鐘希娜， 何 濤， 葛展霞， 王 冉

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)部食品質量安全監(jiān)控重點開放實驗室/江蘇省禽產(chǎn)品安全性研究重點實驗室，江蘇 南京 210014； 2.南京農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，江蘇 南京 210095)

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli,E.coli)俗稱大腸桿菌，屬于革蘭氏陰性細菌腸桿菌科埃希氏菌屬。部分致病性的大腸桿菌能同時感染人畜[1]，給人類健康和財產(chǎn)造成巨大損失。黏菌素(Colistin)又稱為多黏菌素E(PolymyxinsE)，能破壞革蘭氏陰性細菌的細胞膜結構[2-3]，中和細菌內(nèi)毒素[4]，被稱為抵抗革蘭氏陰性菌的最后一道防線[5-7]。長期以來，黏菌素在國內(nèi)動物養(yǎng)殖上應用廣泛，導致動物源大腸桿菌對黏菌素的耐藥性逐年增加。最近報道的大腸桿菌上攜帶的mcr-1基因，可以介導大腸桿菌對黏菌素的低水平耐藥。值得注意的是，該耐藥基因可以通過質粒在同一細菌種屬甚至不同細菌種屬間進行水平傳播，同時mcr-1基因可與其他耐藥基因共存于同一細菌菌株中[8]，從而形成危害更大的多重耐藥甚至泛耐藥超級細菌。攜帶mcr-1基因大腸桿菌的出現(xiàn)，對于公共衛(wèi)生安全和人類健康而言是一個極大的威脅，而傳統(tǒng)的抗生素對多重耐藥細菌引起的疾病療效甚微，因此尋求新型的抗菌制劑已迫在眉睫。

噬菌體(Bacteriophage)能特異性感染宿主細菌，被稱為最重要的天然殺菌物質[9-10]。相比于抗生素，噬菌體能高效殺滅特定細菌，且不影響正常菌群生長，而且噬菌體能有效規(guī)避因使用抗生素而造成的細菌耐藥性問題。研究結果表明，寄生在大腸桿菌中的噬菌體能有效殺死耐藥菌株，可作為新型的殺菌制劑，市場應用前景廣闊。本試驗以來源于豬養(yǎng)殖場的mcr-1陽性大腸桿菌為宿主菌，分離對其具有殺滅作用的裂解性噬菌體，研究該噬菌體的生物學特性，以期為mcr-1陽性大腸桿菌的防控提供新思路和有效的技術手段。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

LB培養(yǎng)基參照Sambrook等[10]配制，PEG8000和蛋白酶K購于美國Amresco公司，DNase I和RNaseA購于Sigma-Aldrich公司，Hind III購于日本TOYOBO公司。

1.2 菌株和污水

mcr-1陽性大腸桿菌SQ-P -E32分離自江蘇宿遷某豬養(yǎng)殖場的豬糞便樣本，污水取自該養(yǎng)殖場的糞水。mcr-1陽性大腸桿菌及mcr-1陰性大腸桿菌臨床株為本實驗室分離保藏菌株，宿主來源為豬。

1.3 噬菌體的分離和純化

參照Sambrook等[11]的方法取豬場污水。將樣品在4 ℃溫度下以4 000g離心15 min后取上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜除去雜質和細菌。取10 ml上述濾液加入10 ml 2×LB、1 ml對數(shù)生長期mcr-1陽性大腸桿菌SQ-P-E32菌懸液和適量CaCl2液體，并最終將CaCl2濃度調(diào)為1 mmoL/ml。靜置15 min后轉至37 ℃搖床(160 r/min)振蕩培養(yǎng)12 h。將所得培養(yǎng)物于4 ℃溫度下以10 000g離心10 min后取上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜后即得SQ-P-E32菌對應的噬菌體原液。

采用雙層平板法[12]檢測和篩選裂解性噬菌體。取上述原液0.1 ml，適當稀釋后加入宿主菌懸液0.1 ml。靜置數(shù)分鐘后加入3.5 ml 50 ℃左右的0.6% LB半固體培養(yǎng)基，混勻平鋪至LB固體培養(yǎng)基上。37 ℃培養(yǎng)6～8 h后觀察噬菌斑生長情況。若有噬菌斑，挑取單個形態(tài)均勻、清晰無暈環(huán)的菌斑，溶于含有0.9 ml 緩沖液的無菌EP管中，加氯仿，放置1 h，4 ℃過夜。次日取0.1 ml上述溶液適當稀釋，與宿主菌做雙層平板。如此重復7～8次，即可獲得純種噬菌體。

1.4 噬菌體的透射電鏡分析

參照文獻[11]的方法，將經(jīng)聚乙二醇沉淀法純化后的噬菌體滴在銅網(wǎng)上， 10 min后用濾紙從側面吸干銅網(wǎng)上的多余液體。加一滴2%磷鎢酸(PTA，pH=7.0)于銅網(wǎng)，染色10 min后將銅網(wǎng)放于干燥濾紙上，自然干燥后電鏡觀察。

1.5 噬菌體的基因組分析

參照文獻[11]的方法，向經(jīng)聚乙二醇沉淀法純化后的噬菌體懸液中加入DNase Ⅰ和RNase A至終濃度均為1 μg/ml，37 ℃溫育30 min。加蛋白酶K(終濃度為50 μg/ml)及SDS(終濃度為0.5%，質量體積比)，混勻后56 ℃水浴過夜。次日，向消化液中加等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，反復抽提2次，收集親水相，再用氯仿抽提1次后，用無水乙醇沉淀核酸。所得核酸沉淀用70%乙醇洗滌后溶于超純水中待用。

將提取的核酸用DNase I、RNase A和Mung Bean Nuclease進行處理，同時使用DNA限制性內(nèi)切酶EcoR I和Hind Ⅲ 酶切，對產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳分析。根據(jù)酶消化處理結果確定噬菌體基因組核酸類型，根據(jù)酶切結果初步估算其核酸大小。

1.6 噬菌體最佳感染復數(shù)的測定

感染復數(shù)(Multiplicity of infection,MOI)為感染初期加入噬菌體的數(shù)量與宿主菌數(shù)量的比值。具體操作參照Lu等[13]的方法。首先選取分離出的宿主菌的單菌落，將其接種在新鮮的LB液體培養(yǎng)液中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。將細菌的濃度調(diào)整為1.0×108CFU/ml。按照MOI分別為0.01，0.10，1.00，10.00, 100.00和1 000.00將相應數(shù)量的噬菌體液加入到已準備好的宿主菌液中并充分混勻。之后將所得混合菌液置于37 ℃搖床160 r/min震蕩培養(yǎng)5 h。用雙層瓊脂平板法測定裂解液中噬菌體的效價，產(chǎn)生最高效價的感染復數(shù)即為最佳MOI。同樣條件下試驗重復3次，每組2個重復。

1.7 噬菌體一步生長曲線的測定

一步生長曲線(One step growth curve)的測定參照Weiss等[14]的方法，略有改動。取對數(shù)生長期的大腸桿菌SQ-P-E32的懸液，調(diào)整濃度至1×108CFU/ml。向宿主菌菌液中以MOI=100加入噬菌體，37 ℃孵育15 min后12 000 r/min離心1 min，棄掉上清液，用新鮮的LB液體洗滌1次后再棄上清液。等體積加入37 ℃預熱的LB液體培養(yǎng)基，重懸沉淀后充分混勻，迅速置于37 ℃搖床160 r/min振蕩培養(yǎng)。同時開始計時，在0時刻取樣1次，以后每隔10 min取樣1次，共取9次。采用雙層瓊脂平板法測定噬菌體的效價(滴度)。以感染時間為橫坐標，噬菌體效價為縱坐標，繪制噬菌體的一步生長曲線，估算出噬菌體的潛伏期、爆發(fā)期、爆發(fā)量。分別設置無噬菌體宿主菌培養(yǎng)液和無宿主菌噬菌體培養(yǎng)液作為對照。同樣條件下試驗重復3次，每組2個重復。

1.8 噬菌體熱穩(wěn)定性測定

取效價為6×108PFU/ml的mcr-1噬菌體懸液分別于30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃的水浴鍋中分別作用30 min和60 min后，利用雙層瓊脂平板法測定處理后的噬菌體效價。同樣條件下試驗重復3次，每組2個重復。

1.9 噬菌體pH穩(wěn)定性測定

取10份體積為100 μl效價為6×108PFU/ml噬菌體懸液分別放于pH值分別為2、3、4、5、6、8、9、10、11和12的胰蛋白胨水(900 μl)中，37 ℃作用2 h。利用雙層平板試驗測定處理后的噬菌體，37 ℃培養(yǎng)過夜。同樣條件下試驗重復3次，每組2個重復。

1.10 噬菌體裂菌效力測定

1.10.1 噬菌體體外裂解動力學 將宿主菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期(OD600值為0.45，約2.0×108CFU/ml)分別按MOI為0，0.01，0.10，1.00，10.00，100.00加入噬菌體并于37 ℃搖床(160 r/min)中培養(yǎng)，每組設置3個重復。以未加噬菌體的細菌培養(yǎng)液為對照，每30 min測定各組OD600值，測定總時長為5 h。以此觀察噬菌體在不同時刻對細菌的裂解效力。

1.10.2 噬菌體裂解效力評定 取對數(shù)生長期宿主菌，分別按MOI為0，0.01，0.10，1.00，10.00，100.00加入噬菌體并于37 ℃搖床(160 r/min)中培養(yǎng)，每組設置3個重復。分別于0 h和5 h時利用平板涂布法測定各組樣品中宿主菌的濃度，以觀察噬菌體的殺菌效力。

1.11 噬菌體宿主譜分析

采用點樣法，測定噬菌體對大腸桿菌的裂解活性。將31株來自江蘇地區(qū)3個不同豬養(yǎng)殖場的大腸桿菌菌株過夜培養(yǎng)，其中包括26株mcr-1陽性菌株，5株mcr-1陰性菌株，分別取100 μl菌液加入到1.2%固體培養(yǎng)基中，涂布棒涂布均勻，待菌液干后，取10 μl噬菌體懸液滴加到不同的平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜，觀察有無透亮斑出現(xiàn)。

2 結果與分析

2.1 噬菌體的分離純化及透射電鏡觀察

本試驗以mcr-1陽性大腸桿菌SQ-P-E32為宿主菌，經(jīng)過雙層平板法反復純化噬菌斑4～5次后便能得到純化的噬菌體，命名為vB-EcoP-32。其噬菌斑形態(tài)如圖1所示，噬菌體對宿主菌可形成圓形(直徑1～2 mm)、邊緣整齊無暈環(huán)的噬菌斑，屬于典型的裂解性噬菌體特征。

圖1 噬菌體vB-EcoP-32噬菌斑Fig.1 Plaques of bacteriophage vB-EcoP-32

2.2 噬菌體的透射電鏡形態(tài)

從透射電鏡圖(圖2)可見，噬菌體vB-EcoP-32頭部呈圓柱狀，長約100 nm，直徑約40 nm；其尾部較短，長約15 nm，直徑約10 nm。根據(jù)國際病毒分類學組織(International committee on taxonomy of viruses，ICTV)病毒分類第8次報告，可初步將vB-EcoP-32噬菌體歸類為短尾噬菌體科。

圖2 噬菌體vB-EcoP-32透射電鏡形態(tài) (Bar=100 nm)Fig.2 Transmission electron microscope of bacteriophage vB-EcoP-32 (Bar=100 nm)

2.3 噬菌體的基因組酶切分析

噬菌體vB-EcoP-32基因組僅能夠被DNase I消化，而不能夠被RNase A和Mung Bean Nuclease消化，說明該噬菌體基因組為雙鏈DNA。通過限制性核酸內(nèi)切酶EcoR I 和Hind Ⅲ對噬菌體基因組進行酶切(圖3)，根據(jù)酶切條帶與DNA marker的關系，初步估算該噬菌體基因組的分子量約為50 kb，其確切的分子量大小還需要通過全基因組測序才能確定。

泳道M1和M2分別為15 kb 和 2 kb Marker，泳道1為噬菌體vB-EcoP-32基因組，泳道2和3分別為噬菌體vB-EcoP-32基因組被EcoR I 和 Hind Ⅲ消化后的產(chǎn)物。圖3 噬菌體vB-EcoP-32基因組限制性內(nèi)切酶酶切圖譜Fig.3 Electrophoresis of bacteriophage vB-EcoP-32 genome digested with EcoR I and Hind Ⅲ

2.4 噬菌體最佳感染復數(shù)

3次重復試驗取平均值，由表1可知，當MOI=100.00時，噬菌體感染宿主后產(chǎn)生的子代噬菌體滴度為 1.2×1012PFU/ml，是所測的6個感染復數(shù)中最高的。因此，該噬菌體最佳感染復數(shù)為100.00。

表1噬菌體最佳感染復數(shù)的測定

Table1Determinationofoptionalmultiplicityofinfection

感染復數(shù)(PFU/CFU)子代噬菌體滴度(PFU/ml)1000．009．0×1011100．001．2×101210．008．4×10111．005．2×10110．104．0×10110．012．1×1011

2.5 噬菌體一步生長曲線的測定

由圖4可知，vB-EcoP-32噬菌體感染宿主菌的潛伏期約為5 min，爆發(fā)期約為55 min。在爆發(fā)期噬菌體的效價為 1.8×107，細菌的濃度為 5.5×105,噬菌體的裂解量約為32。

圖4 噬菌體一步生長曲線Fig.4 One-step growth curve

2.6 噬菌體熱穩(wěn)性

由圖5可知，噬菌體vB-EcoP-32經(jīng)30 ℃、40 ℃、50 ℃處理30 min和60 min后其效價基本較穩(wěn)定，能保持原活性。在60 ℃溫度下分別作用30 min和60 min后，其效價有所下降，但均能保持在106PFU/ml以上。經(jīng)70 ℃處理后噬菌體的效價明顯下降。經(jīng)80 ℃處理30 min后，噬菌體完全失活，說明高溫會嚴重影響噬菌體的活性。綜上，噬菌體在 30～60 ℃活性較穩(wěn)定。

圖5 溫度耐受能力Fig.5 Tolerance to temperatures

2.7 噬菌體pH值穩(wěn)定性

由圖6可知，當培養(yǎng)液pH值在5～10時，噬菌體效價較穩(wěn)定，基本上能保持原活性。當培養(yǎng)液的pH值小于5或pH值大于10時，噬菌體的活力會隨著酸性或堿性的增強而逐漸降低。當pH值小于3或者大于11時噬菌體完全失活。這說明過酸和過堿都會造成噬菌體活性降低，甚至使噬菌體完全失活。

圖6 酸堿的耐受能力Fig.6 Tolerance to acidity and alkalinity

2.8 噬菌體裂解效力

2.8.1 不同MOI值時細菌數(shù)量的動態(tài)曲線 由圖7可知，當MOI=0時，宿主菌培養(yǎng)液中不含噬菌體，該組樣品OD600隨著時間變化呈現(xiàn)明顯的指數(shù)型上升趨勢，最后趨于穩(wěn)定。表明該組細菌在無噬菌體存在的情況下呈指數(shù)型擴增，最后受環(huán)境限制而趨于穩(wěn)定。而當MOI為0.01、0.10、1.00、10.00、100.00時，各組OD600均呈先上升后下降最后趨于穩(wěn)定的趨勢。感染初期噬菌體對細菌生長影響較小，但隨著噬菌體的不斷復制,裂解細菌后，細菌的增殖逐漸受到抑制，最終各處理組細菌均逐漸趨于消亡。另外，當MOI值越大時，OD600下降到最低所需的時間越短，說明噬菌體對細菌的殺菌效果越明顯。本試驗中，MOI為100.00時，裂解效果最佳。

圖7 噬菌體裂解細菌的動態(tài)曲線Fig.7 Lytic kinetics of bacteriophage vB-EcoP-32

2.8.2 不同MOI值時噬菌體的殺菌效果 由圖8可得，對照組中細菌以MOI為0、0.01、0.10、1.00、10.00、100.00加入噬菌體并培養(yǎng)5 h后，各組培養(yǎng)液中細菌的數(shù)量較0 h均有所下降。處理5 h后，MOI值為0.01處理組中的細菌數(shù)量較對0 h下降了約0.80lg，MOI值為0.10處理組中的細菌數(shù)量較對0 h下降了約1.88lg，MOI值為1.00處理組中的細菌數(shù)量較對0 h下降了約3.33lg，MOI值為10.00處理組中的細菌數(shù)量較對0 h下降了約4.05lg,MOI值為100.00處理組中細菌數(shù)量較0 h下降了約5.60lg。隨著MOI值的增加，5 h時的細菌數(shù)量較0 h下降幅度逐漸增大，表明高濃度的噬菌體殺菌效果要優(yōu)于低濃度噬菌體。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖8 不同MOI值時噬菌體殺菌效果評價Fig.8 Value of sterilization ability of bacteriophage in different MOI

2.8.3 噬菌體的裂解譜 通過點樣試驗，發(fā)現(xiàn)噬菌體vB-EcoP-32能有效殺滅31株豬源大腸桿菌中的19株，殺菌率為61.3%，這19株豬源大腸桿菌有16株為mcr-1陽性大腸桿菌，其余3株為mcr-1陰性大腸桿菌，分別來源于豬場I(7株)、豬場II(5株)和豬場III(7株)3個養(yǎng)殖場，說明噬菌體vB-EcoP-32為寬宿主譜的大腸桿菌裂解性噬菌體，對豬源大腸桿菌(包括mcr-1陽性菌株)具有較好的殺滅作用。

3 討 論

3.1 噬菌體的分離與鑒定

噬菌體廣泛存在于自然界的土壤、廢水中，寄生于其對應的宿主菌中。因為噬菌體只能利用宿主菌中的營養(yǎng)物質進行生命活動，離開宿主菌后就不能生長和復制。在本研究中，分離純化初期的噬菌斑呈蠶噬狀、大小不一，表明此時培養(yǎng)基中還含有其他噬菌體[15]，但經(jīng)過數(shù)次純化后噬菌斑形態(tài)大小才變得較為一致。透射電鏡圖顯示該噬菌體尾長僅為15 nm，較張培東等[16]報道的尾長為100 nm的大腸桿菌噬菌體Bp6不同，其圓柱狀的頭部較代保英等[17]報道的多面體頭部的大腸桿菌噬菌體BpD也不同，說明不同地區(qū)分離的大腸桿菌噬菌體形態(tài)有所差異。通過透射電鏡圖顯示的噬菌體的外形特征，可初步判斷該噬菌體屬于短尾噬菌體科，并且其噬菌斑透亮、邊緣整齊，說明該噬菌體為裂解性噬菌體。根據(jù)該噬菌體基因組被DNase I、RNase A和Mung Bean Nuclease消化的情況，可判定該噬菌體為雙股DNA噬菌體。

3.2 噬菌體的生物學特性與裂解效力評價

不同的噬菌體，其生物學特性也不盡相同[18]，掌握特定噬菌體的生物學特性對于其相關的研究及應用具有重要的指導意義。最佳感染復數(shù)對于經(jīng)濟高效地獲得噬菌體產(chǎn)量具有重要指導意義。本研究中，噬菌體vB-EcoP-32對于其宿主菌的最高感染復數(shù)為100，與杜崇濤[19]報道的大腸桿菌0157的噬菌體DLS48(最佳MOI=0.1)和王禮偉等[20]報道的大腸桿菌噬菌體EcP10(最佳MOI=1.0)的結果相差較大。這可能是因為本研究中噬菌體屬于裂解性噬菌體中較為溫和的一類，其感染和復制的進程都較慢。Abedon等[21]提出，每一個細菌對噬菌體敏感度不一樣，每個噬菌體感染細菌的能力也不一樣，因此在噬菌體療法試驗中，不宜把MOI作為確定噬菌體最佳給藥劑量的唯一指標。

動物養(yǎng)殖上大量使用抗生素導致的耐藥細菌出現(xiàn)與流行對動物的健康養(yǎng)殖造成巨大威脅，而攜帶多黏菌素耐藥基因mcr-1的大腸桿菌的出現(xiàn)更是對公共衛(wèi)生和人類健康提出了嚴峻挑戰(zhàn)。相比于抗生素，噬菌體能高效殺滅特定細菌，且不影響正常菌群生長，而且噬菌體能有效規(guī)避因使用抗生素而造成的細菌耐藥性問題?；诖?，本研究分離了對mcr-1陽性大腸桿菌具有裂解性的噬菌體，通過研究其生物學特性，以期為mcr-1陽性大腸桿菌的防控提供新思路和有效的技術手段。本研究中噬菌體裂解細菌動態(tài)圖顯示，在加入噬菌體后，各處理組細菌數(shù)量下降明顯，而對照組居高不下，噬菌體添加濃度越大，其滅菌效率越高。研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌K88對應噬菌體K88-4[22]的MOI值為0.0 001時5 h內(nèi)細菌濃度下降4lg，MOI值為1時殺菌效果為100%。本研究中，當MOI值為100時相同時間內(nèi)細菌濃度下降了約5lg，并且細菌數(shù)量逐漸趨于穩(wěn)定。本研究中噬菌體對來自3個養(yǎng)殖場的31株豬源大腸桿菌殺菌率高達61.3%。該噬菌體的殺菌效果如此顯著，其對于開發(fā)耐藥細菌的噬菌體療法的意義不言而喻。但有學者[23]發(fā)現(xiàn)，自然界還存在著耐噬菌體的菌株，這也意味者噬菌體療法并不能一勞永逸。人類與致病菌的斗爭還將繼續(xù)，噬菌體療法還有待于進一步的研究與改進。

參考文獻:

[1] KARCH H, TARR P, BLELASZEWSKA M, et al. EnterohaemorrhagicEscherichiacoliin human medicine [J]. International Journal of Medical Microbiology Ijmm, 2005, 295(7): 405-418.

[2] STOJANOSKI V, SANKARAN B, PRASAD B V V, et al. Structure of the catalytic domain of the colistin resistance enzyme MCR-1 [J]. Bmc Biology, 2016, 14(1): 81-91

[3] BIALVAEI A Z, SAMADI K H. Colistin, mechanisms and prevalence of resistance [J]. Current Medical Research and Opinion, 2015, 31(4): 707-721.

[4] LANDMAN D, GEORGESCU C, MARTIN D A, et al. Polymyxins revisited [J]. Clinical Microbiology Reviews, 2008, 21(3): 449-465.

[5] LI J, RAYNER C R, NATION R L, et al. Heteroresistance to colistin in multidrug-resistantAcinetobacterbaumannii[J]. Antimicrobial Agents & Chemotherapy, 2006, 50(9): 2946-2950.

[6] KEMPF I, FLEURY M A, DRIDER D, et al. What do we know about resistance to colistin in Enterobacteriaceae in avian and pig production in Europe? [J]. International Journal of Antimicrobial Agents, 2013, 42(5): 379-383.

[7] LIU Y Y, WANG Y, WALSH T R, et al. Emergence of plasmid-mediated colistin resistance mechanism MCR-1 in animals and human beings in China: a microbiological and molecular biological study [J]. The Lancet Infectious Diseases, 2016, 16(2): 161-168.

[8] HU Y, LIU F, LIN I Y, et al. Dissemination of themcr-1 colistin resistance gene [J]. Lancet Infectious Diseases, 2015, 16(2): 146-147.

[9] H B. Phage therapy: theEscherichiacoliexperience [J]. Microbiology, 2005, 151(7): 2133-2140.

[10] 韓 晗，李雪敏，王 爽，等．噬菌體作抗菌劑使用的安全性評價研究進展[J]．江蘇農(nóng)業(yè)科學，2017，45(22)：18-23.

[11] SAMBROOK J, RUSSELL D W.分子克隆實驗指南[M].3版. 黃培堂，王恒梁，周曉巍譯.北京：科學出版社，2002.

[12] SUMMERS W C. Bacteriophage therapy [J]. Annual Review of Microbiology, 2001, 55(2): 437-451.

[13] LU Z, BREIDT F, FLEMING H, et al. Isolation and characterization of aLactobacillusplantarumbacteriophage, ΦJL-1, from a cucumber fermentation [J]. International Journal of Food Microbiology, 2003, 84(2): 225-235.

[14] WEISS B D, KESSEL M, BENSON S. Isolation and characterization of a generalized transducing phage forXanthomonascampestrispv. campestris [J]. Journal of Bacteriology, 1994, 176(11): 3354-3359.

[15] ADIBI M, MOBASHER N, GHASEMI Y, et al. Isolation, purification and identification ofE.coliO157 phage for medical purposes [J]. Trends in Pharmaceutical Sciences, 2017, 3(1): 43-48.

[16] 張培東,孫 巖,任慧英. 大腸桿菌的分離及其生物學特性 [J]. 中國獸醫(yī)雜志, 2008, 44(4): 10-12.

[17] 代保英. 大腸桿菌K88噬菌體的分離、分類初步鑒定和生物學特性的測定[D].揚州：揚州大學, 2009.

[18] 王 冉,韓 晗,張 輝. 大腸桿菌K88噬菌體的分離鑒定及其生物學特性 [J]. 華北農(nóng)學報, 2012, 27(4): 163-167.

[19] 杜崇濤. 大腸桿菌O157噬菌體的分離鑒定及其初步應用[D].吉林： 吉林大學，2008

[20] 王禮偉,梁 晏,屈勇剛. 一株雞源致病性大腸桿菌噬菌體的分離及其生物學特性 [J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報, 2014, 30(2): 455-457.

[21] ABEDON S T. Phage therapy pharmacology: calculating phage dosing[M].Elsevier Science & Technology, 2011,77(77):1-40.

[22] 韓 晗. 產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌噬菌體PK88-4的分離及其抗菌效果與安全性的研究[D].南京： 南京農(nóng)業(yè)大學，2011.

[23] PARK S C, SHIMAMURA I, FUKUNAGA M, et al. Isolation of bacteriophages specific to a fish pathogen,Pseudomonasplecoglossicida, as a candidate for disease control [J]. Applied & Environmental Microbiology, 2000, 66(4): 1416-1422.