份缺氧池中污泥樣品的稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curve of the activated sludge samples in anoxic tank at different months

2.2 不同月份缺氧池內(nèi)微生物的相似性和差異性

本文通過Venn圖考察不同月份污泥樣品中共有OTU和特有OTU數(shù)量分析了缺氧池內(nèi)微生物的相似性和差異性(見圖2)。1、4、6、8、10和12月在缺氧池所取的6個(gè)污泥樣品中總OTU數(shù)是1 022個(gè)，其中719個(gè)為共有OTU，約占總OTU數(shù)的70.4%。從門水平上分析可知，共有OTU中占優(yōu)勢地位的門包括Proteobacteria(42.3%)、Bacteroidetes(21.0%)、Chloroflexi(6.5%)、Firmicutes(6.3%)、Actinobacteria(4.0%)和Planctomycetes(3.8%)。在1、4、6、8、10和12月在缺氧池所取污泥樣品中特有OUT數(shù)量分別為62、35、39、61、63和43個(gè)，約占總OTU數(shù)的29.6%。Venn圖分析結(jié)果表明，大部分微生物隨著運(yùn)行時(shí)間的變化一直存在于缺氧池，在不同運(yùn)行階段只有少數(shù)微生物屬于特有的微生物。

為了更準(zhǔn)確地分析不同月份缺氧池污泥中微生物群落的差異性，本文通過利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)污泥樣品進(jìn)行了主成分分析(Principal Component Analysis，簡稱PCA)和主坐標(biāo)分析(Principal coordinates ordination，簡稱PCoA)。在PCA和PCoA分析圖中樣品距離越接近，表明樣品的群落結(jié)構(gòu)越相似，微生物群落相近的污泥樣品傾向于聚集在一起，而微生物群落差異大的污泥樣品相距很遠(yuǎn)。由圖3(a)可知，8和10月缺氧池的兩個(gè)污泥樣品在PCA圖中的距離最近，說明它們的微生物群落組成最為相似； 4與8和10月的污泥樣品之間距離較近，6和12月的污泥樣品之間距離較近，然而1月與其它月的污泥樣品都存在明顯的距離。由圖3(b)可知，主成分1和2是造成6個(gè)樣品的兩個(gè)最大差異特征，貢獻(xiàn)率分別為30.62%和22.17%。4、8和10月缺氧池污泥樣品在PCoA圖中的距離最近。6和12月的樣品距離比較接近，但是它們與1月的樣品都有較遠(yuǎn)的距離，說明它們之間群落結(jié)構(gòu)組成的差異性很大。結(jié)合表1給出進(jìn)水水質(zhì)變化情況，缺氧池內(nèi)污泥中微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性變化不僅與環(huán)境溫度有關(guān)也與進(jìn)水水質(zhì)存在著一定的必然聯(lián)系，從而出現(xiàn)12和6月的微生物群落具有較高相似性的情況。綜上所述，PCA和PCOA的分析結(jié)果基本一致，即環(huán)境溫度較高的8和10月缺氧池中污泥樣品的微生物群落比較相似，但與環(huán)境溫度較低的1月污泥樣品中的微生物群落之間存在著明顯的差異。

圖2 不同月份缺氧池中污泥的Venn圖Fig.2 Venn diagram of the activated sludge in the anoxic tank at different months

圖3 不同月份缺氧池中污泥的PCA(a)和PCoA(b)分析Fig.3 PCA (a) and PCoA (b) analysis of activated sludge samples in the anoxic tank

圖4為不同月份缺氧池中微生物群落的未加權(quán)聚類分析。缺氧池中微生物群落主要分成三組：1月份為1組；4、8和10月為1組；6和12月為1組。由圖4可知，環(huán)境溫度較低月份缺氧池中微生物群落與環(huán)境溫度較高月份的微生物群落存在明顯差異，這與PCoA主要成分分析結(jié)果是一致的。

2.3 在門水平上缺氧池內(nèi)微生物群落在不同月份的動(dòng)態(tài)變化

圖5表示在門水平上缺氧池內(nèi)微生物群落在不同月份的動(dòng)態(tài)變化。在所取的污泥樣品中占優(yōu)勢的門包括變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、綠菌門(Chlorobi)、浮霉菌門(Planctomycetes)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌(Actinobacteria) 和酸桿菌門 (Acidobacteria)，這些門1、4、6、8、10和12月占總序列的比例依次為97.6%、97.3%、97.6%、96.8%、96.7%和96.9%。1月的污泥樣品中主要門有Bacteroidetes(44.3%)、Proteobacteria(44.0%)、Chlorobi(2.4%)、Firmicutes(1.7%)、Planctomycetes(1.4%)和Acidobacteria(1.0%)。隨著環(huán)境溫度的上升，在6和8月的缺氧池污泥樣品中，Proteobacteria的相對(duì)豐度分別增長到44.8%和46.8%，而Bacteroidetes的相對(duì)豐度分別下降到30.7%和26.4%。10月的污泥樣品中Proteobacteria的相對(duì)豐度增至48.0%，Bacteroidetes的相對(duì)豐度輕微增長到32.4%。在環(huán)境溫度較低的12月缺氧池污泥樣品中，Proteobacteria的相對(duì)豐度繼續(xù)增大到49.7%，而Bacteroidetes的相對(duì)豐度微降至30.1%。由此可見，低溫條件下Proteobacteria的相對(duì)豐度明顯降低，而Bacteroidetes的相對(duì)豐度則顯著增大。在生物處理過程中，Proteobacteria對(duì)有機(jī)物、氮和磷的去除發(fā)揮著非常重要的作用。

圖4 不同月份缺氧池中微生物群落的未加權(quán)聚類分析Fig.4 Unweighted clustering analysis of microbial community in the anoxic tank

圖5 不同月份缺氧池中微生物在門水平上的分類Fig.5 Taxonomic compositions of microbial communities in the anoxic tank at the phylum level

2.4 在綱水平上缺氧池中微生物群落在不同月份的動(dòng)態(tài)變化

圖6表示在綱水平上缺氧池內(nèi)微生物群落在不同月份的動(dòng)態(tài)變化。1月所取污泥樣品中占優(yōu)勢的綱包括Saprospirae(25.5%)、Betaproteobacteria(21.0%)、Gammaproteobacteria(9.6%)、Flavobacteriia(5.4%)、Deltaproteobacteria(5.4%)、Sphingobacteriia(3.9%)、Alphaproteobacteria(3.0%)、Cytophagia(2.8%)、Epsilonproteobacteria(2.1%)、Ignavibacteria(2.1%)、Bacteroidia(1.9%)、Clostridia(1.4%)、Chloracidobacteria(0.8%)和Anaerolineae(0.7%)。與1月相比，在4、6、8、10和12月所取缺氧池污泥中不同綱的相對(duì)豐度或增大或降低，表明了不同季節(jié)(或者進(jìn)水水質(zhì))變化直接影響了缺氧池內(nèi)微生物群落。Saprospirae的相對(duì)豐度從1月25.5%減低到6月14.8%，隨后在8、10和12月穩(wěn)定在(19.7±1.3)%。Betaproteobacteria、Flavobacteriia的相對(duì)豐度在不同月份分別穩(wěn)定在(18.5±3.0)%和(5.0±0.8)%，這表明不同月份對(duì)Betaproteobacteria和Flavobacteriia的豐度沒有明顯的影響。在環(huán)境溫度較低的1和12月Deltaproteobacteria的相對(duì)豐度較高，但是在環(huán)境溫度較高的4、6、8和10月Deltaproteobacteria的相對(duì)豐度在2.4%～2.6%之間變化。Gammaproteobacteria、Cytophagia、Sphingobacteriia、Anaerolineae、Clostridia和Bacteroidia的相對(duì)豐度變化范圍分別為9.6%～22.5%、0.1%～2.8%、3.9%～13.8%、0.7%～3.2%、0.3%～1.4%和0.6%～2.6%，這說明它們的相對(duì)豐度在不同月份受外界環(huán)境(如環(huán)境溫度和進(jìn)水水質(zhì))的影響較大。

圖6 不同月份缺氧池中微生物在綱水平上的分類

2.5 在屬水平上缺氧池內(nèi)微生物群落在不同月份的動(dòng)態(tài)變化

圖7為在屬水平上缺氧池內(nèi)微生物群落在不同月份的動(dòng)態(tài)變化。在1月的污泥樣品中主要屬有Haliscomenobacter(22.9%)、Chitinophaga(6.5%)、Dechloromonas(6.1%)、Acidovorax(4.4%)、Niabella(3.8%)、Haliangium(3.4%)、Bergeyella(3.1%)、Agitococcus(2.8%)、Arcobacter(2.6%)、Arcobacter(2.6%)、Arcicella(2.1%)、Ignavibacterium(1.9%)、CandidatusAccumulibacter(1.6%)、Sulfuritalea(1.3%)、Dokdonella(1.2%)和Nitrospira(0.9%)。與1月的微生物群落相比，不同屬在4、6、8、10和12月缺氧池污泥中相對(duì)豐度或增大或減少，表明缺氧池內(nèi)不同屬的微生物豐度隨著外界環(huán)境的改變呈現(xiàn)不同程度的動(dòng)態(tài)變化。Haliscomenobacter的相對(duì)豐度在1、4、6、8、10和12月的污泥樣品中分別為22.9%、14.6%、8.3%、10.5%、13.0%和10.2%，屬于缺氧池內(nèi)不同月份污泥樣品的優(yōu)勢菌屬。作為絲狀菌的Haliscomenobacter使缺氧池污泥保持穩(wěn)定的絮體結(jié)構(gòu)并形成較大聚合體[14]。 根據(jù)以前的文獻(xiàn)報(bào)道[15-18]，Thauera、Dechloromonas和Sulfuritalea在缺氧或厭氧條件下具有反硝化的能力。由圖7可知，Thauera的相對(duì)豐度在1和4月在缺氧池內(nèi)是相近的而在6、8、10和12月穩(wěn)定在(3.3±0.3)%，Dechloromonas的相對(duì)豐度在1、4、6和8月有明顯的波動(dòng)而在10和12月穩(wěn)定在4.0%左右，Sulfuritalea的相對(duì)豐度在環(huán)境溫度相對(duì)較低的1和12月穩(wěn)定1.3%左右而在6、8、10和12月在0.4%和0.8%之間變化。Nitrospira作為一種具有亞硝酸鹽氧化能力的菌屬[19]，在1、4、6、8、10和12月所取的污泥樣品中相對(duì)豐度分別為0.9%、0.4%、0.4%、0.5%、0.3%和0.6%。CandidatusAccumulibacter是一種具有同步反硝化除磷功能的菌屬[20]。在1、4、6、8、10和12月所取的污泥樣品中Candidatusaccumulibacter的相對(duì)豐度在0.3%～1.6%之間變動(dòng)。不同菌屬的相對(duì)豐度變化結(jié)果表明，缺氧池內(nèi)的微生物豐度隨著環(huán)境溫度或進(jìn)水組分的變化而呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化。

圖7 在屬水平上缺氧池不同月份微生物群落的動(dòng)態(tài)變化Fig.7 Dynamic variations of microbial community in the anoxic tank under different months at the genus level

3 結(jié)論

(1)在8和10月缺氧池中微生物群落豐度較高，1月缺氧池污泥中微生物群落豐度較小。缺氧池微生物群落多樣性在12月較高，在6月微生物群落多樣性較小。

(2)不同月份缺氧池中共有分類操作單元(OTU)中占優(yōu)勢地位的門包括Proteobacteria(42.3%)、Bacteroidetes(21.0%)、Chloroflexi(6.5%)、Firmicutes(6.3%)、Actinobacteria(4.0%)和Planctomycetes(3.8%)，表明大部分微生物在一直存在于缺氧池。

(3)污泥樣品中微生物群落的主成分分析和主坐標(biāo)分析表明，8和10月缺氧池中微生物群落比較相似，但與1月污泥樣品中的微生物群落之間存在明顯的差異。

(4)在門、綱和屬水平上缺氧池內(nèi)微生物的種類和相對(duì)豐度在不同月份呈現(xiàn)明顯變化。

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