高苗苗，孫子健，張紀元，鄒正升

酒精性肝?。╝lcoholic liver disease,ALD）是長期大量飲酒或短期酗酒引起的肝損傷，最初表現(xiàn)為酒精性脂肪變性，進而發(fā)展為酒精性肝炎（alcoholic hepatitis,AH）、酒精性肝硬化（alcoholic cirrhosis,ALC），甚至肝細胞癌[1-3]。ALD的發(fā)病機制包括乙醇及其代謝產物的直接肝毒性，氧化應激損傷，腸源性內毒素激活Kupffer細胞以及免疫功能失調等[3-4]。近年來，大量研究表明，免疫反應在ALD的發(fā)生發(fā)展中有著重要作用，例如活化的Kupffer細胞產生肝保護性因子IL-6和抗炎因子IL-10；另一方面，Kupffer細胞激活產生大量

TNF-α等促炎因子，引起肝臟炎癥反應和損傷[5]。乙醇還可抑制NK細胞產生IFN-γ，削弱其抗纖維化功能[6]。單核樣髓系來源抑制細胞（monocytic myeloid derived suppressor cells,mMDSCs）作為髓系來源的抑制細胞的亞群，可通過精氨酸酶-1，活性氧類及ERK/IL-6/STAT3信號通路等多種途徑，在肝癌、乙型肝炎（乙肝）、丙型肝炎（丙肝）等多種肝病中發(fā)揮著免疫抑制作用[7-9]。本文通過檢測ALD患者外周血mMDSCs頻率及其精氨酸酶的表達水平，探討mMDSCs與ALD的關系。

1 對象與方法

1.1 對象 所有ALD研究對象均來自2016年7月—2017年7月就診于解放軍第三〇二醫(yī)院的患者。ALD患者79例（ALD組），其中輕癥酒精性肝炎（mild alcoholic hepatitis,MAH）患者11例、ALC患者68例，其中63例ALD患者檢測了其胞內精氨酸酶，包括MAH 9例，ALC 54例。另外入選23例健康人群作為健康對照（healthy control,HC）。入組患者均為男性。ALD患者診斷均符合《酒精性肝病診療指南》（2010年修訂版）的標準[1]。ALD臨床診斷標準：①有長期飲酒史，一般超過5年，折合乙醇量男性≥40 g/d，女性≥20 g/d，或2周內有大量飲酒史，折合乙醇量＞80 g/d；②臨床癥狀為非特異性，可無癥狀，或有右上腹脹痛、食欲不振、乏力、體質量減輕、黃疸等，隨著病情加重，可有神經(jīng)精神癥狀、蜘蛛痣、肝掌等表現(xiàn)；③AST、ALT、TBIL等指標升高，禁酒后這些指標可明顯下降，通常4周內基本恢復正常，AST/ALT＞2，有助于診斷；④肝臟B超或CT檢查有典型表現(xiàn)。⑤排除嗜肝病毒現(xiàn)癥感染以及藥物、中毒性肝損傷和自身免疫性肝病等。符合第1、2、3項和第5項或第1、2、4項和第5項可診斷ALD。符合ALD臨床診斷標準者，其臨床分型診斷如下。AH：血清ALT、AST或γ-谷氨酰轉肽酶升高，可有血清TBIL增高。ALC：有肝硬化的臨床表現(xiàn)和血清生物化學指標的改變，同時排除心、腦、腎和其他系統(tǒng)嚴重功能不全者及合并其他的嚴重疾病者。研究對象基本臨床資料見表1、2和3。

表1 HC、MAH、ALC 組年齡比較Table 1 Age comparison of group HC,MAH and ALC

表2 MAH、ALC組肝功能比較Table 2 Liver function comparison of MAH group and ALC group

1.2 試劑和儀器

1.2.1 試劑 所用試劑為：肝素鈉抗凝采血管、CD14-APC-Cy7、細胞破膜劑（美國BD公司），小鼠抗人CD11b-APC、CD33-PE、HLA-DR-BV421、CD15-PerCP（美國Biolegend公司），Arginase I-FITC、Mouse IgG2B-FITC Isotype Contro（l美國R&D公司）。

1.2.2 儀器 所用儀器為：臺式高性能低溫離心機（美國Thermo公司），供應臺式離心機LD5-2A（北京京立離心機有限公司），F(xiàn)ACS Verse型流式細胞儀（美國BD公司），低溫冰箱（日本SANYO公司），架盤天平（北京醫(yī)用天平廠），渦旋混合器（德國IKA公司）。

1.3 方法

1.3.1 Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs） 使用10 ml肝素鈉抗凝管采集新鮮的外周血，離心留存血漿后，用PBS稀釋至10 ml，加于4 ml淋巴細胞分離液上層（分2管），2500 r/min離心25 min。吸取白膜層于新的離心管中，PBS洗滌2遍去除殘留Ficoll液及血小板，得到高純度的PBMCs。

1.3.2 流式細胞檢測 ①將PBMCs計數(shù)后懸于PBS中。取106PBMCs于流式管中，并設立同型對照管。②加入CD11b、CD33、CD14、HLA-DR和CD15熒光抗體，震蕩混勻，室溫孵育20 min。③加1 ml PBS于流式管，震蕩混勻，1700 r/min離心4 min，棄上清。④加300 μl破膜劑于流式管，震蕩混勻，4 ℃避光孵育30 min。⑤PBS洗滌，步驟同③。⑥加精氨酸酶熒光抗體于檢測管，同型對照管加入精氨酸酶同型對照（Mouse IgG2BFITC Isotype Control），震蕩混勻，室溫孵育20 min。⑦PBS洗滌1次，同③。加200 μl 1%多聚甲醛固定，2～8 ℃避光保存。24 h內上機檢測。使用Flowjo軟件進行分析。

1.4 統(tǒng)計學處理 使用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。用GraphPad Prism 6（美國GraphPad軟件公司）進行統(tǒng)計學圖形繪制。定量資料呈正態(tài)分布者用±s表示，3組比較用單因素方差分析（組間方差齊），兩兩比較用q檢驗。定量資料為非正態(tài)分布者以中位數(shù)（最小值，最大值）表示，組間比較采用Mann-Whitney非參數(shù)秩和檢驗。相關性分析采用Spearman秩相關分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

表3 ALC組Child-Pugh各級臨床資料Table 3 Clinical data comparison of ALC patients according to Child-Pugh classification

2 結 果

2.1 典型圈門流式圖 首先圈定了所有細胞，而后選定Live/Dead陰性細胞，即所有活細胞。圈定CD11b和CD33雙陽性細胞為髓源性細胞，在此基礎上選定CD14陽性，HLA-DR陰性細胞為未成熟髓系單核細胞，進一步圈定CD15陰性（排除粒細胞樣髓系來源抑制細胞），CD14陽性為 mMDSCs（CD11b+CD33+HLA-DRCD14+CD15-），見圖 1。

圖1 mMDSCs圈門策略Figure 1 Gating strategy for mMDSCs

2.2 ALD患者外周血mMDSCs頻率變化 與HC組外周血mMDSCs頻率[以占CD11b+CD33+CD14+細胞（即單核細胞）比例計算，下同]相比，ALD患者外周血mMDSCs頻率顯著上升，見表4。進一步根據(jù)病情分組分析發(fā)現(xiàn)，ALC組mMDSCs頻率顯著高于HC組和MAH組，見表5。將ALC組根據(jù)Child-Pugh分級分組后發(fā)現(xiàn)，Child-Pugh C級mMDSCs頻率顯著高于Child-Pugh B級，與Child-Pugh A級無顯著差異，見表6。進一步分析了ALD患者外周血mMDSCs頻率與中性粒細胞/淋巴細胞比值（neutrophil to lymphocyte ratio,NLR）發(fā)現(xiàn)2者呈弱正相關，見圖2。

表4 HC、ALD組外周血mMDSCs頻率比較Table 4 Peripheral mMDSCs frequency comparison of HC group and ALD group

表5 HC、MAH 、ALC組外周血mMDSCs頻率比較Table 5 Peripheral mMDSCs frequency comparison of group HC,MAH and ALC

2.3 ALD患者外周血精氨酸酶陽性mMDSCs頻率變化 HC組與ALD患者體內均表達精氨酸酶，但ALD組mMDSCs胞內精氨酸酶表達量高于同型對照組（以平均熒光強度值表示），見圖3A。進一步統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，ALD組精氨酸酶陽性mMDSCs頻率顯著高于HC組，見表7。且MAH組精氨酸酶陽性mMDSCs頻率與ALC組精氨酸酶陽性mMDSCs頻率均顯著高于HC組，ALC組精氨酸酶陽性mMDSCs頻率高于MAH組，見表8。進行相關性分析發(fā)現(xiàn)，ALD患者外周血精氨酸酶陽性mMDSCs頻率與NLR呈弱正相關，見圖3B。

表6 ALC Child-Pugh分級各級外周血mMDSCs頻率比較Table 6 Peripheral mMDSCs frequency comparison of Child-Pugh classification in ALC

圖2 ALD患者外周血mMDSCs頻率與NLR相關性Figure 2 Correlation between peripheral mMDSCs frequency and NLR in ALD patients

3 討 論

在腫瘤、各種急慢性感染及創(chuàng)傷等多種疾病狀態(tài)下，髓系細胞成熟分化受阻，停留在未成熟分化階段，并獲得免疫抑制能力，稱之為髓源性免疫抑制細胞（myeloid derived suppressor cells,MDSCs）。根據(jù)其表面標志物的不同，分為mMDSC（CD11b+CD33+HLA-DR-CD14+CD15-）和 gMDSC（CD11b+CD33+HLA-DR-CD14-CD15+）兩群[10]。MDSCs可通過精氨酸酶、半胱氨酸、誘導型一氧化氮合酶，活性氧類及IL-6/STAT3信號通路等多種途徑發(fā)揮免疫抑制作用[7]。近年來多項研究表明，MDSCs在乙肝、丙肝、原發(fā)性膽汁性膽管炎、肝癌等多種肝疾病中發(fā)揮免疫抑制作用[8-15]，但其在ALD中的變化特點及與疾病進展的關系尚未見報道。因此，本研究初步觀察了ALD患者外周血mMDSCs的頻率變化及其與疾病進展的關系。

圖3 精氨酸酶陽性mMDSCs頻率及與NLR相關性A.HC與ALD組外周血mMDSCs胞內精氨酸表達量；B.ALD患者外周血精氨酸酶陽性mMDSCs頻率與NLR相關性Figure 3 Correlation between arginase+ mMDSC frequencies and NLR

表7 HC、ALD 組外周血精氨酸酶陽性mMDSCs頻率比較Table 7 Peripheral arginase+ mMDSCs frequency comparison of HC group and ALD group

表8 HC、MAH 、ALC組外周血精氨酸酶陽性mMDSCs頻率比較Table 8 Peripheral arginase+ mMDSCs frequency comparison of group HC,MAH and ALC

實驗結果顯示，隨著疾病進展，ALD患者外周血mMDSCs頻率進行性升高，表明mMDSCs可能在該病發(fā)生發(fā)展的過程中發(fā)揮作用。這與之前在肝癌[14]，乙肝[8]，丙肝[16]中的發(fā)現(xiàn)一致。Fang等[8]研究顯示，慢性乙肝患者mMDSCs頻率顯著升高，且與血漿HBsAg水平呈正比。HBsAg可通過ERKIL-6STAT3信號通路介導mMDSCs極化，極化的mMDSCs可抑制乙肝患者T細胞的活化。Ren等[16]在丙肝中的研究發(fā)現(xiàn)，丙肝患者MDSCs頻率顯著增高，并與HCV RNA呈正相關。HCV可通過產生活性氧誘導MDSCs抑制T細胞反應[9]。另有研究表明，HCV感染可誘導mMDSCs產生，并通過精氨酸酶途徑抑制NK細胞產生IFN-γ[12]。因此，為了闡釋mMDSCs在ALD的作用機制，我們進一步檢測了mMDSCs胞內的精氨酸酶表達量。與健康對照相比，ALD患者mMDSCs表達更多的精氨酸酶，且MAH組和ALC組精氨酸酶陽性mMDSCs均顯著高于HC組。但ALD患者mMDSCs是否通過精氨酸酶途徑發(fā)揮作用尚不清楚，須進一步檢測釋放到血漿的精氨酸酶濃度及其底物精氨酸的濃度，以及進行體外實驗驗證mMDSCs對ALD患者免疫細胞的抑制作用。

中性粒細胞增多和/或淋巴細胞減少為應對不良應激事件的生理應答，高NLR表示機體存在亞臨床炎癥[17]。NLR通常比較穩(wěn)定，有研究顯示，NLR增高表明機體免疫紊亂[18]。本文研究發(fā)現(xiàn)，ALD患者mMDSCs及精氨酸酶陽性的mMDSCs與NLR呈弱正相關，提示mMDSCs與機體的免疫狀態(tài)具有一定相關性。

總之，研究發(fā)現(xiàn)ALD患者外周血mMDSCs顯著增多，并與疾病進展密切相關。本研究從另一個新的角度闡明了免疫反應在ALD中可能的作用機制，也為進一步發(fā)現(xiàn)新的治療靶點提供了重要基礎。

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