魏慧 黃海燕 于芳楠 劉熊 丁學(xué)知 夏立秋

摘 要 為從Myxococcus macrosporus STXZ54發(fā)酵液中高效地分離純化出抗腫瘤活性蛋白WGF5，收集STXZ54發(fā)酵上清液，先后利用優(yōu)化后的硫酸銨沉淀方法沉淀蛋白，強(qiáng)陽(yáng)離子交換、分子篩色譜分離等方法對(duì)蛋白粗提物進(jìn)行精細(xì)分離.利用CCK-8試劑盒，倒置顯微鏡、掃描電子顯微鏡等觀(guān)察WGF5對(duì)腫瘤細(xì)胞形態(tài)的影響，臺(tái)盼藍(lán)染色進(jìn)一步檢測(cè)WGF5對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒力.實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀(guān)察到WGF5能夠顯著改變腫瘤細(xì)胞形態(tài)，與原分離體系相比較，優(yōu)化后的抗腫瘤活性蛋白分離方法更為高效，簡(jiǎn)便易行.

關(guān)鍵詞 大孢粘球菌；抗腫瘤活性蛋白；方法優(yōu)化

中圖分類(lèi)號(hào) Q936文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1000-2537（2017）06-0044-05

Abstract The anti-tumor active protein WGF5 was isolated and purified from Myxococcus macrosporus STXZ54 fermentation broth by method optimization. Collected supernatant of STXZ54 and the protein WGF5 was separated by the optimized method of precipitating protein， including strong cation exchange and molecular sieve chromatography.The effect of WGF5 on the morphology of tumor cells was further examined by CCK-8 kit， inverted microscope， scanning electron microscope， and trypan blue staining.Our experimental results showed that WGF5 significantly affected tumor cell morphology， compared with the original separation system，our present optimized anti-tumor activity protein separation method is not only more efficient but also simpler.

Key words Myxococcus macrosporus； antitumor activity， separation method optimization

粘細(xì)菌（Myxobacteria）是一類(lèi)具有獨(dú)特復(fù)雜細(xì)胞行為的革蘭氏陰性桿狀細(xì)菌，在自然界中廣泛存在于土壤、腐枝枯葉，甚至極端環(huán)境中[1].粘細(xì)菌在其生命活動(dòng)中可以產(chǎn)生具有多種生物活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物和衍生物[2-5]，具有抗菌、抗腫瘤等重要功能[6-12]，成為發(fā)現(xiàn)新型藥物前體分子的重要資源.文也等[13]先后利用40%～75%硫酸銨分級(jí)沉淀方法分離發(fā)酵上清液中的蛋白質(zhì)組分，弱陽(yáng)離子交換色譜分離方法、分子篩色譜方法、反相色譜分離方法相結(jié)合從大孢粘球菌STXZ54中分離純化出了單一的蛋白類(lèi)活性物質(zhì)WGF5.其相對(duì)分子質(zhì)量大小為20 000，在常溫下性質(zhì)穩(wěn)定，能夠高效地抑制 B16，Hela，HCT-116，4T1及Hep-3b等多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，屬于高效廣譜的抗腫瘤蛋白類(lèi)活性物質(zhì).本研究通過(guò)全面優(yōu)化WGF5的純化方法，探究出更適合蛋白粗分離的硫酸銨梯度沉淀方法，以獲得更多的目的蛋白.用強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜柱代替弱陽(yáng)離子交換柱，同時(shí)改變分子篩色譜的柱型與分離方法，快速高效地從大孢粘球菌STXZ54中分離得到WGF5，為該物質(zhì)的大量制備提供更便捷有效的方法.冷場(chǎng)掃描電鏡、臺(tái)盼藍(lán)染色等進(jìn)一步分析了WGF5對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒力，為其研發(fā)與應(yīng)用提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 Myxococcus macrosporus STXZ54，由本實(shí)驗(yàn)室分離純化并鑒定的新菌株，菌種保藏號(hào)（CCTCC NO： M2014455）.

1.1.2 供試細(xì)胞株 小鼠黑色素瘤細(xì)胞（Murine Melanoma B16 cells）.

1.1.3 培養(yǎng)基

（1）Wax固體培養(yǎng)基：CaCl2·2H2O 1 g，HEPES 0.5 g，瓊脂粉15 g，水1 000 mL，pH 7.2；

（2）CTT固體培養(yǎng)基：酪蛋白胨 10 g，MgSO4·7H2O 8 mmol/L，磷酸鉀緩沖液（pH7.6） 1 mmol/L，Tris-HCl緩沖液（pH7.6） 10 mmol/L，瓊脂糖15 g，pH7.6；

（3）MD1液體培養(yǎng)基：酪蛋白6 g，可溶性淀粉 2 g，MgSO4·7H2O 2 g，CaCl2·2H2O 0.4 g，水1 000 mL，pH 7.2.

1.1.4 試劑與儀器 甲醇、乙腈、硫酸銨、AKTA蛋白純化系統(tǒng)、酶標(biāo)儀、生物安全柜、冷場(chǎng)掃描電子顯微鏡.

1.2 菌體的發(fā)酵培養(yǎng)

將本實(shí)驗(yàn)保藏的實(shí)驗(yàn)菌株Myxococcus macrosporus STXZ54 先接種到CTT固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d，再?gòu)钠桨迳限D(zhuǎn)接至1.5 mL EP管中30 ℃培養(yǎng)活化2 d后，轉(zhuǎn)接到20 mL小瓶MD1液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，按2.5%的比例接種到2 L大搖瓶中，30 ℃，160 r/min培養(yǎng)6 d，10 000 r/min離心20 min，收集發(fā)酵上清液.

1.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞毒性

在96孔板中鋪入B16細(xì)胞，103個(gè)/孔，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，37 ℃溫度環(huán)境中培養(yǎng)12 h.實(shí)驗(yàn)組加入待測(cè)樣品，對(duì)照組加入等體積的PBS，持續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h.在黑暗環(huán)境下，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1～2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光值，計(jì)算相應(yīng)的細(xì)胞抑制率.

1.4 抗腫瘤活性物質(zhì)分離體系的優(yōu)化

1.4.1 硫酸銨沉淀蛋白方法的優(yōu)化 STXZ54發(fā)酵6 d后，收集發(fā)酵上清液1 L，分成體積相等的四等分于4組大燒杯中.在第一組發(fā)酵上清液中緩慢加入硫酸銨至濃度35%；在第二組發(fā)酵上清液中分別加入硫酸銨至35%和70%飽和度分級(jí)沉淀蛋白；在第三組發(fā)酵上清液中分別加入硫酸銨至70%和100%飽和度；在第四組發(fā)酵上清液中分別加入硫酸銨至40%和75%飽和度（文也等[13]所使用的硫酸銨分級(jí)沉淀濃度梯度）.12 000 r/min收集各組段沉淀的蛋白，經(jīng)透析袋（MWCO 7 000～13 000）透析脫鹽，13 000 r/min離心 5 min 收集上清液.過(guò)濾除菌后，對(duì)各樣品的細(xì)胞毒性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)比較.取上清液 20 μL SDS-PAGE 檢測(cè)蛋白成分.

1.4.2 高效液相色譜精細(xì)分離體系的優(yōu)化

（1）強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜分離 配制pH 5.0的 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液（A相）和pH5.0的 0.5 mol/L的NaCl溶液（B相）.選擇強(qiáng)陽(yáng)離子色譜柱SPFF色譜柱對(duì)粗體蛋白進(jìn)行AKTA蛋白純化系統(tǒng)分離.用A相先進(jìn)行4個(gè)柱體積的上樣掛柱，B相進(jìn)行色譜峰的洗脫，洗脫時(shí)，B相起始濃度為0%，在20個(gè)柱體積內(nèi)濃度線(xiàn)性增大到100%.流速0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm.收集各個(gè)色譜峰，以備細(xì)胞毒性檢測(cè).

（2）分子篩色譜分離 將強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜分離出的活性峰進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)后，選擇有活性的色譜峰進(jìn)行分子篩色譜分離.色譜柱為Sephadex 200 10/300，流動(dòng)相為ddH2O，流速0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：215 nm.收集每個(gè)色譜峰，冷凍濃縮后進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn).

（3）SDS-PAGE檢測(cè)分離活性組分的純度 將收集到的樣品冷凍濃縮后，以12%膠濃度進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，觀(guān)察有無(wú)WGF5條帶.

1.4.3 掃描電子顯微鏡觀(guān)察對(duì)腫瘤細(xì)胞形態(tài)的觀(guān)察 用鑷子將75%乙醇浸泡的蓋玻片（22 mm×22 mm）在酒精燈上烤干，放置于六孔板中，加入2 mL B16細(xì)胞，104～105個(gè)/孔，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)12 h，加入SCM3，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸去上清，PBS清洗2次，用2.5%戊二醛溶液固定過(guò)夜，PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2～3次，依次用濃度30%，50%，70%，80%，90%，95%，100%的乙醇溶液逐步給腫瘤細(xì)胞脫水.取下蓋玻片，進(jìn)行掃描電鏡觀(guān)察.

1.4.4 臺(tái)盼藍(lán)染色分析WGF5對(duì)SMMC-7721的毒力 將在六孔板接種的細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，實(shí)驗(yàn)組加入10 mg/L WGF5，而對(duì)照組加入相同體積的PBS，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組都做相同時(shí)間梯度：0，24，36，48，60 h.收集細(xì)胞PBS洗滌2次后，80 μL無(wú)菌去離子水重懸細(xì)胞，然后加入80 μL臺(tái)盼藍(lán)染色液常溫染色5 min，細(xì)胞用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞的死亡率.

2 結(jié)果與分析

2.1 硫酸銨分級(jí)沉淀抗腫瘤活性蛋白

利用硫酸銨分級(jí)沉淀梯度分別為0%～35%，35%～70%，70%～100%，40%～75%分級(jí)沉淀出的4組蛋白，作用B16 腫瘤細(xì)胞 24 h，CCK-8試劑盒測(cè)定各組樣品的腫瘤細(xì)胞抑制率.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1-a所示，各飽和度下沉淀的蛋白均對(duì)兩種腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，且 35%～70%飽和度區(qū)沉淀出蛋白的細(xì)胞毒性為83%，顯著高于其他三組蛋白的抗腫瘤活性.硫酸銨分級(jí)沉淀濃度為40%～75%時(shí)（原方法所使用的硫酸銨分級(jí)沉淀濃度梯度），其沉淀出的蛋白細(xì)胞毒性在73%左右.SDS-PAGE檢測(cè)硫酸銨分級(jí)沉淀梯度分別為35%～70%（圖1-b，泳道1）、40%～75%（圖1-b，泳道2）沉淀出的兩組樣品的蛋白條帶發(fā)現(xiàn)，二者蛋白成分相近，且35%～70%硫酸銨分級(jí)沉淀出的蛋白中WGF5含量較高.因此，考慮選用35%～70%硫酸銨梯度沉淀法沉淀抗腫瘤活性蛋白.

2.2 強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜分離抗腫瘤活性蛋白

將提取的抗腫瘤活性粗提蛋白用強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜進(jìn)行分離，分離結(jié)果如圖2-a所示，圖中出現(xiàn)兩個(gè)色譜峰，穿透峰（峰A）在色譜程序開(kāi)始后不久就被洗脫下來(lái)，峰面積較大，最高點(diǎn)接近3 500 mAU.緊隨峰A被洗脫下來(lái)的色譜峰（峰B），保留時(shí)間為6.5 min.收集各峰進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，并對(duì)A和B兩活性峰進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果表明WGF5在峰B中.大量收集活性峰B，進(jìn)行下一步分離純化.

2.3 分子篩色譜分離抗腫瘤活性蛋白

收集強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜分離的活性峰進(jìn)行分子篩色譜.分離結(jié)果如圖3所示，從圖3中可以看出，活性粗提物的分子篩色譜分離共出現(xiàn)了3個(gè)峰，其中峰A的色譜峰面積最大，其余2個(gè)活性峰的峰面積較小.收集這3個(gè)色譜峰進(jìn)行腫瘤活性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有峰C的洗脫液有抗腫瘤活性.

2.4 抗腫瘤活性蛋白的純度檢測(cè)

將分子篩色譜分離出的活性峰組分，進(jìn)行12%SDS-PAGE.檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，泳道1所示只有一個(gè)條帶，相對(duì)分子質(zhì)量約20 000，確定為目的條帶WGF5.

2.5 臺(tái)盼藍(lán)染色觀(guān)察WGF5對(duì)B16細(xì)胞的毒性作用

用4%臺(tái)盼藍(lán)染色液對(duì)WGF5作用不同時(shí)間的B16細(xì)胞進(jìn)行染色.早期凋亡的細(xì)胞及未死亡的細(xì)胞中細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)較完整，不易被臺(tái)盼藍(lán)染液染成藍(lán)色，從而可以通過(guò)這種染色手段將活細(xì)胞與死細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái).從圖5可以看出，隨作用細(xì)胞的時(shí)間增大，被染色的死細(xì)胞數(shù)目比例逐漸增加.在WGF5作用48 h后，細(xì)胞死亡比例達(dá)到了67%，而之前CCK-8試劑盒測(cè)得細(xì)胞死亡率在67%之上，可以分析得出在CS3作用細(xì)胞期間，細(xì)胞可能發(fā)生了早期凋亡.

2.6 掃描電子顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)變化

掃描電子顯微鏡觀(guān)察WGF5對(duì)B16細(xì)胞形態(tài)的影響，結(jié)果如圖6所示，在對(duì)照組中， B16細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞形態(tài)變化，細(xì)胞形態(tài)正常.實(shí)驗(yàn)組中B16細(xì)胞的細(xì)胞偽足消失，細(xì)胞結(jié)構(gòu)坍塌瓦解，細(xì)胞變圓死亡，足見(jiàn)WGF5對(duì)人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞沒(méi)有明顯的毒力.

3 討論

粘細(xì)菌是最高級(jí)的微生物類(lèi)群，科研工作者從中挖掘抗腫瘤新藥物的研究體系也日趨完善[14].就目前研究現(xiàn)狀來(lái)看，粘細(xì)菌抗腫瘤新藥物的開(kāi)發(fā)潛力遠(yuǎn)大于放線(xiàn)菌[15].2014年Jansen等從粘細(xì)菌Nannocystis pusilla Na a174菌株中分離得到的pyrronazols C1和C2兩種活性物質(zhì)對(duì)多種腫瘤細(xì)胞系均有抑制作用，其中對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SK-OV-3的活性最好[16].Tubulysin是具有抗腫瘤細(xì)胞活性的多肽類(lèi)化合物，從Archangium Gephyra中分離獲得，Tubulysin A抑制腫瘤細(xì)胞有絲分裂，可以使癌細(xì)胞周期被停滯在G2/M并最終走向死亡[17-18].

文也等[13]從Myxococcus macrosporus STXZ54中分離到的WGF5是一種相對(duì)分子質(zhì)量約為20 000的活性蛋白，能很好地抑制B16及Hela等多種腫瘤細(xì)胞，在所測(cè)試的細(xì)胞系中顯示出高效的抗腫瘤活性.但WGF5的分離純化方法較為耗時(shí)，步驟略顯繁復(fù)，導(dǎo)致WGF5的分離效率較低.本文在文也等[13]研究的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了對(duì)Myxococcus macrosporus STXZ54抗腫瘤活性蛋白WGF5的分離純化方法，找到更為適合的硫酸銨分級(jí)沉淀蛋白的濃度梯度：35%～70%的硫酸銨梯度下沉淀出的蛋白比原濃度梯度（40%～75%）沉淀出的蛋白表現(xiàn)出更高的抗腫瘤活性，且保留了目的條帶.另外用強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱代替弱陽(yáng)離子交換柱進(jìn)行粗提樣品的分離，發(fā)現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)離子交換更易結(jié)合STXZ54抗腫瘤活性蛋白組分.同時(shí)將色譜柱Sephadex G75更換為Sephadex 200 10/300，其孔徑更適合STXZ54活性蛋白的分離.SDS-PAGE檢測(cè)分子篩活性峰，結(jié)果顯示為一條帶，大小在20 000左右，即WGF5條帶.優(yōu)化后的WGF5分離純化方法，省去了反相色譜分離步驟，同時(shí)優(yōu)化了各色譜分離中流動(dòng)相配方、流速等，進(jìn)一步提高了WGF5的分離純化效率.

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