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        單核樣髓系來源抑制細(xì)胞在酒精性肝病進(jìn)展中的特點研究

        2018-05-09 09:58:17高苗苗孫子健張紀(jì)元鄒正升
        傳染病信息 2018年2期
        關(guān)鍵詞:酒精性外周血陽性

        高苗苗,孫子健,張紀(jì)元,鄒正升

        酒精性肝?。╝lcoholic liver disease,ALD)是長期大量飲酒或短期酗酒引起的肝損傷,最初表現(xiàn)為酒精性脂肪變性,進(jìn)而發(fā)展為酒精性肝炎(alcoholic hepatitis,AH)、酒精性肝硬化(alcoholic cirrhosis,ALC),甚至肝細(xì)胞癌[1-3]。ALD的發(fā)病機(jī)制包括乙醇及其代謝產(chǎn)物的直接肝毒性,氧化應(yīng)激損傷,腸源性內(nèi)毒素激活Kupffer細(xì)胞以及免疫功能失調(diào)等[3-4]。近年來,大量研究表明,免疫反應(yīng)在ALD的發(fā)生發(fā)展中有著重要作用,例如活化的Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生肝保護(hù)性因子IL-6和抗炎因子IL-10;另一方面,Kupffer細(xì)胞激活產(chǎn)生大量

        TNF-α等促炎因子,引起肝臟炎癥反應(yīng)和損傷[5]。乙醇還可抑制NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ,削弱其抗纖維化功能[6]。單核樣髓系來源抑制細(xì)胞(monocytic myeloid derived suppressor cells,mMDSCs)作為髓系來源的抑制細(xì)胞的亞群,可通過精氨酸酶-1,活性氧類及ERK/IL-6/STAT3信號通路等多種途徑,在肝癌、乙型肝炎(乙肝)、丙型肝炎(丙肝)等多種肝病中發(fā)揮著免疫抑制作用[7-9]。本文通過檢測ALD患者外周血mMDSCs頻率及其精氨酸酶的表達(dá)水平,探討mMDSCs與ALD的關(guān)系。

        1 對象與方法

        1.1 對象 所有ALD研究對象均來自2016年7月—2017年7月就診于解放軍第三〇二醫(yī)院的患者。ALD患者79例(ALD組),其中輕癥酒精性肝炎(mild alcoholic hepatitis,MAH)患者11例、ALC患者68例,其中63例ALD患者檢測了其胞內(nèi)精氨酸酶,包括MAH 9例,ALC 54例。另外入選23例健康人群作為健康對照(healthy control,HC)。入組患者均為男性。ALD患者診斷均符合《酒精性肝病診療指南》(2010年修訂版)的標(biāo)準(zhǔn)[1]。ALD臨床診斷標(biāo)準(zhǔn):①有長期飲酒史,一般超過5年,折合乙醇量男性≥40 g/d,女性≥20 g/d,或2周內(nèi)有大量飲酒史,折合乙醇量>80 g/d;②臨床癥狀為非特異性,可無癥狀,或有右上腹脹痛、食欲不振、乏力、體質(zhì)量減輕、黃疸等,隨著病情加重,可有神經(jīng)精神癥狀、蜘蛛痣、肝掌等表現(xiàn);③AST、ALT、TBIL等指標(biāo)升高,禁酒后這些指標(biāo)可明顯下降,通常4周內(nèi)基本恢復(fù)正常,AST/ALT>2,有助于診斷;④肝臟B超或CT檢查有典型表現(xiàn)。⑤排除嗜肝病毒現(xiàn)癥感染以及藥物、中毒性肝損傷和自身免疫性肝病等。符合第1、2、3項和第5項或第1、2、4項和第5項可診斷ALD。符合ALD臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)者,其臨床分型診斷如下。AH:血清ALT、AST或γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶升高,可有血清TBIL增高。ALC:有肝硬化的臨床表現(xiàn)和血清生物化學(xué)指標(biāo)的改變,同時排除心、腦、腎和其他系統(tǒng)嚴(yán)重功能不全者及合并其他的嚴(yán)重疾病者。研究對象基本臨床資料見表1、2和3。

        表1 HC、MAH、ALC 組年齡比較Table 1 Age comparison of group HC,MAH and ALC

        表2 MAH、ALC組肝功能比較Table 2 Liver function comparison of MAH group and ALC group

        1.2 試劑和儀器

        1.2.1 試劑 所用試劑為:肝素鈉抗凝采血管、CD14-APC-Cy7、細(xì)胞破膜劑(美國BD公司),小鼠抗人CD11b-APC、CD33-PE、HLA-DR-BV421、CD15-PerCP(美國Biolegend公司),Arginase I-FITC、Mouse IgG2B-FITC Isotype Contro(l美國R&D公司)。

        1.2.2 儀器 所用儀器為:臺式高性能低溫離心機(jī)(美國Thermo公司),供應(yīng)臺式離心機(jī)LD5-2A(北京京立離心機(jī)有限公司),F(xiàn)ACS Verse型流式細(xì)胞儀(美國BD公司),低溫冰箱(日本SANYO公司),架盤天平(北京醫(yī)用天平廠),渦旋混合器(德國IKA公司)。

        1.3 方法

        1.3.1 Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs) 使用10 ml肝素鈉抗凝管采集新鮮的外周血,離心留存血漿后,用PBS稀釋至10 ml,加于4 ml淋巴細(xì)胞分離液上層(分2管),2500 r/min離心25 min。吸取白膜層于新的離心管中,PBS洗滌2遍去除殘留Ficoll液及血小板,得到高純度的PBMCs。

        1.3.2 流式細(xì)胞檢測 ①將PBMCs計數(shù)后懸于PBS中。取106PBMCs于流式管中,并設(shè)立同型對照管。②加入CD11b、CD33、CD14、HLA-DR和CD15熒光抗體,震蕩混勻,室溫孵育20 min。③加1 ml PBS于流式管,震蕩混勻,1700 r/min離心4 min,棄上清。④加300 μl破膜劑于流式管,震蕩混勻,4 ℃避光孵育30 min。⑤PBS洗滌,步驟同③。⑥加精氨酸酶熒光抗體于檢測管,同型對照管加入精氨酸酶同型對照(Mouse IgG2BFITC Isotype Control),震蕩混勻,室溫孵育20 min。⑦PBS洗滌1次,同③。加200 μl 1%多聚甲醛固定,2~8 ℃避光保存。24 h內(nèi)上機(jī)檢測。使用Flowjo軟件進(jìn)行分析。

        1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。用GraphPad Prism 6(美國GraphPad軟件公司)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)圖形繪制。定量資料呈正態(tài)分布者用±s表示,3組比較用單因素方差分析(組間方差齊),兩兩比較用q檢驗。定量資料為非正態(tài)分布者以中位數(shù)(最小值,最大值)表示,組間比較采用Mann-Whitney非參數(shù)秩和檢驗。相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        表3 ALC組Child-Pugh各級臨床資料Table 3 Clinical data comparison of ALC patients according to Child-Pugh classification

        2 結(jié) 果

        2.1 典型圈門流式圖 首先圈定了所有細(xì)胞,而后選定Live/Dead陰性細(xì)胞,即所有活細(xì)胞。圈定CD11b和CD33雙陽性細(xì)胞為髓源性細(xì)胞,在此基礎(chǔ)上選定CD14陽性,HLA-DR陰性細(xì)胞為未成熟髓系單核細(xì)胞,進(jìn)一步圈定CD15陰性(排除粒細(xì)胞樣髓系來源抑制細(xì)胞),CD14陽性為 mMDSCs(CD11b+CD33+HLA-DRCD14+CD15-),見圖 1。

        圖1 mMDSCs圈門策略Figure 1 Gating strategy for mMDSCs

        2.2 ALD患者外周血mMDSCs頻率變化 與HC組外周血mMDSCs頻率[以占CD11b+CD33+CD14+細(xì)胞(即單核細(xì)胞)比例計算,下同]相比,ALD患者外周血mMDSCs頻率顯著上升,見表4。進(jìn)一步根據(jù)病情分組分析發(fā)現(xiàn),ALC組mMDSCs頻率顯著高于HC組和MAH組,見表5。將ALC組根據(jù)Child-Pugh分級分組后發(fā)現(xiàn),Child-Pugh C級mMDSCs頻率顯著高于Child-Pugh B級,與Child-Pugh A級無顯著差異,見表6。進(jìn)一步分析了ALD患者外周血mMDSCs頻率與中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值(neutrophil to lymphocyte ratio,NLR)發(fā)現(xiàn)2者呈弱正相關(guān),見圖2。

        表4 HC、ALD組外周血mMDSCs頻率比較Table 4 Peripheral mMDSCs frequency comparison of HC group and ALD group

        表5 HC、MAH 、ALC組外周血mMDSCs頻率比較Table 5 Peripheral mMDSCs frequency comparison of group HC,MAH and ALC

        2.3 ALD患者外周血精氨酸酶陽性mMDSCs頻率變化 HC組與ALD患者體內(nèi)均表達(dá)精氨酸酶,但ALD組mMDSCs胞內(nèi)精氨酸酶表達(dá)量高于同型對照組(以平均熒光強度值表示),見圖3A。進(jìn)一步統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn),ALD組精氨酸酶陽性mMDSCs頻率顯著高于HC組,見表7。且MAH組精氨酸酶陽性mMDSCs頻率與ALC組精氨酸酶陽性mMDSCs頻率均顯著高于HC組,ALC組精氨酸酶陽性mMDSCs頻率高于MAH組,見表8。進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),ALD患者外周血精氨酸酶陽性mMDSCs頻率與NLR呈弱正相關(guān),見圖3B。

        表6 ALC Child-Pugh分級各級外周血mMDSCs頻率比較Table 6 Peripheral mMDSCs frequency comparison of Child-Pugh classification in ALC

        圖2 ALD患者外周血mMDSCs頻率與NLR相關(guān)性Figure 2 Correlation between peripheral mMDSCs frequency and NLR in ALD patients

        3 討 論

        在腫瘤、各種急慢性感染及創(chuàng)傷等多種疾病狀態(tài)下,髓系細(xì)胞成熟分化受阻,停留在未成熟分化階段,并獲得免疫抑制能力,稱之為髓源性免疫抑制細(xì)胞(myeloid derived suppressor cells,MDSCs)。根據(jù)其表面標(biāo)志物的不同,分為mMDSC(CD11b+CD33+HLA-DR-CD14+CD15-)和 gMDSC(CD11b+CD33+HLA-DR-CD14-CD15+)兩群[10]。MDSCs可通過精氨酸酶、半胱氨酸、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶,活性氧類及IL-6/STAT3信號通路等多種途徑發(fā)揮免疫抑制作用[7]。近年來多項研究表明,MDSCs在乙肝、丙肝、原發(fā)性膽汁性膽管炎、肝癌等多種肝疾病中發(fā)揮免疫抑制作用[8-15],但其在ALD中的變化特點及與疾病進(jìn)展的關(guān)系尚未見報道。因此,本研究初步觀察了ALD患者外周血mMDSCs的頻率變化及其與疾病進(jìn)展的關(guān)系。

        圖3 精氨酸酶陽性mMDSCs頻率及與NLR相關(guān)性A.HC與ALD組外周血mMDSCs胞內(nèi)精氨酸表達(dá)量;B.ALD患者外周血精氨酸酶陽性mMDSCs頻率與NLR相關(guān)性Figure 3 Correlation between arginase+ mMDSC frequencies and NLR

        表7 HC、ALD 組外周血精氨酸酶陽性mMDSCs頻率比較Table 7 Peripheral arginase+ mMDSCs frequency comparison of HC group and ALD group

        表8 HC、MAH 、ALC組外周血精氨酸酶陽性mMDSCs頻率比較Table 8 Peripheral arginase+ mMDSCs frequency comparison of group HC,MAH and ALC

        實驗結(jié)果顯示,隨著疾病進(jìn)展,ALD患者外周血mMDSCs頻率進(jìn)行性升高,表明mMDSCs可能在該病發(fā)生發(fā)展的過程中發(fā)揮作用。這與之前在肝癌[14],乙肝[8],丙肝[16]中的發(fā)現(xiàn)一致。Fang等[8]研究顯示,慢性乙肝患者mMDSCs頻率顯著升高,且與血漿HBsAg水平呈正比。HBsAg可通過ERKIL-6STAT3信號通路介導(dǎo)mMDSCs極化,極化的mMDSCs可抑制乙肝患者T細(xì)胞的活化。Ren等[16]在丙肝中的研究發(fā)現(xiàn),丙肝患者M(jìn)DSCs頻率顯著增高,并與HCV RNA呈正相關(guān)。HCV可通過產(chǎn)生活性氧誘導(dǎo)MDSCs抑制T細(xì)胞反應(yīng)[9]。另有研究表明,HCV感染可誘導(dǎo)mMDSCs產(chǎn)生,并通過精氨酸酶途徑抑制NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ[12]。因此,為了闡釋mMDSCs在ALD的作用機(jī)制,我們進(jìn)一步檢測了mMDSCs胞內(nèi)的精氨酸酶表達(dá)量。與健康對照相比,ALD患者mMDSCs表達(dá)更多的精氨酸酶,且MAH組和ALC組精氨酸酶陽性mMDSCs均顯著高于HC組。但ALD患者mMDSCs是否通過精氨酸酶途徑發(fā)揮作用尚不清楚,須進(jìn)一步檢測釋放到血漿的精氨酸酶濃度及其底物精氨酸的濃度,以及進(jìn)行體外實驗驗證mMDSCs對ALD患者免疫細(xì)胞的抑制作用。

        中性粒細(xì)胞增多和/或淋巴細(xì)胞減少為應(yīng)對不良應(yīng)激事件的生理應(yīng)答,高NLR表示機(jī)體存在亞臨床炎癥[17]。NLR通常比較穩(wěn)定,有研究顯示,NLR增高表明機(jī)體免疫紊亂[18]。本文研究發(fā)現(xiàn),ALD患者mMDSCs及精氨酸酶陽性的mMDSCs與NLR呈弱正相關(guān),提示mMDSCs與機(jī)體的免疫狀態(tài)具有一定相關(guān)性。

        總之,研究發(fā)現(xiàn)ALD患者外周血mMDSCs顯著增多,并與疾病進(jìn)展密切相關(guān)。本研究從另一個新的角度闡明了免疫反應(yīng)在ALD中可能的作用機(jī)制,也為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新的治療靶點提供了重要基礎(chǔ)。

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