徐文娟，郭夢蘭，王冠璐，聶麟懿，丁港，李志鵬，孫琳，張鈞惠，楊晨棟

1.濱州醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，山東 煙臺 264003；2.煙臺中醫(yī)醫(yī)院腦病科，山東 煙臺 264000

血管性癡呆(Vascular dementia，VD)是指由缺血性卒中和出血性卒中造成記憶、認知和行為等腦區(qū)低灌注的腦血管疾病所致的嚴重認知功能障礙綜合征[1]。隨著人口老齡化及腦血管疾病發(fā)病率的升高，卒中后VD的發(fā)病率逐年上升[2]。目前已明確VD的發(fā)生發(fā)展機制主要和慢性缺血導(dǎo)致的神經(jīng)元、腦白質(zhì)損傷、能量代謝障礙、突觸傳遞功能異常等有關(guān)[3]，其中在對VD的發(fā)病機理研究中氧化應(yīng)激損傷越來越引起人們的關(guān)注，而核因子E2相關(guān)因子2(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)信號通路和NADPH氧化酶(NADPH oxidase)中的犬尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1(NOX1)在慢性腦缺血誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激中發(fā)揮著相當重要的作用[4]。

近年來，中醫(yī)藥防治VD取得了部分進展，具有一定的潛力和優(yōu)勢，其主要方法有活血化瘀法，如血栓通、黃芪、川芎嗪、丹參、參附注射液、銀杏葉提取物等，以及復(fù)方益智湯、補腎逐瘀湯、醒腦膠囊等從不同途徑發(fā)揮益智作用，改善患者的學(xué)習(xí)記憶能力[5]。因此本研究以雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎(Bilateral common carotid artery occlusion，2VO)致慢性腦低灌注大鼠VD模型為研究對象，運用健脾化痰、開竅益腎治法，研究自擬健脾益腎愈呆方對VD記憶學(xué)習(xí)能力改善作用及其作用機制，為進一步完善中醫(yī)藥治療VD提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠60只，體質(zhì)量230～270 g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，合格證號：SYXK(魯)20130020；動物生產(chǎn)批號：37009200006098。試驗期間大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，自由進食進水，日光照射，飼養(yǎng)于濱州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，SPF級實驗室。

1.2 儀器和試劑 MT-200 Morris水迷宮檢測儀器(成都泰盟科技有限公司)；Tecan Infinite F200/M200型多功能酶標儀(瑞士Tecan公司)；低溫離心機(美國Thermo公司)；徠卡顯微鏡(德國 Leica公司)；Rotor-Gene Q實時熒光定量PCR儀(德國QIAGEN公司)。超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醇(MDA)檢測試劑盒(南京建成和碧云天生物科技公司)，Trizol試劑盒(Gibco公司)，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒和RT-PCR引物(Thermo Fisher Scientific公司)。

1.3 模型制備 采用2VO法致大鼠慢性腦缺血損傷，構(gòu)建血管性癡呆大鼠模型，同時設(shè)立假手術(shù)組(Sham組)10只；術(shù)后21天采用Morris水迷宮實驗篩選血管性癡呆大鼠模型[6]，以假手術(shù)組大鼠逃避潛伏期平均值作參考值，計算造模組大鼠隱匿平臺逃避潛伏期平均值與參考值的差占比，差占比＞20%為成功VD大鼠模型。

1.4 動物分組與干預(yù) 將造模成功的39只大鼠隨機分為4組：模型組10只(Vehicle組)，灌胃給予生理鹽水；健脾益腎愈呆方高劑量組10只(高劑量組，YD-H組)，灌胃給予健脾益腎愈呆方9.8 g/(kg·d)；健脾益腎愈呆方低劑量組10只(低劑量組，YD-L組)，灌胃給予健脾益腎愈呆方4.9 g/(kg·d)；多奈哌齊組9只(DON組)，灌胃給予多奈哌齊(Donepezi)0.77 mg/(kg·d)。連續(xù)給藥4周后進行水迷宮學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)測試，然后處死動物提取相關(guān)組織進行其他指標的檢測。

中藥制備：健脾益腎愈呆方藥物組成：半夏、白豆蔻各9 g，茯苓20 g，人參、龍骨、菟絲子各10 g，石菖蒲、遠志、天冬、炙甘草各6 g，熟地黃15 g，龜板18 g，桑螵蛸12 g，陳皮8 g，藥材由煙臺市中醫(yī)醫(yī)院提供顆粒劑藥物，蒸餾水溶解，裝瓶密封，置4℃冰箱備用。

1.5 Morris水迷宮實驗 采用Morris水迷宮方法測試大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，將水池等分為四個象限，選第二象限正中放置直徑10 cm的平臺，沒入水下2 cm，水池外參照物保持固定，并且隔絕自然光，用迷宮中燈光照明。實驗包括隱蔽平臺實驗及空間探索實驗2部分：①隱蔽平臺實驗：每只大鼠每天訓(xùn)練4次，連續(xù)訓(xùn)練5天，記錄大鼠找到平臺的時間(潛伏期)，3次測得潛伏期均數(shù)作為當天的成績，進行統(tǒng)計分析；②空間探索實驗：隱蔽平臺實驗結(jié)束后，于第6天撤去平臺。記錄每只動物第1次到達平臺位置的時間(潛伏期)，以及60 s內(nèi)穿越平臺所在位置的次數(shù)，作為衡量其學(xué)習(xí)記憶能力的指標。

1.6 標本的采集及氧化應(yīng)激標志物檢測 腹腔注射麻醉大鼠，進行腹主動脈取血，立即于冰臺上快速斷頭處死，取腦組織，分離腦皮質(zhì)和海馬組織，稱重。將腦皮質(zhì)剪碎，置于勻漿器中，加生理鹽水，研磨勻漿，靜置，在4℃低溫離心機中4 000 r/min離心10 min，取上清液，按照試劑盒說明書測定腦中SOD、GSH-PX、MDA的含量。

1.7 病理組織形態(tài)學(xué)觀察 大腦標本經(jīng)固定、脫水、包埋、切片后進行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠腦皮層、海馬組織病理形態(tài)變化。

1.8 RT-PCR檢測腦組織中Nrf2、NOX1和血紅素加氧酶-1（Heme oxygenase-1，HO-1） mRNA的表達水平 取腦組織置液氮中研磨至粉末，轉(zhuǎn)入離心管中，加入1 mL Trizol，充分振蕩溶解，抽提總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。取 1 μL作為模板進行RT-PCR反應(yīng)。Nrf2上游引物5'-ATATACGCAGGAG AGGGAAG-3'，下游引物 5'-TCCCATCCTCATCACG TAAC-3'，片段長度 222 bp。NOX1上游引物 5'-GTGGCTTTGGTTCTCATGGT-3'，下游引物5'-TGAG GACTCCTGCAACTCCT-3'，片段長度224 bp。HO-1上游引物5'-GGGTCCTCACACTCAGTTTC-3'，下游引物5'-CCAGGCATCTCCTTCCATTC-3'，片段長度228 bp。GAPDH上游引物5'-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3'， 下 游 引 物 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，片段長度270 bp。RT-PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃，30 s；55℃，30 s；72℃，1 min(30 cycle)；72℃，10 min。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 所有資料數(shù)據(jù)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理。計量資料以(x±s)表示，計數(shù)資料用χ2檢驗，計量資料用方差分析或t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠逃避潛伏期時間比較 見表1。實驗第1天，各組大鼠的逃避潛伏期無統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)；實驗第2天至第5天，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的逃避潛伏期明顯延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，提示造模成功。與模型組比較，從第3天開始，YD-L組和DON組逃避潛伏期顯著縮短(P＜0.05)，YD-H組自第2天起其逃避潛伏期就明顯縮短(P＜0.01)。

表1 各組大鼠逃避潛伏期時間比較(x±s)s

2.2 各組大鼠空間記憶能力比較 見表2。在水迷宮實驗的第6天進行空間探索實驗，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠在目標象限停留時間百分比(即平臺所在象限停留時間與總時間的比值)顯著減少(P＜0.05)。與模型組比較，YD-H組和YD-L組大鼠在目標象限停留時間百分比均有所增加(P＜0.01)。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠在60 s內(nèi)穿越平臺所在位置的次數(shù)降低(P＜0.05)；與模型組比較，YD-H組、YD-L組和DON組大鼠在60 s內(nèi)穿越平臺所在位置的次數(shù)增加(P＜0.01)。

2.3 各組大鼠海馬組織CA1區(qū)形態(tài)學(xué)比較 見圖1。假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，排列致密整齊，胞漿清亮，胞核清晰，染色質(zhì)豐富。模型組大鼠神經(jīng)元細胞排列疏松紊亂、數(shù)量減少，形態(tài)不規(guī)則，呈梭形、多角形，胞核濃染固縮，部分細胞核仁不清或消失，細胞變性、壞死和脫落明顯。與模型組比較，健脾益腎愈呆方干預(yù)后(尤其是YD-H組)，上述形態(tài)學(xué)變化有所改善，大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列尚緊密均勻，細胞結(jié)構(gòu)較為完整，邊界較清晰，胞核飽滿，核固縮減少。

表2 各組大鼠空間記憶能力比較(x±s)

圖1 HE染色顯示大鼠海馬CA1區(qū)的形態(tài)學(xué)變化(×400)

2.4 各組大鼠腦組織氧化應(yīng)激標志物含量比較 見表3。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中SOD和GSH-PX含量降低，MDA含量升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較，YD-H組、YD-L組和DON組大鼠腦組織中SOD和GSH-PX含量明顯升高，MDA含量明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

表3 各組大鼠腦組織氧化應(yīng)激標志物含量比較(x±s)

2.5 各組大鼠腦組織Nrf2、NOX1和HO-1 mRNA的表達水平比較 見表4。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中Nrf2和HO-1 mRNA表達降低，NOX1 mRNA升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較，YD-H組、YD-L組和DON組大鼠腦組織中Nrf2和HO-1 mRNA表達明顯升高，NOX1 mRNA明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

3 討論

目前尚無防治VD的特效藥物或措施，臨床上常用改善腦循環(huán)藥物、腦細胞代謝復(fù)活劑、膽堿能藥物等。藥物治療只能相對減輕VD癥狀，延緩其進一步惡化[7]。

表4 各組大鼠腦組織Nrf2、NOX1和HO-1 mRNA的表達水平比較(x±s)

中醫(yī)古籍中沒有血管性癡呆的病名，相關(guān)描述散見于健忘、善忘、呆癥、癲狂等病證中。人至老年，臟腑功能減退，年高陰氣自半，肝腎陰虛或腎中精氣不足，不能生髓，髓海空虛，髓減腦消，而成癡呆，同時脾胃功能受到影響則會導(dǎo)致津液生成受阻，最終導(dǎo)致腦髓不能得到充養(yǎng)。因此本課題組認為癡呆，脾虛為本，痰濕內(nèi)盛為標，腎精虧虛，腦髓失養(yǎng)貫穿始終，當健脾化痰，開竅益腎。自擬方健脾益腎愈呆方，主要成分茯苓、人參、白術(shù)和菟絲子具有抗氧化、抗衰老和免疫調(diào)節(jié)等作用，熟地黃、石菖蒲能夠提高小鼠學(xué)習(xí)及記憶能力，龜板具有抗缺氧等作用。諸藥合用，有補脾益氣、宣竅化痰、滋陰補腎之效，同時具有改善微循環(huán)、清除自由基、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)及改善記憶力等作用。

認知障礙是VD的重要特征，因此本研究采用2VO的方法成功制備了VD大鼠模型，Morris水迷宮測試顯示VD模型組大鼠出現(xiàn)了明顯的空間學(xué)習(xí)記憶下降的現(xiàn)象。而經(jīng)過健脾益腎愈呆方干預(yù)后，可顯著改善VD大鼠的認知功能障礙。而且VD大鼠海馬組織CA1區(qū)形態(tài)學(xué)觀察中，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠神經(jīng)元細胞排列疏松紊亂、數(shù)量減少，形態(tài)不規(guī)則，細胞變性、壞死和脫落明顯；健脾益腎愈呆方干預(yù)后，上述形態(tài)學(xué)變化有所改善，大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列尚緊密均勻，細胞結(jié)構(gòu)較為完整，邊界較清晰，胞核飽滿，核固縮減少，與Morris水迷宮檢測結(jié)果相一致?？梢?，健脾益腎愈呆方可以減輕慢性腦低灌注誘導(dǎo)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元發(fā)生的損傷，進而改善大鼠空間認知功能障礙，提高VD學(xué)習(xí)記憶能力。

氧化應(yīng)激損傷在慢性腦低灌注誘導(dǎo)VD發(fā)生發(fā)展過程中有重要的影響。機體內(nèi)部ROS水平和抗氧化還原能力之間的平衡失調(diào)，導(dǎo)致與學(xué)習(xí)、記憶相關(guān)的海馬組織結(jié)構(gòu)和功能異常，引起認知障礙，最終致癡呆[8]。本研究中模型組大鼠腦組織中SOD和GSH-PX含量明顯降低，MDA含量明顯升高也證實這一影響。Nrf2屬于轉(zhuǎn)錄因子家族，是氧化應(yīng)激的主要調(diào)節(jié)因子。在生理條件下，Nrf2在胞漿中通過Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Keap1)起負調(diào)節(jié)作用，最終激活了ARE依賴的基因和抗氧化還原酶，主要有HO-1、NAD(P)H苯醌氧化還原酶、谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶等[9～10]，從而提高機體應(yīng)對氧化應(yīng)激的能力，產(chǎn)生神經(jīng)保護作用。研究表明Nrf2功能障礙是引起慢性腦缺血誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷的重要因素[11]。NOX酶是一種新發(fā)現(xiàn)的重要氧化劑來源，NOX家族在中樞神經(jīng)系主要存在的是NOX1、NOX2和NOX4。NOX來源的ROS可進一步使ROS產(chǎn)生增加，而過量的ROS將會導(dǎo)致氧化應(yīng)激，引起神經(jīng)元內(nèi)蛋白、脂質(zhì)和DNA的氧化損傷[12～13]。本研究中模型組大鼠腦組織中Nrf2和HO-1 mRNA表達降低，NOX1 mRNA升高，證明了Nrf2信號通路和NOX1在VD大鼠慢性腦低灌注誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激中發(fā)揮著重要的作用。

健脾益腎愈呆方干預(yù)后大鼠腦組織中SOD和GSH-PX含量明顯升高，MDA含量明顯降低，同時大鼠腦組織中Nrf2和HO-1 mRNA表達明顯升高，NOX1 mRNA明顯降低，說明健脾益腎愈呆方可能是通過激活Nrf2信號通路和下調(diào)氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白NOX1的表達，提高機體抗氧化能力和減少ROS的產(chǎn)生，減輕大鼠海馬神經(jīng)元損傷和氧化應(yīng)激，進而產(chǎn)生神經(jīng)保護作用。

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