趙亞婷，邢紅俠，龐 茜，鄭 旭，張 靖，甕巧云，2，邢繼紅，董金皋

(1.河北省植物生理與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 真菌毒素與植物分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071001；2.河北北方學(xué)院 農(nóng)林科技學(xué)院，河北 張家口 075000)

灰霉病是一種世界性分布的植物病害，其病原為灰葡萄孢(Botrytiscinerea)，主要為害幼果以及成熟的果實(shí)、花序、葉片、果柄等，常導(dǎo)致花序、果實(shí)大量脫落，已成為嚴(yán)重影響我國大田和溫室作物產(chǎn)量和品質(zhì)的重大病害。目前，灰霉病的防治仍以化學(xué)防治為主，但由于灰葡萄孢具有遺傳變異大、繁殖速度快、適應(yīng)性強(qiáng)以及具有多次再侵染等特點(diǎn)，使其對多種不同作用機(jī)制的殺菌劑產(chǎn)生了抗藥性，導(dǎo)致殺菌劑的使用量逐年增大，并對農(nóng)產(chǎn)品的安全性造成了嚴(yán)重威脅。因此，挖掘植物抗灰霉病基因，深入研究其抗病分子機(jī)制，為培育抗灰霉病的作物新品種具有重要意義。近年來，從擬南芥中克隆得到的抗病基因以及抗性相關(guān)基因一直是人們研究的熱點(diǎn)。目前，大部分植物抗病基因及抗性相關(guān)基因是從擬南芥中獲得的，如RPS2[1-2]、RPS5、RPS6[3]、RPM1[1，4-5]、RPP4[6-7]、RPP7[8]、RPW8[9-12]等，其中部分抗病基因已經(jīng)應(yīng)用到生產(chǎn)上。研究顯示，植物產(chǎn)生抵抗死體病原菌灰葡萄孢的侵染時(shí)，水楊酸(SA)信號途徑發(fā)揮了重要作用，SA的積累可以增加植物對灰葡萄孢的局部抗性[13]。通過高通量轉(zhuǎn)錄組分析，已經(jīng)鑒別了大量植物抵抗灰葡萄孢侵染起作用的轉(zhuǎn)錄因子TFs(Transcription factors)[14-17]。擬南芥T1N6_22基因編碼的蛋白為NAD(P)結(jié)合Rossmann-折疊蛋白家族的成員，具有葡萄糖脫氫酶活性和短鏈氧化還原酶活性，參與植物體內(nèi)各種催化反應(yīng)和新陳代謝過程，已經(jīng)確定其通過參與SA和茉莉酸(JA)信號途徑調(diào)控?cái)M南芥對灰葡萄孢的抗性[18]。河北農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌毒素與植物分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室前期獲得了一株對灰葡萄孢敏感的擬南芥突變體，確定了其突變基因?yàn)門1N6_22；通過互補(bǔ)回復(fù)試驗(yàn)，明確了T1N6_22基因在擬南芥抗灰霉病過程中起正調(diào)控作用，在擬南芥抗丁香假單胞桿菌(PstDC3000)過程中起負(fù)調(diào)控作用；利用酵母雙雜交技術(shù)，以T1N6_22蛋白為誘餌篩選擬南芥的酵母cDNA文庫，獲得了T1N6_22蛋白的候選互作蛋白[19]。但是，T1N6_22蛋白的互作蛋白及其調(diào)控?cái)M南芥抗病的分子機(jī)制尚未明確。

本研究利用酵母雙雜交技術(shù)，對擬南芥抗病相關(guān)基因T1N6_22的互作蛋白進(jìn)行鑒定，旨在為進(jìn)一步明確T1N6_22基因調(diào)控?cái)M南芥抗病的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

酵母雙雜交載體PGADT7(AD)和PGBKT7(BD)、酵母菌株AH109、擬南芥Columbia生態(tài)型(Col-0)均由河北省植物生理與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、河北農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌毒素與植物分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供；酵母轉(zhuǎn)化試劑和酵母培養(yǎng)基購于美國Clontech公司；pCR8克隆試劑盒(K2520-20)和LR克隆試劑盒(11791020)購于美國Invitrogen公司。

1.2 T1N6_22基因及其候選互作蛋白基因的擴(kuò)增

提取擬南芥Columbia生態(tài)型(Col-0)植株的總RNA，總RNA提取方法參照提取試劑盒OMEGA Plant RNA Kit的說明書。以提取的總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，cDNA的合成方法參照寶生物反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書。以cDNA為模板，使用T1N6_22基因和AT1G06050、AT1G21400、AT2G19480基因的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(表1)。PCR反應(yīng)體系為MgSO42 μL、10×PCR Buffer 5 μL、dNTP(2.5 mmol/L)1 μL、引物各1 μL、模板cDNA 2 μL、Taq酶0.2 μL，最后加ddH2O至50 μL。PCR程序?yàn)?4 ℃ 2 min；94 ℃ 15 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.3 T1N6_22基因及其候選互作蛋白基因的克隆

將T1N6_22基因及其候選互作蛋白基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收，膠回收方法參照全式金膠回收試劑盒的說明書。將回收的基因擴(kuò)增產(chǎn)物分別與Gateway克隆載體pCR8進(jìn)行連接。連接體系為1 μL回收的PCR產(chǎn)物、鹽溶液0.5 μL、ddH2O 1 μL、pCR8 Topo載體0.5 μL，室溫23 ℃反應(yīng)5 min。連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆進(jìn)行PCR鑒定和測序驗(yàn)證。

1.4 T1N6_22基因及其候選互作蛋白基因的酵母雙雜交載體構(gòu)建

利用質(zhì)粒提取試劑盒，提取經(jīng)測序正確的pCR8-T1N6_22、pCR8-AT1G06050、pCR8-AT1G21400和pCR8-AT2G19480質(zhì)粒；利用LR重組試劑盒，將4個(gè)基因的入門載體分別與酵母雙雜交載體PGADT7(AD)和PGBKT7(BD)進(jìn)行重組反應(yīng)，反應(yīng)體系為質(zhì)粒pCR8-T1N6_22(或者pCR8-AT1G06050、pCR8-AT1G21400、pCR8-AT2G19480)3 μL、AD/BD載體1 μL、LR克隆酶Ⅱ 1 μL，25 ℃連接2 h。2 h后在連接體系中加入蛋白酶K 1 μL，37 ℃ 10 min。將所得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆進(jìn)行PCR檢測，將PCR檢測正確的克隆進(jìn)行進(jìn)一步的測序鑒定。

1.5 T1N6_22基因及其候選互作蛋白基因的自激活活性檢測

將1 μg AD質(zhì)粒分別與1 μg BD-T1N6_22、BD-AT1G06050、BD-AT1G21400和BD-AT2G19480組合共同轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞AH109，室溫孵育1～2 h，42 ℃熱激30 min后，冰浴1～2 min。將酵母細(xì)胞涂布于二缺(-Leu/-Trp)培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)2～3 d。挑取二缺培養(yǎng)基上生長良好的酵母單克隆，用100 μL無菌水稀釋，吸取10 μL點(diǎn)于三缺-Leu/-Trp/-His和添加3-AT的-Leu/-Trp/-His培養(yǎng)基上，30 ℃繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d，觀察酵母生長情況。

1.6 酵母雙雜交

將1 μg AD-T1N6_22質(zhì)粒分別與1 μg BD-AT1G06050、BD-AT1G21400和BD-AT2G19480質(zhì)粒組合，將1 μg BD-T1N6_22質(zhì)粒分別與1 μg AD-AT1G06050、AD-AT1G21400和AD-AT2G19480質(zhì)粒組合，同時(shí)設(shè)對照組合AD-T1N6_22+BD、BD-AT1G06050+AD、BD-AT1G21400+AD、BD-AT2G19480+AD、BD-T1N6_22+AD、AD-AT1G06050+BD、AD-AT1G21400+BD和AD-AT2G19480+BD。將不同組合分別轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞(200 μL)，涂布二缺(-Leu/-Trp)培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)2～3 d。挑取二缺培養(yǎng)基上生長良好的酵母單克隆，用100 μL無菌水稀釋，分別吸取10 μL點(diǎn)于二缺-Leu/-Trp、三缺-Leu/-Trp/-His、添加3-AT的三缺-Leu/-Trp/-His 3-AT和四缺-Leu/-Trp/-His/-Ade培養(yǎng)基上，30 ℃繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d，觀察酵母生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 T1N6_22基因及其候選互作蛋白基因的酵母雙雜交載體構(gòu)建

利用T1N6_22基因的特異性引物擴(kuò)增得到T1N6_22基因的全長(888 bp)(圖1-A)，將其與入門載體pCR8連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)菌落PCR擴(kuò)增檢測發(fā)現(xiàn)獲得了單一的目的條帶(圖1-B)，進(jìn)一步對其進(jìn)行測序驗(yàn)證，獲得T1N6_22基因入門載體pCR8-T1N6_22。將pCR8-T1N6_22與酵母雙雜交載體AD、BD進(jìn)行重組反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)菌落PCR鑒定獲得了單一的目的條帶(圖1-C、D)，進(jìn)一步對重組載體進(jìn)行測序鑒定，最終獲得T1N6_22基因酵母雙雜交載體AD-T1N6_22和BD-T1N6_22。利用同樣的方法，分別獲得AT1G06050、AT1G21400和AT2G19480基因的酵母雙雜交載體AD-AT1G06050、BD-AT1G06050、AD-AT1G2140、BD-AT1G2140、AD-AT2G19480、BD-AT2G19480(圖2-4)。

A.T1N6_22的PCR擴(kuò)增；B.pCR8-T1N6_22的PCR擴(kuò)增；C.AD-T1N6_22的PCR擴(kuò)增；D.BD-T1N6_22的PCR擴(kuò)增。A.PCR amplification of T1N6_22；B.PCR amplification of pCR8-T1N6_22；C.PCR amplification of AD-T1N6_22；D.PCR amplification of BD-T1N6_22.

A.AT1G06050的PCR擴(kuò)增；B.pCR8-AT1G06050的PCR擴(kuò)增；C.AD-AT1G06050的PCR擴(kuò)增；D.BD-AT1G06050的PCR擴(kuò)增。A.PCR amplification of AT1G06050；B.PCR amplification of pCR8-AT1G06050；C. PCR amplification of the AD-AT1G06050；D. PCR amplification of BD-AT1G06050.

A.AT1G21400的PCR擴(kuò)增；B.pCR8-AT1G21400的PCR擴(kuò)增；C.AD-AT1G21400的PCR擴(kuò)增；D.BD-AT1G21400的PCR擴(kuò)增。A.PCR amplification of AT1G21400；B.PCR amplification of pCR8-AT1G21400；C.PCR amplification of AD-AT1G21400；D.PCR amplification of BD-AT1G21400.

A.AT2G19480的PCR擴(kuò)增；B.pCR8-AT2G19480的PCR擴(kuò)增；C.AD-AT2G19480的PCR擴(kuò)增；D.BD-AT2G19480的PCR擴(kuò)增。A.PCR amplification of AT2G19480；B. PCR amplification of pCR8-AT2G19480；C. PCR amplification of AD-AT2G19480；D. PCR amplification of BD-AT2G19480.

2.2 T1N6_22基因及其候選互作蛋白基因的自激活活性檢測

將AD空載體分別與BD-T1N6_22、BD-AT1G06050、BD-AT1G21400和BD-AT2G19480質(zhì)粒組合共轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞，檢測各基因的自激活活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共同轉(zhuǎn)化AD與BD-T1N6_22、BD-AT1G21400和BD-AT2G19480載體的酵母菌落均不能在三缺培養(yǎng)基-Leu/-Trp/-His和-Leu/-Trp/-His 3-AT上生長，共同轉(zhuǎn)化BD-AT1G06050和AD載體的酵母菌落能在三缺(-Leu/-Trp/-His)培養(yǎng)基上正常生長，添加3-AT的三缺培養(yǎng)基-Leu/-Trp/-His 3-AT能夠抑制其生長(圖5)。表明T1N6_22、AT1G21400、AT2G19480基因無自激活活性，AT1G06050基因有自激活活性。

圖 5 T1N6_22及其可能互作蛋白自激活活性的鑒定Fig.5 Self-activating activity of T1N6_22 and its candidate interacting protein

2.3 T1N6_22互作蛋白的酵母雙雜交鑒定

將AD-T1N6_22與BD-AT1G06050、BD-T1N6_22與AD-AT1G06050組合進(jìn)行酵母雙雜交試驗(yàn)，同時(shí)設(shè)AD-T1N6_22+BD、AD+BD-AT1G06050、BD-T1N6_22+AD、BD+AD-AT1G06050、AD+BD組合作為陰性對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共轉(zhuǎn)化AD-T1N6_22與BD-AT1G06050、BD-T1N6_22與AD-AT1G06050組合的酵母菌落在三缺培養(yǎng)基(-Leu/-Trp/-His和-Leu/-Trp/-His 3-AT)和四缺培養(yǎng)基(-Leu/-Trp/-His/-Ade)均能生長，共轉(zhuǎn)化陰性對照AD與BD-AT1G06050組合的酵母菌落在三缺培養(yǎng)基(-Leu/-Trp/-His)上能夠生長，而共轉(zhuǎn)化其他陰性對照組合的酵母菌落在三缺培養(yǎng)基(-Leu/-Trp/-His和-Leu/-Trp/-His 3-AT)和四缺培養(yǎng)基(-Leu/-Trp/-His/-Ade)上均不能生長(圖6)。表明T1N6_22與AT1G06050能在酵母細(xì)胞中直接互作。

利用同樣的方法，檢測T1N6_22與AT1G21400、AT2G19480之間在酵母中的互作關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共轉(zhuǎn)化AD-T1N6_22+BD-AT1G21400、BD-T1N6_22+AD-AT1G21400、AD-T1N6_22+BD-AT2G19480、BD-T1N6_22+AD-AT2G19480組合的酵母菌落在三缺培養(yǎng)基(-Leu/-Trp/-His和-Leu/-Trp/-His 3-AT)和四缺培養(yǎng)基(-Leu/-Trp/-His/-Ade)上均能生長，而陰性對照組合除BD+AD-AT1G21400和AD+BD在三缺培養(yǎng)基(-Leu/-Trp/-His)上有微弱生長外，其余陰性對照組合均不能在三缺和四缺培養(yǎng)基上正常生長(圖7-8)。表明T1N6_22與AT1G21400、AT2G19480能在酵母細(xì)胞中直接互作。

圖 6 T1N6_22 和AT1G06050酵母雙雜交Fig.6 Results of T1N6_22 and AT1G06050 yeast two-hybrid

圖7 T1N6_22 和AT1G21400酵母雙雜交Fig.7 Results of T1N6_22 and AT1G21400 yeast two-hybrid

圖8 T1N6_22 和AT2G19480酵母雙雜交Fig.8 Results of T1N6_22 and AT2G19480 yeast two-hybrid

3 討論

酵母雙雜交系統(tǒng)(Yeast two-hybrid system)是分析蛋白與蛋白之間相互作用的有效、快速的方法，可以精確地測定蛋白質(zhì)之間微弱的相互作用，由于其操作水平是在核酸水平，不需要純化大量的蛋白，因此，操作簡單容易。但是，酵母雙雜交技術(shù)存在一些自身缺陷，很明顯的一個(gè)缺陷就是存在假陽性。因此，酵母雙雜交驗(yàn)證的蛋白質(zhì)相互作用往往還需要其他的試驗(yàn)證據(jù)進(jìn)一步支持。本研究中，利用酵母雙雜交技術(shù)確定了T1N6_22蛋白與AT1G06050、AT1G21400和AT2G19480存在互作關(guān)系。基于酵母雙雜交系統(tǒng)自身的局限性，后續(xù)試驗(yàn)中可以采用其他技術(shù)對其互作關(guān)系進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。

除了酵母雙雜交之外，還有多種檢測蛋白互作的方法。如雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)(BiFC)和免疫共沉淀技術(shù)(Co-IP)。其中，BiFC技術(shù)是一個(gè)在活細(xì)胞中檢測蛋白互作的非常好的工具[20-23]；Co-IP技術(shù)是一種在細(xì)胞非變性條件下研究蛋白之間直接互作的方法，可以在體內(nèi)直接確定它們之間相互作用方式的動(dòng)態(tài)變化[24]。

本研究利用酵母雙雜交技術(shù)確定了T1N6_22蛋白的互作蛋白AT1G06050、AT1G21400和AT2G19480，下一步工作可以對AT1G06050、AT1G21400和AT2G19480的功能進(jìn)行深入研究，明確其在擬南芥抗病中的功能及其與SA和JA信號途徑之間的關(guān)系，深入探討T1N6_22基因及其互作蛋白基因調(diào)控?cái)M南芥抗病的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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