張子義，趙 陽，梁紅勝，樊明壽

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是茄科多年生的草本植物，它的塊莖可供食用，是僅次于小麥、水稻和玉米的第四大重要糧食作物。內(nèi)蒙古是我國馬鈴薯的主產(chǎn)區(qū)之一，馬鈴薯產(chǎn)業(yè)已經(jīng)成為內(nèi)蒙古地區(qū)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)。馬鈴薯是喜鉀作物，它對(duì)鉀素的吸收量大于氮和磷，且鉀素直接影響馬鈴薯的產(chǎn)量和質(zhì)量[1-3]。K+是植物體內(nèi)最為豐富的無機(jī)一價(jià)陽離子，可以參與植物的多種生理生化過程[4]。鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要包括 KUP/HAK/KT 家族、HKT/Trk家族、CHX 家族和 KEA 家族。而其中的 KUP/HAK/KT家族是在生物界內(nèi)最早被發(fā)現(xiàn)的，它不僅數(shù)目最多而且功能最豐富，它的主要作用是介導(dǎo)植物中鉀離子等元素的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)和根部生長素的運(yùn)輸[5-7]。目前，已在擬南芥、水稻、大麥、桃樹中分別預(yù)測得到13，27，5，17個(gè) KUP/HAK/KT鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體[8-11]。

研究不同鉀素濃度下馬鈴薯鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體KUP6和KUP7基因表達(dá)量的不同，并分析它們之間的關(guān)系，以及不同鉀濃度對(duì)馬鈴薯幼苗鉀素含量的影響，從而探索馬鈴薯生長的適宜鉀濃度，對(duì)提高馬鈴薯產(chǎn)量和提高鉀素的利用效率具有十分重要的意義。

1 材料和方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)材料為脫毒馬鈴薯費(fèi)烏瑞它組培苗，由內(nèi)蒙古正豐馬鈴薯種業(yè)股份有限公司提供。試劑為柱式植物總RNA抽提純化試劑盒，購自上海生工生物有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒購自寶生物工程有限公司。水培試劑購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

馬鈴薯組培苗置于 20 ℃，18 h 光照(光照強(qiáng)度9 000 lx)/6 h 黑暗條件下培養(yǎng)。水培營養(yǎng)液參照Hongland營養(yǎng)液，其中，4個(gè)鉀素濃度(K2SO4)處理見表1，隨機(jī)排列，4次重復(fù)。

表1 不同濃度的鉀處理Tab.1 Treatment with different concentrations of potassium

1.3 總RNA提取及cDNA反轉(zhuǎn)錄

在培養(yǎng)組培苗30 d時(shí)，隨機(jī)選取不同處理的馬鈴薯幼苗，剪取葉片之前將剪刀浸入液氮處理，剪取的葉片放入事先做好標(biāo)記的塑料袋中并放入液氮中保存。將取好的葉片放入研缽中進(jìn)行充分研磨，使葉片磨成粉末，整個(gè)研磨過程中要及時(shí)加入液氮，防止葉片融化。采用柱式植物總RNA抽提純化試劑盒提取馬鈴薯葉片總RNA。用超微量紫外可見分光光度計(jì)Q500對(duì)RNA進(jìn)行濃度測定，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 質(zhì)量。選用TaKaRa公司生產(chǎn)的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA的第一鏈。

1.4 基因表達(dá)分析

使用SYBR Green I 熒光染料法，在LightCycler480( Roche Diagnostics) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上對(duì)馬鈴薯幼苗轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平進(jìn)行分析。根據(jù) SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，每個(gè)反應(yīng)3次重復(fù)。反應(yīng)體系中含有 10 μL SYBR Premix Ex TaqTM，引物各1 μL(5 μmol/L)，稀釋的 cDNA 模板5 μL，滅菌水3 μL，總體系 20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃ 預(yù)變性30 s；95 ℃ 變性 5 s，60 ℃ 退火 15 s，72 ℃ 延伸 30 s，40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后做溶解曲線分析，用2-ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)。

1.5 測定項(xiàng)目及方法

分別在馬鈴薯幼苗種植后的10，20，30 d進(jìn)行取樣，選取具有代表性的3株，運(yùn)用鉬銻抗比色法[12]測定馬鈴薯幼苗根、莖、葉中鉀的含量。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS軟件進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA的提取

用試劑盒成功提取RNA后，由于實(shí)時(shí)熒光定量PCR需要高品質(zhì)的RNA，所以需要對(duì)提取物先進(jìn)行分析。由圖1可知，較亮的帶為28S RNA，下面較暗的帶是18S RNA，28S帶的亮度大概是18S帶的2倍，而5S RNA帶則不明顯。所以，RNA未降解，可以用作后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 馬鈴薯RNA 電泳結(jié)果Fig.1 The result of agar gel electrophoresis of potato

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果分析

首先查詢擬南芥中KUP6和KUP7基因表達(dá)的蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)，再從馬鈴薯中查找到與其一級(jí)結(jié)構(gòu)最相似的蛋白，然后查看其基因序列，最后利用Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)最適引物。熒光定量 PCR 所用引物見表2。

表2 引物序列 Tab. 2 Primer sequence

通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測了KUP6和KUP7基因表達(dá)水平，結(jié)果見圖2,與鉀離子濃度0.01 mmol/L相比，當(dāng)鉀離子濃度為0.10 mmol/L其基因表達(dá)量增加不明顯；當(dāng)鉀離子濃度為1.00 mmol/L時(shí)，KUP6和KUP7基因表達(dá)量最高，且與其他處理之間都具有顯著差異，分別為LA處理的2.82，2.28倍；而鉀離子濃度為10.00 mmol/L時(shí)，與處理LA 和L 具有顯著差異，KUP6和KUP7基因表達(dá)量分別為LA的1.68，1.86倍，說明過高或較低的鉀離子濃度都不利于KUP6和KUP7基因的表達(dá)。

a、b、c.表示在0.05水平上顯著。圖3-5同。a,b,c.Correlation is significant at the 0.05 level.The same as Fig.3-5.

2.3 鉀素在根、莖、葉中的含量

從圖3可以看出，在各個(gè)階段H和M處理之間根系的鉀素含量變化為30.2～32.5 g/kg，且在不同階段兩處理之間均無顯著差異，說明M處理根系中鉀素已經(jīng)達(dá)到了飽和。在水培后20 d內(nèi)，培養(yǎng)液鉀素含量在0.01～1.00 mmol/L時(shí)，隨著培養(yǎng)液鉀素濃度的增加，根系鉀素含量增加。在水培第10天，LA、L和M處理根系鉀素濃度分別為1.5，24.9，32.5 g/kg；在水培第20天，LA、L和M處理根系鉀素濃度分別為2.0，9.6，31.0 g/kg，且處理LA、L和M之間均具有顯著差異。在水培30 d時(shí)，M處理和H處理與LA和L處理有顯著差異，但L和LA處理之間沒有顯著變化。L處理鉀素含量隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加呈下降的趨勢。

圖3 不同處理下根系鉀素的含量Fig.3 The potassium content in potato roots

馬鈴薯莖中鉀素含量隨著培養(yǎng)液鉀素濃度的增加而增加(圖4)，在水培后第20天內(nèi)，處理H和M之間沒有差異，但其與LA和L之間有顯著差異，且L與LA之間也有顯著差異。在水培第10天，LA、L和M處理中莖鉀素濃度分別為2.0 ，26.3，37.1 g/kg；在水培第20天，LA、L和M處理中莖鉀素濃度分別為13.2 ，24.0，58.3 g/kg；在水培第30天時(shí)，處理LA和L與M和H之間有顯著差異，但在數(shù)值上差距倍數(shù)縮小，說明處理LA和L 在生長過程中累積了鉀素，并維持了一定的鉀素濃度；H處理的鉀素含量達(dá)65.1 g/kg，與其他處理之間均具有顯著差異，且隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加LA和H處理鉀素莖內(nèi)含量呈上升趨勢。

圖4 不同濃度處理下莖中鉀素的含量Fig.4 The potassium content in potato stems

馬鈴薯葉中鉀素含量也隨著培養(yǎng)液鉀素濃度的增加而增加(圖5)，在試驗(yàn)第10天，4個(gè)處理之間均具有顯著差異，LA、L、M和H處理的鉀素濃度分別為4.2，18.6，26.2，32.4 g/kg，說明水培10 d所測試的葉片鉀素濃度與水培的鉀素濃度呈一定的正相關(guān)性。在水培試驗(yàn)20 d時(shí)，L處理與LA處理之間無顯著差異，H處理與M處理也沒有顯著差異，但M和H處理與LA和L之間具有顯著差異。水培試驗(yàn)第30天，H處理鉀素濃度達(dá)到46.0 g/kg，與其他處理之間有顯著差異；M處理鉀素濃度為32.9 g/kg，與LA和L均具有顯著差異，LA和L之間無顯著差異。

圖5 不同濃度處理下葉中鉀素的含量Fig.5 The potassium content in potato leaves

3 結(jié)論與討論

植物細(xì)胞有2種機(jī)制來介導(dǎo)鉀離子的跨膜吸收，它們分別是鉀離子通道蛋白介導(dǎo)的低親和性鉀吸收系統(tǒng)和鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的高親和性鉀吸收系統(tǒng)。當(dāng)細(xì)胞外鉀離子濃度高時(shí)，低親和性鉀轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)發(fā)揮作用，這種吸收主要是由離子通道蛋白調(diào)節(jié)的被動(dòng)運(yùn)輸?shù)倪^程；當(dāng)細(xì)胞外的鉀離子濃度低時(shí)，高親和性鉀轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)起主要作用。雖然對(duì)于多數(shù)植物來說，它們吸收鉀離子主要依賴于低親和性的鉀轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，但是高親和性鉀轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)也在植物生長發(fā)育中發(fā)揮了不可替代的作用，尤其是在外界存在低鉀脅迫時(shí)，它能夠讓植物更好地生存。而且鉀離子通道蛋白和鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體并不是只能在一種機(jī)制中起作用，鉀離子通道蛋白可以在高親和性鉀吸收系統(tǒng)中起作用，鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體也可以在低親和性鉀吸收系統(tǒng)中起作用[13-15]。

已有的研究結(jié)果表明，KUP/HAK/KT家族是植物中一類非常重要的鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白，它們在鉀離子高親和性吸收系統(tǒng)中起作用，也就是在外界鉀離子濃度過低時(shí)介導(dǎo)植物鉀離子的吸收。而植物中的鉀離子通道蛋白和鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體往往是通過轉(zhuǎn)錄水平的變化或翻譯后蛋白的修飾來參與植物對(duì)低鉀脅迫的響應(yīng)[16-18]。

本試驗(yàn)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測了不同鉀素濃度下KUP6和KUP7轉(zhuǎn)錄水平基因表達(dá)量的變化，結(jié)果顯示，低鉀處理后KUP6和KUP7的表達(dá)水平都沒有發(fā)生很顯著的變化；在鉀素濃度為1.00 mmol/L時(shí)，KUP6和KUP7的表達(dá)水平都上升明顯；高鉀處理后KUP6和KUP7的表達(dá)水平都上升但其上升的幅度減小了。而葉片中的鉀素含量隨著培養(yǎng)液鉀素濃度的增大呈遞增的趨勢。以上試驗(yàn)結(jié)果說明，鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體KUP6和KUP7不僅是通過轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控來參與馬鈴薯對(duì)鉀素的響應(yīng)，很可能是由翻譯后蛋白的修飾來響應(yīng)鉀素脅迫的，由于目前人們對(duì)于此類鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白生理功能的研究還非常有限[19-20]，所以，還有很大的研究空間，希望本研究對(duì)馬鈴薯生長發(fā)育中合理分配鉀素資源以及對(duì)鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體KUP6和KUP7的分子機(jī)制的后續(xù)研究有所幫助。

參考文獻(xiàn)：

[2] 高 媛，韋艷萍，樊明壽. 馬鈴薯的養(yǎng)分需求[J]. 中國馬鈴薯，2011，25(3)：182-187.

[3] Ngomat M S, Mworia M. Evaluation of the effects of potassium fertilizer on potato growth and yield in Saboti Sub County, Trans Nzoia County, Kenya[J]. International Journal of Academic Research in Environment & Geography, 2017, 4 (1): 33-40.

[4] Ma T L，Wu W H，Wang Y. Transcriptome analysis of rice root responses to potassium deficiency[J]. BMC Plant Biology，2012，12(1)：161.

[5] Ahn S J，Shin R，Schachtman D P. Expression of Kt/KUP genes inArabidopsisand the role of root hairs in K+uptake[J]. Plant Physiology，2004，134(3)：1135-1145.

[6] 晁毛妮, 溫青玉, 張晉玉, 等. 大豆KUP/HAK/KT鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體基因家族的鑒定與表達(dá)分析[J].西北植物學(xué)報(bào), 2017, 37(2): 239-249.

[7] Anne-Aliénor V, Manuel N C, Meriem D, et al. Molecular biology of K+transport across the plant cell membrane: what do we learn from comparison between plant species? [J]. Journal of Plant Physiology, 2014, 171(9): 748-769.

[8] 韓 敏. 鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體KUP7參與擬南芥響應(yīng)低鉀脅迫的功能研究[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[9] Song Z Z, Ma R J, Yu M L. Genome-wide analysis and identification of KT/HAK/KUP potassium transporter gene family in peach (Prunuspersica)[J]. Genetics and Molecular Research , 2015, 14(1): 774-787.

《著作權(quán)法》規(guī)定對(duì)著作權(quán)構(gòu)成侵犯的以及侵犯著作權(quán)的相關(guān)權(quán)利的，按照實(shí)際情況進(jìn)行賠償。對(duì)于難以計(jì)算損失數(shù)據(jù)的，根據(jù)侵權(quán)人的違法所得進(jìn)行賠償。賠償數(shù)額包括為阻止侵權(quán)行為的一切合理合法支出。對(duì)損失難以計(jì)算或者違法所得不確定的情況，應(yīng)當(dāng)按照實(shí)際情況，處50萬元以下的罰款?？傊?，侵權(quán)數(shù)額的賠償要根據(jù)實(shí)際損失情況、違法所得的金額進(jìn)行確定，具體情況具體分析。

[10] Wang Y, Wu W H. Potassium transport and signaling in higher plants[J]. Annual Review of Plant Biology, 2013, 64(1):451-476.

[11] Song Z Z，Yang Y，Ma R J，et al. Transcription of potassium transporter genes of Kt/HAK/KUP family in peach seedlings and responses to abiotic stresses[J]. Biologia Plantarum，2015，59(1)：65-73.

[12] 張永成，田 豐. 馬鈴薯試驗(yàn)研究方法[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2007：187.

[13] M?ser P，Thomine S，Schroeder J I，et al. Phylogenetic relationships within cation transporter families ofArabidopsis[J]. Plant Physiology，2001，126(4)：1646-1667.

[14] Dennison K L，Robertson W R，Lewis B D，et al. Functions of AKT1 and AKT2 potassium channels determined by studies of single and double mutants ofArabidopsis[J]. Plant Physiology，2001，127(3)：1012-1019.

[15] Hirsch R E，Lewis B D，Spalding E P，et al. A role for the AKT1 potassium channel in plant nutrition[J]. Science，1998，280(5365)：918-921.

[16] Han M, Wu W, Wu W H, et al. Potassium transporter KUP7 is involved in K+acquisition and translocation inArabidopsisroot under K+-limited conditions[J]. Molecular Plant, 2016, 9(3):437-446.

[17] 宋毓峰，張 良，董連紅，等. 植物KUP/HAK/KT家族鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體研究進(jìn)展[J]. 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2013(6)：92-98.

[18] Zhang Z，Zhang J，Chen Y，et al. Genome-wide analysis and identification of HAK potassium transporter gene family in maize (ZeamaysL.)[J]. Molecular Biology Reports，2012，39(8)：8465-8473.

[19] He C，Cui K，Duan A，et al. Genome-wide and molecular evolution analysis of the poplar Kt/HAK/KUP potassium transporter gene family[J]. Ecology and Evolution，2012，2(8)：1996-2004.

[20] 楊中敏，王 艷. 鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體KUP/HAK/KT家族功能的研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)，2014(3)：100-103.