姜 童，王 輝，陳 寧，付 翔，楊延杰，林 多

(青島農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，青島市園藝植物遺傳改良與育種重點實驗室，山東 青島 266109)

簇生椒(Capsicumanmuumvar .fasciculatum)為茄科辣椒屬辣椒的變種，因椒果均較小，又稱為小辣椒，是一種世界性蔬菜或調味品[1]。簇生椒在中國的種植面積逐漸擴大，在辣椒產(chǎn)業(yè)中占據(jù)重要地位。目前，山東魯西南地區(qū)簇生朝天椒栽培面積日益擴大，農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結構中占有重要地位，辣椒栽培品種混亂、定名混亂、雜交種同物異名、異物同名現(xiàn)象也逐漸顯現(xiàn)，嚴重干擾了辣椒種業(yè)的健康發(fā)展。加強種質資源主要農(nóng)藝性狀評價及保護新育品種知識產(chǎn)權是改良和推廣辣椒品種的關鍵，羅本釩[2]利用分子標記法與農(nóng)藝性狀評價法進行了小白菜遺傳多樣性分析及優(yōu)良性狀鑒定；秦倩等[3]利用SSR標記進行了油橄欖品種表型和品種多樣性的聚類分析；朱姝等[4]進行8個水稻抗條紋葉枯病分子標記有效性的驗證及評價。插入/缺失多態(tài)性(Insertion/deletion，InDel)標記是由于同一位點處的DNA序列在不同個體間發(fā)生了核苷酸片段的插入/缺失，根據(jù)目標位點兩側的序列設計特異引物進行PCR擴增，擴增片段的長度多態(tài)性即是InDel標記[5]，具有帶型簡單、密度高、變異穩(wěn)定、多態(tài)性強、檢測容易等特點。目前，InDel標記技術在番茄、水稻、玉米等作物的種質資源遺傳多樣性和親緣關系方面的研究領域已有報道[6-8]，但對于利用InDel標記進行辣椒品種相似度評價的研究尚未見報道。

本研究利用InDel分子標記對供試的8份商品名不同的簇生朝天椒進行農(nóng)藝性狀構建指紋圖譜來評價魯西南地區(qū)簇生朝天椒的品種相似度，對一些地方特有辣椒品種的保護及種子市場的規(guī)范具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料來自濟寧地區(qū)商品名不同的簇生朝天椒品種，共計8份，于2016年6月分別到各鄉(xiāng)鎮(zhèn)進行采樣編號(表1)，樣品-80 ℃保存，用于基因組DNA的提取。

表1 試驗材料Tab.1 Experimental materials

1.2 農(nóng)藝性狀評價方法

2016年6月和9月，采用常規(guī)方法對魯西南地區(qū)8個商品名不同的簇生朝天椒品種進行株高、果實個數(shù)、分枝數(shù)、單株簇數(shù)、平均每簇果數(shù)、葉色、鮮單果重等農(nóng)藝性狀指標進行調查；10月中旬烘干測定樣品干質量，并計算干鮮比，果實色價采用GB10783方法測定。

1.3 InDel分子標記評價方法

1.3.1 InDel引物篩選 辣椒基因組DNA提取、質量檢測、InDel-PCR擴增程序及聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測等參照姜童等[9]的方法進行。供試材料為8個植物學性狀差異較大的干制辣椒品種(表2)。引物參照Li等[10]開發(fā)的辣椒InDel引物，從12條染色體上共251對InDel引物中篩選出60對InDel引物(圖1)，引物由上海Sangon公司合成。

表2 用于InDel引物篩選的供試材料Tab.2 The tested materials for the screening of InDel primers

圖1 60對引物在辣椒染色體物理圖譜上的位置Fig.1 Location of 60 pairs primers on the physical map in pepper chromosome

1.3.2 指紋圖譜構建 選用篩選的25對InDel引物對8個不同商品名的辣椒品種進行擴增，統(tǒng)計擴增條帶數(shù)進行指紋圖譜構建。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

InDel標記的數(shù)據(jù)記錄用Microsoft Excel進行數(shù)據(jù)整理。根據(jù)電泳結果，擴增材料在同一引物中，位點較高的記1，位點較低重復出現(xiàn)的記0，條帶缺失記-。用SPSS 14.0軟件完成試驗統(tǒng)計和UPGMA聚類分析。

2 結果與分析

2.1 簇生朝天椒農(nóng)藝性狀評價

簇生朝天椒植株農(nóng)藝性狀比較結果顯示(表3)，8個品種株高均在79.1～96.4 cm，抗倒伏性較好；分枝數(shù)集中在4～5簇；單株簇數(shù)最多的品種為SYJ-5，株型緊湊，單株簇數(shù)較少的品種為SYJ-6。從平均每簇果數(shù)調查來看，8個品種的平均單簇果個數(shù)為5個左右；葉色較突出的品種為SYJ-2、SYJ-3、SYJ-6、SYJ-8，表現(xiàn)為深綠色，其他品種均為正常綠色。

簇生朝天椒品種果實性狀比較結果顯示(表4)，8個品種果長為5.75～6.12 cm，SYJ-2和SYJ-5的果長存在顯著差異，各品種辣椒果寬為1.36～1.43 cm，8個品種的果寬差異不顯著。SYJ-2、SYJ-6的折合干椒產(chǎn)量分別為5 248.50，5 165.10 kg/hm2，且均顯著高于其他品種(4 412.85～5 038.20 kg/hm2)。

表3 八個朝天椒品種植株農(nóng)藝性狀比較Tab.3 The comparison of agronomic traits among eight clustered pepper varieties

表4 八個朝天椒品種果實性狀比較Tab.4 The comparison of fruit traits among eight clustered pepper varieties

2.2 InDel分子標記評價

2.2.1 InDel 引物篩選 試驗中通過60對InDel引物在生物學性狀差異較大、親緣關系較遠的8份材料進行PCR擴增，并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，結果表明，其中25 對引物具有多態(tài)性(表5)，部分引物的篩選結果如圖2所示，引物CIDH908、CIDH426有多態(tài)性擴增，所有材料均能擴增出清晰的條帶且多態(tài)性好，穩(wěn)定性高；本試驗所用引物為以上步驟篩選出的25對具有多態(tài)性的InDel引物生物學性狀差異較小、遺傳背景較窄的8個不同商品名的簇生朝天椒進行指紋圖譜構建。

2.2.2 指紋圖譜構建 本試驗用25對具有多態(tài)性的引物在8個不同商品名的簇生朝天椒材料檢測的部分引物擴增圖譜如圖3，4所示。這25 對InDel引物在8份簇生辣椒材料中共擴增出 160個位點，擴增片段大小在 130～350 bp。只有引物CIDH267在本研究中8份簇生辣椒材料產(chǎn)生不同的位點，擴增片段大小在180～200 bp(圖3)，其中，24對InDel引物擴增檢測中無位點差異，部分引物擴增圖譜見圖4。采用25對InDel引物對8個辣椒品種構建指紋圖譜(表6)，通過指紋圖譜看出，只有SYJ-2和SYJ-6在引物CIDH267中與其他6個辣椒品種存在1個位點差異。參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準-玉米、水稻品種鑒定-DNA指紋方法判定標準(NY/T1433-2007)，結果表明，這8個不同商品名的簇生朝天椒為疑似同種。

表5 InDel標記信息Tab.5 The information of InDel marker primers

1～8.生物學性狀差異較大、親緣關系較遠的8份材料。1-8.The variety of biological properties of the larger differences and distant relationship between the eight materials.

M.Marker；1～8依次是朝天椒品種SYJ-1～SYJ-8。圖4同。M.Marker；1-8 is the variety of the clustered pepperSYJ-1-SYJ-8. The same as Fig.4.

Ⅰ.CIDH28；Ⅱ.CIDH776；Ⅲ.CIDH602；Ⅳ.CIDH360。

2.2.3 八個簇生朝天椒品種相似度評價 選取株高、分枝數(shù)、單株簇數(shù)、平均每簇果數(shù)、果長、果肩徑、單鮮果重、單干果重、色價等級作為評價指標做數(shù)據(jù)均一化處理，利用SPSS 14.0軟件處理系統(tǒng)進行表型性狀UPGMA聚類分析(圖5)，在遺傳相似系數(shù)為0.78時聚為一個大類，包含8個品種；當遺傳相似系數(shù)為0.58時聚為3類，第一類包含4個品種(SYJ-1、 SYJ-3 、SYJ-4、 SYJ-7 )，第二類包含3個品種(SYJ-2、SYJ-6、SYJ-8)，第三類只有品種SYJ-5；當遺傳相似系數(shù)為0.4時聚為5類，第一類包含3個品種(SYJ-1、 SYJ-3 、SYJ-4)，第二類為品種SYJ-7，第三類為品種SYJ-2和SYJ-6，第四類為品種SYJ-8，第五類只有品種SYJ-5；當遺傳相似系數(shù)為0.17時聚為6類，第一類為品種SYJ-1，第二類包含品種SYJ-3和SYJ-4，第三類為品種SYJ-7，第四類包含品種SYJ-2和SYJ-6，第五類為品種SYJ-8，第六類只有品種SYJ-5。表明該8個不同商品名辣椒品種形態(tài)相似程度大，親緣關系相對較近，品種相似度較高。

表6 簇生朝天椒品種InDel指紋圖譜Tab.6 The digital fingerprints of InDel markers on clustered pepper

圖5 簇生朝天椒農(nóng)藝性狀UPGMA聚類分析Fig.5 UPGMA method cluster analysis for eight clustered pepper varieties based on agronomic traits

3 討論與結論

隨著辣椒栽培面積的不斷擴大，品種的種類也不斷更新，遺傳基礎變得越來越狹窄，以形態(tài)形狀區(qū)分難度大，新品種的新穎性和特異性鑒定缺少憑據(jù)，種子領域現(xiàn)狀也存在同物異名問題，給種子市場管理提出了挑戰(zhàn)。張寶璽等[11]在“十一五”期間提出，辣椒品種的同質化嚴重，盡管培育的品種很多，而且市場上的辣椒品種性狀相近、同物異名的現(xiàn)象屢見不鮮。目前，同質化或相似度評價方法主要有品種特性鑒定和分子標記鑒定，品種特性鑒定是法定的品種鑒定方法，具有準確性、科學性、能更直觀地揭示品種間的來源差異等優(yōu)點，但也存在工作量大、成本高、時間長、結果滯后等問題。而DNA指紋圖譜技術則具有高效、準確、不受環(huán)境條件影響、實驗操作簡單、能夠量化地體現(xiàn)出品種間的差異等優(yōu)點。因此，將這2種方法結合起來進行分析，可以相互驗證、相互補充，更能充分地揭示出地方品種(品系)的相似度及親緣關系。

利用品種特性與分子標記進行植物不同物種間親緣關系分析研究已被廣泛應用。包文泉等[12]基于SSR標記的仁用杏主栽品種鑒別和指紋圖譜構建；王慶彪等[13]對中國50個甘藍代表品種進行EST-SSR指紋圖譜的構建；張婉等[14]對白菜品種進行SSR指紋圖譜數(shù)據(jù)庫的構建。通過構建InDel 指紋圖譜從分子層面上更精確、清晰地對品種相似性進行比較和研究。周延清等[15]對河南栽培大豆的RAPD品種鑒定和聚類分析；宋小麗[16]進行了親緣關系密切的12個辣椒品種的 AFLP鑒定；王明明等[17]進行了木瓜屬品種親緣關系的SRAP分析。隨著近年來測序技術的不斷進步，分子標記InDel技術自產(chǎn)生以來，因有帶型簡單、密度高、變異穩(wěn)定、多態(tài)性強、檢測容易等優(yōu)點在植物指紋構建及種質資源遺傳多樣性的鑒定和分類研究得到廣泛的應用。Wang等[18]基于InDel和SSR序列遺傳連鎖圖譜進行蕪菁擬染色體匯編；梁爽[19]利用InDel和SSR整合大白菜分子遺傳圖譜；胡俏強等[20]進行了糯玉米雜交種純度InDel分子標記鑒定與田間鑒定的相關性分析，結果顯示，InDel標記鑒定結果與田間鑒定結果呈極顯著正相關，可用于糯玉米雜交種純度鑒定。而分子標記InDel在辣椒親緣關系分析和品種相似度分析方面用的不是很廣泛，利用品種特性與構建InDel指紋圖譜結合對品種相似性進行比較和研究未見相關的報道。

本研究對8個不同商品名的簇生朝天椒品種進行基本農(nóng)藝性狀調查，基于表型數(shù)據(jù)(簇生朝天椒農(nóng)藝現(xiàn)狀UPGMA聚類分析) 與InDel分子標記(簇生朝天椒進行指紋圖譜構建)相結合進行了生物學性狀差異較小、遺傳背景較窄的不同商品名的8個簇生朝天椒的親緣關系及品種相似度分析，表明該8個不同商品名辣椒品種相似程度較大，同質化嚴重且存在同物異名現(xiàn)象。本研究結合 InDel分子標記構建指紋圖譜數(shù)據(jù)與農(nóng)藝性狀數(shù)據(jù)的遺傳相似系數(shù)矩陣存在極顯著正相關，這與Lefebvre等[21]結果相似。由此認為，本研究擴增的InDel DNA片段散布于整個辣椒基因組中，并與本試驗的表型性狀QTR有很高的關聯(lián)性。因此，結合簇生朝天椒農(nóng)藝性狀與綜合利用InDel分子標記分析，能更準確鑒定、評價魯西南地區(qū)簇生朝天椒品種的相似度，對地方辣椒品種的品質及品種保護具有一定的利用價值，有效地緩解了辣椒栽培品種混亂、定名混亂、種子同質化的現(xiàn)象，有利于種子市場的規(guī)范和種業(yè)的健康發(fā)展。

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