張馨月，田萬年

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動物科技學(xué)院，吉林 吉林 132101）

在動物肌細(xì)胞中肌動蛋白占總蛋白的10%，是肌細(xì)胞中最豐富的蛋白質(zhì)［1］。肌動蛋白由375個氨基酸殘基組成，蛋白分子量為43 kDa，具有1個高度保守的基因編碼。骨骼肌α-肌動蛋白1（actin alpha 1，ACTA1）主要參與骨骼肌纖維的發(fā)育，在骨骼肌的活動中發(fā)揮重要作用［2］。 Shin 等［3］研究發(fā)現(xiàn)，ACTA1基因在韓牛高、低大理石花紋等級牛肉中差異表達(dá)，提示該基因可能是參與脂肪沉積的重要基因之一。Lee等［4］研究表明，ACTA1基因在不同月齡的韓牛背最長肌中差異表達(dá)，說明該基因可能是參與調(diào)控牛肉質(zhì)性狀的重要基因之一。為了深入探討牛ACTA1基因的生物學(xué)功能，該研究采用RT-PCR技術(shù)對延邊黃牛ACTA1基因進(jìn)行了克隆，利用生物信息學(xué)方法對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測和分析，同時構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，以期為深入研究該基因的理化性質(zhì)及相關(guān)生物學(xué)功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

延邊黃牛由吉林省琿春市某牧場提供。屠宰后采取背最長肌，一部分置于液氮中速凍，-70℃保存。

1.2 總RNA的提取及cDNA合成

采集牛背最長肌樣本，按Trizol提取說明書提取總RNA，用紫外分光光度計檢測RNA提取量和純度，使其A260/A280在1.8～2.0。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。cDNA總反應(yīng)體系為：M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶 1 μL、Oligo（dT15）2 μL、dNTP （2.5 mmol/L）1 μL、10 ×buffer 4 μL、RNase Inhibitor 0.5 μL、RNA 2 μg。

1.3 引物的設(shè)計與PCR擴增

根據(jù)已發(fā)表的牛ACTA1基因序列設(shè)計1對引物，上游引物序列為：5′-ATGTGTGACGAAGACGAGACCA-3′， 下游引物序列為：5′-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACG-3′，目的擴增片段大小為1 134 bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

PCR反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性 30 s，58℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，35個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收純化PCR產(chǎn)物，送至上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定。

1.4 ACTA1基因的生物信息學(xué)分析

將牛ACTA1基因測序結(jié)果進(jìn)行拼接。采用在線軟件SignalP Server預(yù)測其信號肽；采用DNAMAN軟件分析其編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹；利用在線軟件Prosite對其編碼蛋白質(zhì)的功能進(jìn)行預(yù)測；利用NCBI的CDD數(shù)據(jù)庫進(jìn)行編碼蛋白質(zhì)保守區(qū)域的預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛ACTA1基因的克隆和序列分析

以牛背最長肌提取總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴增，擴增產(chǎn)物大小為1 134 bp（見圖1）。擴增產(chǎn)物回收純化后進(jìn)行序列測定，測得的延邊黃牛ACTA1基因與GenBank中牛NM_174225序列相似性為99.9%。

圖1 牛ACTA1基因PCR擴增結(jié)果

2.2 牛ACTA1基因生物信息學(xué)分析

采用DNAMAN軟件對延邊黃牛ACTA1基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行預(yù)測分析。結(jié)果表明，該基因編碼的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量約為42.12 kDa，等電點為5.16，為酸性蛋白質(zhì)；利用CLUATAL W比對表明，牛ACTA1蛋白的氨基酸序列與豬 （GenBank accession no.：XP-003121682）、雞 （GenBank accession no.：NP-001026400）、 犬 （GenBank accession no.：XP-838060）、小鼠 （GenBank accession no.：BAE40656）、黑猩 猩（GenBank accession no.：XP-002831777） 和 人 （GenBank accession no.：BAF83305）的氨基酸序列的相似性為99%。

采用在線軟件ORF Finder分析，該基因的最大開放閱讀框為1 134 bp，編碼了377個氨基酸。經(jīng)在線軟件SignalP Server分析，該蛋白無信號肽序列，為非分泌性蛋白。Prosite分析顯示，ACTA1蛋白可能存在1個cAMP和cGMP依賴的蛋白激酶磷酸化位點，4個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點，8個豆蔻?；稽c，2個酪氨酸激酶磷酸化位點，5個蛋白激酶C磷酸化位點。經(jīng)過BlastP分析表明，該蛋白質(zhì)序列存在1個ACTIN保守的結(jié)構(gòu)域（見圖2）。

圖2 牛ACTA1蛋白保守結(jié)構(gòu)域

圖3 基于ACTA1基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

利用GenBank數(shù)據(jù)庫已收錄的ACTA1基因序列：小鼠（Mus musculus，GenBank accession no.：AK027919）、 褐家鼠 （Rattus norvegicus，GenBank accession no.：FQ215809）、 野豬 （Sus scrofa，Gen-Bank accession no.：NM001167795）、犬 （Canis familiaris，GenBank accession no.：XM-843847）、猩猩（Pongo abelii，GenBank accession no.：NM-001132414）、人（Homo sapiens，GenBank accession no.：BC012597）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果見圖3。由圖3可知，牛ACTA1基因（A4-Cattle）單獨處于一分支，人和猩猩處于一分支，鼠和人的親緣關(guān)系較近。

3 討論

目前，對ACTA1基因的研究主要集中在該基因突變與人骨骼肌先天性疾病和橫紋肌疾病的相關(guān)性方面，但其具體功能研究較少［5-8］。研究表明，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)決定其功能特性，從而影響生命活動。該研究結(jié)果顯示，牛ACTA1基因的CDS序列全長1 134 bp，編碼377個氨基酸，該蛋白無信號肽序列，為非分泌性蛋白。應(yīng)用生物信息學(xué)方法對其序列及編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析和預(yù)測，結(jié)果表明，ACTA1蛋白可能存在1個cAMP和cGMP依賴的蛋白激酶磷酸化位點，4個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點，8個豆蔻酰化位點，2個酪氨酸激酶磷酸化位點，5個蛋白激酶C磷酸化位點。經(jīng)過BlastP分析表明，該蛋白質(zhì)序列存在1個ACTIN保守的結(jié)構(gòu)域。

系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，牛ACTA1基因單獨處于一個進(jìn)化分支，而人和猩猩處于一個進(jìn)化分支，親緣關(guān)系較近，整個關(guān)系與真實物種間進(jìn)化順序相符。對不同物種的ACTA1蛋白序列進(jìn)行比對，結(jié)果表明，牛ACTA1蛋白的氨基酸序列與人、小鼠、豬和犬的氨基酸相似性為99%，進(jìn)一步說明ACTA1比較保守。該研究對牛ACTA1基因的理化性質(zhì)及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)功能進(jìn)行了預(yù)測，為進(jìn)一步揭示該基因參與牛肉質(zhì)性狀調(diào)控的分子機制提供了理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

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