范小燕， 楊 柳， 季英華， 任春梅， 繆 倩， 韓玉春， 章松柏， 程兆榜， 魯紅學(xué)

(1.長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，荊州 434025； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/江蘇省食品質(zhì)量安全重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培養(yǎng)基地，南京 210014； 3.海南出入境檢驗檢疫局熱帶植物隔離檢疫中心，?？?570311)

黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumbergreenmottlemosaicvirus, CGMMV)是一種重要的植物病毒，主要危害西瓜、黃瓜、葫蘆、甜瓜、絲瓜、苦瓜等葫蘆科作物，自1935年英國科學(xué)家Anisworth[1]首次在黃瓜上報道該病毒以來，歐洲、亞洲、南美洲、北美洲以及中東的30多個國家和地區(qū)陸續(xù)出現(xiàn)CGMMV產(chǎn)生危害的報道[2]，對當(dāng)?shù)毓瞎愖魑锷a(chǎn)造成了嚴(yán)重的威脅。CGMMV可以侵染多種葫蘆科作物，不同作物上的癥狀表現(xiàn)不盡相同，但都對作物產(chǎn)量和品質(zhì)影響極大[3-6]。在中國CGMMV于2005年在廣西觀賞南瓜上首次被發(fā)現(xiàn)[7]，目前已擴散至遼寧、河北、湖北、湖南、廣東、山東、江蘇、甘肅等地[8-10]。鑒于該病毒的危害性，2006 年中華人民共和國農(nóng)業(yè)部第788 號公告正式將 CGMMV 列入農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害生物名錄。

CGMMV是桿狀病毒科(Virgaviridae)煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)的重要成員，可通過帶毒種子、農(nóng)事操作、病殘體及授粉等多種方式傳播[11]，病毒粒子為大小約300 nm×18 nm的直桿狀顆粒，基因組全長約6 400 bp，兩端各有一個非編碼區(qū)，中間包括4個開放閱讀框(Opening read fragment，ORF)[12]，分別編碼17 300外殼蛋白(Coat Protein，CP)、29 000移動蛋白(Movement Protein，MP)、129 000和186 000復(fù)制蛋白[13-14]。

在黃瓜綠斑駁花葉病毒同屬(煙草花葉病毒屬)成員中，很多研究結(jié)果表明CP作為病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒顆粒的組裝過程中起著十分重要的作用，同時CP還參與了病毒運動，病毒致病過程中癥狀的形成，合成負(fù)鏈RNA過程中煙草花葉病毒(TMV)復(fù)制酶的位點識別，病毒復(fù)制復(fù)合物(Virus replication complexes, VRCs)的調(diào)控等[15-19]多項功能的行使，這些結(jié)果表明CP在病毒的侵染循環(huán)中起著重要作用。

CP是病毒結(jié)構(gòu)蛋白[20]，Park等[21]研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)CP基因的西瓜對CGMMV有較好抗性，Zhang等[22]研究發(fā)現(xiàn)CGMMV CP蛋白第96位氨基酸對病毒的侵染起重要作用，這些結(jié)果暗示CGMMV的CP蛋白可能參與了病毒侵染過程中的多項生命活動。因此，對CGMMV CP蛋白深入研究，將有助于了解其功能，揭示CGMMV致病機理，也為后續(xù)CGMMV的有效防控提供新的思路。

研究蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位有助于研究其功能[23]。Yang等[24]在研究番茄金色花葉病毒(Tomatogoldenmosaicvirus，TGMV)的AL2蛋白時發(fā)現(xiàn)，AL2在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均有分布，與其激活病毒轉(zhuǎn)錄及抑制寄主的基因沉默功能對應(yīng)。潘江杰[25]在研究水稻白化致死基因時，發(fā)現(xiàn)ABD基因定位于葉綠體中并參與了葉綠體發(fā)育、葉綠素合成降解及光合作用等調(diào)節(jié)，而突變體abd影響其葉綠體定位及功能，表現(xiàn)白化癥狀。姬金花[26]在研究佩梅病毒的PLP1基因功能時發(fā)現(xiàn)PLP1點突變會導(dǎo)致其編碼的蛋白質(zhì)無法在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中正確折疊并轉(zhuǎn)運，造成蛋白質(zhì)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞的特殊反應(yīng)，最終引發(fā)佩梅病。這些結(jié)果表明蛋白質(zhì)正常行使功能離不開其在細(xì)胞內(nèi)的特定分布特征，因此針對蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位展開研究也將有利于推動蛋白質(zhì)功能的解析。

本研究選擇近年來在中國瓜類作物上肆虐危害的CGMMV江蘇分離物作為研究對象，通過設(shè)計特異性的引物，克隆其CP基因的全長序列，并構(gòu)建帶有YFP標(biāo)簽的重組表達(dá)質(zhì)粒CP-YFP，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后在本氏煙(Nicotianabenthamiana)葉片表皮細(xì)胞中進(jìn)行瞬時表達(dá)，通過激光共聚焦顯微鏡觀察研究CGMMV編碼的CP蛋白的亞細(xì)胞定位特征，為后續(xù)CGMMV CP的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試CGMMV毒源為2012年采自江蘇洪澤的西瓜分離物[27]，Taq酶、pMD18-T 載體及限制性內(nèi)切酶均購自 TaKaRa 公司，大腸桿菌Trans10感受態(tài)購自北京全式金生物公司，農(nóng)桿菌GV3101為實驗室保存菌株，35S∶YFP載體由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)陶小榮教授惠贈，植物材料本氏煙為實驗室保存，種植于實驗室光照培養(yǎng)箱中。RNA提取試劑盒(Plant RNA Kit)購自O(shè)MEGA公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime ScriptTM1st strand cDNA Synthesis Kit)與T4 DNA連接酶購自寶生物工程(大連)有限公司，DNA 凝膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒購自愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司，羊抗兔 IgG及綠色熒光蛋白抗體(THETMGFP Antibody)購自南京金斯瑞生物科技有限公司，ECL Western Blotting Substrate顯色試劑盒購自上海天能科技有限公司，引物合成及序列測定均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。序列比對等分析處理采用Clustal X、Bioedit、DNAstar等軟件完成。

1.2 總RNA的提取及cDNA的合成

取0.1 g 病葉于液氮中速凍研磨，按試劑盒說明書提取總RNA。取500 ng RNA為模板，加入1 μl Oligo dT，1 μl 隨機引物和1 μl dNTP，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作獲取cDNA反應(yīng)產(chǎn)物于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 CP基因克隆及其序列分析

根據(jù)CGMMV基因組序列設(shè)計CP全長擴增引物CGCP_BH1F：CGGGATCCATGGCTTACAATCCGATCAC (含BamHⅠ酶切位點)和CGCPbr：CGGGATCCAGCTTTCGAGGTGGTAGC，以500 ng cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴增。反應(yīng)體系25 μl，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 45 s，52 ℃退火 45 s，72 ℃延伸1 min，30 個循環(huán)；最后72 ℃充分延伸 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，按膠回收試劑盒說明書操作回收目的片段，連接到 pMD18-T 載體并通過熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌Trans10 中，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含氨芐青霉素的LB平板，37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜至菌落長出，菌落PCR和酶切鑒定陽性克隆，經(jīng)測序驗證無誤后獲得陽性克隆pMD18T-CP用于后續(xù)試驗。

1.4 CP-YFP載體構(gòu)建

按照質(zhì)粒提取試劑盒說明書操作提取pMD18T-CP質(zhì)粒后進(jìn)行酶切，酶切體系：1 μlBamHⅠ，4 μl 10×T Buffer ，20 μl pMD18T-CP質(zhì)粒，ddH2O定容至40 μl。37 ℃酶切3 h。酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后膠回收試劑盒回收目的片段，將回收的目的片段通過T4連接酶連接到同樣經(jīng)BamH I酶切回收的線性化35S∶YFP載體，連接體系：目的片段回收產(chǎn)物7 μl ，1 μl T4 DNA 連接酶，1 μl 10×T4 DNA 連接酶緩沖液，1 μl 線性化35S∶YFP載體，16 ℃過夜連接。熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌Trans10，菌落PCR擴增和酶切鑒定陽性克隆，測序驗證無誤后獲得陽性克隆CP-YFP用于后續(xù)試驗。

1.5 CP亞細(xì)胞定位觀察

利用電擊法將構(gòu)建好的CP-YFP 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，以35S∶YFP空載體為對照，經(jīng)卡那霉素和利福平抗性平板篩選培養(yǎng)，最后通過菌落PCR 鑒定陽性克隆。

將轉(zhuǎn)入CP-YFP及35S∶YFP空載體的農(nóng)桿菌于含利福平及卡那霉素的液體培養(yǎng)基中，28 ℃，220 r/min，過夜培養(yǎng)至OD600為0.8～1.2；8 000 r/min 10 min收集菌體。用浸潤液(10 mmol/L 氯化鎂，10 mmol/L 2-嗎啉乙磺酸，100 μmol/L 乙酰丁香酮)將重組農(nóng)桿菌菌體懸浮至OD600約0.5，28 ℃避光靜置2 h，使農(nóng)桿菌復(fù)蘇[28]。選取4～6葉齡健康本氏煙葉片進(jìn)行浸潤，40 h后切取浸潤區(qū)本氏煙葉片于激光共聚焦顯微鏡(ZEIZZ LSM710)488 nm激發(fā)光下觀察目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況及其亞細(xì)胞定位特征。

細(xì)胞核染色采用DAPI法：在制好的玻片上滴加適量DAPI染液(100 ng/ml)，避光染色10 min，流水沖去染液，于激光共聚焦顯微鏡 360～400 nm激發(fā)光下觀察。

1.6 總蛋白質(zhì)抽提與免疫印跡試驗

浸潤處理40 h后，稱取 0.4 g浸潤區(qū)葉片，加入1 ml 0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS)，冰上研磨后轉(zhuǎn)移至離心管中，漩渦震蕩混勻，12 000 r/min離心15 min，取上清液，加入適量聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)5×上樣緩沖液，沸水煮10 min，-20 ℃保存。

取適量蛋白質(zhì)樣品于12% SDS-PAGE凝膠電泳分離，在電轉(zhuǎn)移緩沖液中通過濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)上(260 mA 恒流電泳1 h)，取出PVDF膜，用含0.05%Tween-20的磷酸鹽緩沖液(PBST)漂洗3次，每次5 min，將膜浸入封閉液中(5%脫脂奶粉)，120 r/min搖動封閉1 h，PBST漂洗3次，每次5 min，將GFP抗體以1∶5 000稀釋于PBST中，浸沒PVDF膜，4 ℃保溫過夜，PBST漂洗3次，每次5 min，將辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗以1∶2 000稀釋于PBST中，浸沒PVDF膜，室溫結(jié)合1 h，PBST漂洗3次后，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影。

2 結(jié)果與分析

2.1 CGMMV CP基因克隆

以病樣總RNA為模板，利用CGMMV外殼蛋白特異性引物CGCP_BH1F和CGCPbr 進(jìn)行RT-PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳分析擴增產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)有一條大小約500 bp的特異性條帶(圖1a)，與預(yù)期的目標(biāo)大小(486 bp)基本一致，說明該條帶就是本研究要擴增的目的基因條帶。利用DNA凝膠回收試劑盒回收該目的片段，將目的片段連接克隆載體pMD18-T，轉(zhuǎn)化Trans 10感受態(tài)細(xì)胞。利用菌落PCR及酶切驗證(圖1b)篩選陽性克隆，獲得的陽性克隆菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司測序驗證無誤后，從而獲得重組陽性質(zhì)粒pMD18T-CP。

2.2 序列特征分析

分析獲得的CGMMV江蘇分離物的CP基因堿基序列，發(fā)現(xiàn)其全長486 bp，編碼一個161個氨基酸大小約17 500的蛋白質(zhì)，與之前報道的江蘇分離物(KC852073)CP基因堿基序列完全一致(圖2)。

本研究對已報道的CGMMV其他分離物編碼的CP蛋白氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本研究獲得的CGMMV江蘇分離物編碼的CP蛋白氨基酸序列除與之前報道的江蘇分離物序列完全一致外，與中國山東分離物、遼寧分離物、廣西分離物、河北分離物、臺灣分離物的蛋白質(zhì)氨基酸序列都完全一致，不僅如此，它與印度分離物、韓國分離物、日本分離物及一個俄羅斯分離物(GQ495274)的序列也完全一致(圖2)。表明CGMMV編碼的CP蛋白是一個相對比較保守的蛋白質(zhì)，選用CGMMV江蘇分離物進(jìn)行研究具有很好的代表性。

a：CGMMV CP基因RT-PCR擴增；b：PMD18T-CP酶切驗證(Bam H I)。圖1 CGMMV編碼的CP基因RT-PCR擴增及克隆Fig.1 PCR amplification and cloning of CGMMV CP gene

圖2 CGMMV CP蛋白氨基酸序列分析結(jié)果Fig.2 The sequence analysis of CGMMV CP protein

2.3 CP-YFP載體構(gòu)建

利用基因克隆時引入的BamH I酶切位點，通過BamH I酶切pMD18T-CP獲得了兩條片段，其中一條大小在2 000 bp和3 000 bp之間(pMD18-T)，另一條大小約500 bp，與486 bp 的CP大小基本一致(圖1b)，利用DNA凝膠回收試劑盒回收大小約500 bp的CP片段，通過T4連接酶將該目的片段連接到BamHⅠ處理后純化回收的YFP空載體質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化Trans 10感受態(tài)細(xì)胞。鑒于CP基因是經(jīng)單酶切(BamH I)插入35S∶YFP載體，因此CP可以正向插入，亦可反向插入，為了保證插入方向正確，本研究在篩選陽性克隆時引入了一條位于35S啟動子區(qū)域的引物(35SF)，該引物與CP基因擴增引物的R端引物配對進(jìn)行菌落PCR篩選(圖3)，篩選到的陽性克隆進(jìn)一步進(jìn)行酶切鑒定(BamH I)，酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后，有大小兩條帶：一條大小在15 000 bp 左右(35S∶YFP載體)，另一條大小約500 bp，與CP目的片段大小一致。表明融合YFP標(biāo)簽的CP重組表達(dá)載體CP-YFP構(gòu)建成功。

a：CP-YFP載體構(gòu)建示意圖；b：CP-YFP酶切驗證；c：CP-YFP PCR驗證圖。圖3 CP-YFP載體構(gòu)建Fig.3 Construction of CP-YFP vector

2.4 CP蛋白亞細(xì)胞定位分析

將構(gòu)建好的CP-YFP質(zhì)粒通過電擊法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，經(jīng)浸潤液處理后接種本氏煙(Nicotianabenthamiana)葉片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)接種40 h后，浸潤CP-YFP的本氏煙葉片細(xì)胞中有明顯的熒光信號，熒光除了在細(xì)胞質(zhì)有分布外，在細(xì)胞核也疑似有分布，為了進(jìn)一步印證其在細(xì)胞核的分布，本研究采用DAPI處理細(xì)胞核后進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者在細(xì)胞核存在重合(圖4)。表明CP在本氏煙表皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核均有分布。

a：對照組YFP亞細(xì)胞定位；b：帶YFP標(biāo)簽的CP蛋白亞細(xì)胞定位(小圖示意CP在細(xì)胞核內(nèi)分布)。圖4 CP蛋白亞細(xì)胞定位Fig.4 Subcellular localization of CP protein

2.5 CP-YFP的表達(dá)檢測

為了進(jìn)一步印證CP-YFP在本氏煙葉片細(xì)胞中的表達(dá)，同時排除空載體等因素的干擾，本研究以GFP抗體為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗檢測本氏煙中YFP和CP-YFP的表達(dá)。Western-blot結(jié)果顯示，接種CP-YFP的本氏煙樣品在接近48 000處有特異性條帶出現(xiàn)，與預(yù)期的CP-YFP融合蛋白大小44 000基本吻合；而接種YFP的本氏煙樣品在 25 000～35 000有明顯條帶，與YFP大小27 000相吻合(圖5)。表明浸潤接種的CP-YFP在本氏煙葉片細(xì)胞中成功表達(dá)，同時也印證了激光共聚焦顯微鏡下觀察到的本氏煙葉片細(xì)胞中的熒光信號是由CP-YFP在煙草葉片中順利表達(dá)產(chǎn)生的。

圖5 免疫印跡法檢測YFP及CP-YFPFig.5 Detection of YFP and CP-YFP by Western blot

3 討 論

CGMMV是一種主要侵染葫蘆科作物的重要病毒，由于其對西瓜、黃瓜等作物造成的嚴(yán)重?fù)p失，已被世界多個國家和地區(qū)列為檢疫性有害生物，成為困擾產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要因素之一。本研究選擇2012年采自江蘇洪澤的CGMMV西瓜分離物作為研究對象，對其CP基因進(jìn)行了克隆和序列測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CP基因全長486，編碼一個17 500的蛋白質(zhì)，與中國山東、遼寧、廣西、河北、臺灣等其他分離物序列完全一致(序列相對保守)，為進(jìn)一步研究其亞細(xì)胞定位特征，本研究構(gòu)建了帶有YFP熒光標(biāo)簽的重組表達(dá)載體CP-YFP，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后浸潤接種本氏煙，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CP在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中均有分布，為后續(xù)進(jìn)一步研究CGMMV CP功能奠定了基礎(chǔ)。

在煙草花葉病毒屬典型成員TMV的研究中也有報道顯示CP在細(xì)胞質(zhì)有分布，如早年Martin[29]在研究TMV時發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)存在大量病毒粒子，而CP是TMV的結(jié)構(gòu)蛋白，暗示了CP在細(xì)胞質(zhì)有分布。Hills[30]在利用免疫膠體金技術(shù)研究TMV編碼蛋白質(zhì)定位時證實CP在細(xì)胞質(zhì)有分布。Bendahmane等[31]在利用BY-2原生質(zhì)體研究TMV時，也發(fā)現(xiàn)CP在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有分布。彭浩然等[32]在利用激光共聚焦顯微鏡研究番茄花葉病毒(ToMV)編碼的CP蛋白時發(fā)現(xiàn)CP在細(xì)胞質(zhì)有分布，由于煙草花葉病毒屬內(nèi)很多病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、組裝等一系列重要的生命活動大都是在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)完成的[33-35]，因此CP的細(xì)胞質(zhì)定位特征與這些功能研究結(jié)果相吻合。在本研究確定CGMMV編碼的CP在細(xì)胞質(zhì)中有分布，暗示了CGMMV編碼的CP在細(xì)胞質(zhì)中可能參與了這些功能的行使。

本研究結(jié)果表明，CGMMV編碼的CP除了在細(xì)胞質(zhì)有分布外在細(xì)胞核也有分布，而在同屬TMV的研究中，Honda等[36]在利用電鏡觀察病樣切片時發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核中存在病毒粒子形成的聚合體。Hirai等[37]在研究TMV侵染特征時發(fā)現(xiàn)在TMV侵染早期(6～18 h)，病毒外殼蛋白會在細(xì)胞核中積累。Reddi[38]在研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象。杜利娟[39]在利用激光共聚焦顯微鏡研究TMV及TuMV編碼的CP蛋白亞細(xì)胞定位時發(fā)現(xiàn)二者在寄主細(xì)胞核也有分布。這些結(jié)果表明病毒的CP在細(xì)胞核也有分布，但是CP在細(xì)胞核內(nèi)的功能目前還未見相關(guān)報道，因此針對其核定位特征研究其相關(guān)功能，可能有助于更深入解析病毒的致病機理，為病毒的有效防控提供新的思路。

參考文獻(xiàn)：

[1] ANISWORTH G C. Mosaic disease of cucumber[J]. Annals of Applied Biology, 1935, 22(1): 55-67.

[2] 陳思宏,于湧鑫,倪運東,等.黃瓜綠斑駁花葉病毒病對西瓜的危害與綜合防控技術(shù)[J].農(nóng)業(yè)災(zāi)害研究, 2012, 2(11):10-12.

[3] 鐘 敏,趙緒生,何乙坤,等.黃瓜綠斑駁病毒河北分離物外殼蛋白基因序列分析及其分組[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2015，38(1): 92-97.

[4] 樂福明,葉建人.大棚黃瓜綠斑駁花葉病毒病的發(fā)生與控制[J].中國農(nóng)技推廣,2013,29(5):44-45.

[5] 江 冬.黃瓜綠斑駁花葉病毒病癥狀識別與監(jiān)測方法[J].農(nóng)業(yè)科技通訊, 2010(10):200-201.

[6] MORENO I, THOMPSON J, GARCIA-ARENAL F. Analysis of the systemic colonization of cucumber plants by cucumber green mottle mosaic virus[J]. Journal of General Virology, 2004,85 (3): 749-759.

[7] 秦碧霞,蔡健和,劉志明,等.侵染觀賞南瓜的黃瓜綠斑駁花葉病毒的初步鑒定[J].植物檢疫, 2005, 19(4):198-200.

[8] 潘亞南,韓 劍,吳海波,等.新疆哈密瓜病毒的DAS-ELISA檢測和分子鑒定[J].園藝學(xué)報,2016,43(6):1107-1116.

[9] 陳紅運,趙文軍,程 毅,等.遼中地區(qū)西瓜花葉病病原的分子鑒定[J].植物病理學(xué)報, 2006, 36(4):306-309.

[10] 程兆榜,任春梅,繆 倩,等.江蘇黃瓜綠斑駁花葉病毒的發(fā)生和防治[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 41(2):114-117.

[11] 孫玉靈.黃瓜綠斑駁花葉病毒病綜合防治技術(shù)[J].新農(nóng)業(yè), 2014(21):34-36.

[12] CULVER J N, LINDBECK A G C, DAWSON W O. Virus-host interactions: induction of chlorotic and necrotic responses in plants by tobamoviruses[J]. Annual Review of Phytopathology, 1991, 29(4):193-217.

[13] KIM S M, NAM S H, LEE J M, et al. Destruction of cucumber green mottled mosaic virus by heat treatment and rapid detection of virus inactivation by RT-PCR[J]. Molecules and Cells, 2003, 16(3):338-342.

[14] WANG H, STUBBS G. Structure determination of cucumber green mottle mosaic virus by X-ray fiber diffraction: significance for the evolution of tobamoviruses[J]. Journal of Molecular Biology, 1994,239 (3): 371-384.

[15] BENDAHMANE M, SZECSI J, CHEN I, et al. Characterization of mutant tobacco mosaic virus coat protein that interferes with virus cell-to-cell movement[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2002, 99(6): 3645-3650.

[16] REINERO A, BEACHY R N. Reduced photosystem II activity and accumulation of viral coat protein in chloroplasts of leaves infected with tobacco mosaic virus[J]. Plant Physiology, 1989, 89(1): 111-116.

[17] GALLIC D R, WALBOT V. RNA pseudoknot domail of tobacco mosaic virus can functionally substitute for a poly(A) tail in plant and animal cells[J]. Genes & Development, 1990, 4(7): 1149-1157.

[18] ASURMENDI S, BERG R H, KOO J C, et al. Coat protein regulates formation of replication complexes during tobacco mosaic virus infection[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2004, 101(5):1415-1420.

[19] 劉 錦，李亦晴，黃顯德，等. 黃瓜綠斑駁花葉病毒外殼蛋白基因 原核表達(dá)及抗血清制備[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，49(5)：10-13.

[20] SANO Y, INOUE H, KAJIWARA K, et al. Structural analysis of A-protein of cucumber green mottle mosaic virus and tobacco mosaic virus by synchrotron small-angle X-ray scattering[J]. Journal of Protein Chemistry, 1997, 16(2): 151-159.

[21] PARK S M, LEE J S, JEGAL S, et al. Transgenic watermelon rootstock resistant to CGMMV (cucumber green mottle mosaic virus) infection[J]. Plant Cell Reports, 2005, 24(6): 350-356.

[22] ZHANG Z, LIU L, WU H, et al. The 96th amino acid of the coat protein of cucumber green mottle mosaic virus affects virus Infectivity[J]. Viruses, 2017, 10(1):1-11.

[23] EMANUELSSON O, VON H G. Prediction of organellar targeting signals[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2001, 1541(1/2): 114-119.

[24] YANG X, BALIJI S, BUCHMANN R C, et al. Functional modulation of the geminivirus AL2 transcription factor and silencing suppressor by self-interaction[J]. Journal of Virology, 2007, 81(21): 11972-11981.

[25] 潘江杰.水稻白化致死基因的精細(xì)定位及功能分析[D]. 杭州:杭州師范大學(xué), 2015.

[26] 姬金花.佩梅病的PLP1基因突變蛋白亞細(xì)胞定位研究[D]. 太原:山西醫(yī)科大學(xué), 2013.

[27] 任春梅,程兆榜,繆 倩,等.江蘇黃瓜綠斑駁花葉病毒的鑒定[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報,2013,29(1):65-70.

[28] SPARKES I A, RUNIONS J, KEARNS A, et al. Rapid, transient expression of fluorescent fusion proteins in tobacco plants and generation of stably transformed plants[J]. Nature Protocols, 2006, 1 (4): 2019-2025.

[29] MARTIN L F, MCKINNEY H H. Tobacco-mosaic virus concentrated in the cytoplasm[J]. Science, 1938, 88(2289): 458-459.

[30] HILLS G J, PLASKITT K A, YOUNG N D, et al. Immunogold localization of the intracellular sites of structural and nonstructural tobacco mosaic virus proteins[J]. Virology, 1987, 161(2):488-496.

[31] BENDAHMANE M, CHEN I, ASURMENDI S, et al. Coat protein-mediated resistance to TMV infection ofNicotianatabacuminvolves multiple modes of interference by coat protein[J]. Virology, 2007, 366(1):107-116.

[32] 彭浩然,蒲運丹,張永至,等.ToMV外殼蛋白互作IP-L蛋白的亞細(xì)胞定位及表達(dá)分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2017, 50(17):3344-3351.

[33] CHRISTENSEN N, TILSNER J, BELL K, et al. The 5′ cap of tobacco mosaic virus (TMV) is required for virion attachment to the actin/endoplasmic reticulum network during early infection[J]. Traffic, 2009, 10(5): 536-551.

[34] HIRAI A, WILDMAN S G. Intracellular site of assembly of TMV-RNA and protein[J]. Virology, 1967, 33(3): 467-473.

[35] GALLIE D R, FEDER J N, SCHIMKE R T, et al. Functional analysis of the tobacco mosaic virus tRNA-like structure in cytoplasmic gene regulation[J]. Nucleic Acids Research, 1991, 19(18): 5031-5036.

[36] HONDA Y, MATSUI C. Occurrence of tobacco mosaic virus within the nucleus[J]. Virology, 1969, 39(3): 593-595.

[37] HIRAI T, HIRAI A. Tobacco mosaic virus: cytological evidence of the synthesis in the nucleus[J]. Science, 1964, 145(3632): 589-591.

[38] REDDI K K. Studies on the formation of tobacco mosaic virus ribonucleic acid. V. presence of tobacco mosaic virus in the nucleus of the host cell[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1964, 52(2): 397-401.

[39] 杜利娟.六種病毒外殼蛋白亞細(xì)胞定位及對煙草抗性影響的比較分析[D]. 重慶:西南大學(xué), 2016.