胡爭波，李文虎，袁艾東，張浩波，藍文興，賴勇斌，伍鵬歡，陳 錚

［南方醫(yī)科大學附屬韶關(guān)醫(yī)院骨科（韶關(guān)市第一人民醫(yī)院骨科），廣東韶關(guān)512000］

0 引言

四肢軟組織感染創(chuàng)面，尤其是亞急性、慢性感染創(chuàng)面一直是臨床治療的棘手問題［1－2］。在三甲醫(yī)院幾乎都專門開設(shè)創(chuàng)面治療中心來處理這一類患者。傳統(tǒng)的治療方法是多方面的，包括分泌物培養(yǎng)加藥敏試驗指導針對性抗生素治療，創(chuàng)面清創(chuàng)手術(shù)、創(chuàng)面負壓吸引、傷口換藥和中醫(yī)藥治療等［3－7］。 總體上，非急性感染創(chuàng)面的傳統(tǒng)治療往往需要長時間住院和門診換藥，但治療效果依舊不理想，嚴重影響了患者的生活質(zhì)量，也給社會和家庭帶來了沉重負擔。因此，臨床醫(yī)護人員也在不停探索新的治療方法或輔助治療方法。隨著PRP在骨科臨床上的應(yīng)用，富血小板血漿（platelet?rich plasma，PRP）對骨與軟組織病損具有很強的修復(fù)作用［8－9］，而且既往研究還發(fā)現(xiàn)含白細胞的 PRP具有抗菌、降低感染率的作用［10－11］。 另外，血液單核細胞來源于骨髓，是尚未成熟的骨髓基質(zhì)干細胞，不僅具有干細胞潛能，也因內(nèi)含非異性酯酶而具有很強的吞噬作用［12－13］。 因此，臨床上專門針對非急性感染性創(chuàng)面，制備含單核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PMBC）自體 PRP，與傳統(tǒng)治療方法結(jié)合應(yīng)用。現(xiàn)將其與單純自體PRP和傳統(tǒng)治療病例進行回顧性對比分析，評價其治療作用和臨床應(yīng)用價值。

1 資料和方法

1.1 一般資料收集2015年4月～2017年10月收治的四肢非急性感染性創(chuàng)面病例進行回顧性分析（表 1）。

1.2 病例入選標準住院病例為創(chuàng)傷后感染且病程超過1個月，創(chuàng)面分泌物細菌培養(yǎng)陽性，血培養(yǎng)陰性，有炎癥指標（白細胞計數(shù)、血沉、超敏C反應(yīng)蛋白和降鈣素原等）檢查和復(fù)查的病例。

1.3 病例排除標準患有腫瘤、血小板功能異常、嚴重貧血、精神病、血液病、纖維蛋白合成障礙、嚴重心肺功能不全、嚴重肝腎功能不全、服用免疫抑制劑、感染急性期、骨髓炎的病例。

1.4 治療方案與分組非PRP治療組：通過單純傳統(tǒng)治療方法如分泌物培養(yǎng)加藥敏試驗指導針對性抗生素治療，創(chuàng)面清創(chuàng)手術(shù)、創(chuàng)面負壓吸引、傷口換藥和中醫(yī)藥治療等。自體PRP治療組：在傳統(tǒng)治療的基礎(chǔ)上，應(yīng)用自體PRP治療。含PBMC自體PRP治療組：在傳統(tǒng)治療的基礎(chǔ)上，應(yīng)用含PBMC自體PRP治療。

1.5 自體PRP和含PBMC自體PRP的制備方法

自體PRP和含PBMC自體PRP由冠昊生物科技股份有限公司專業(yè)技術(shù)人員按照Aghaloo兩次離心法制備［14］，所有操作均為兩人配合，一人操作，一人輔助在同一實驗利用相同的儀器設(shè)備完成。每27 mL靜脈血加入3 mL枸櫞酸鈉抗凝劑制備3 mL自體PRP或含PBMC自體PRP注射劑或凝膠。

1.6 觀察指標通過觀察患者治療前、后首次復(fù)查的炎癥指標包括白細胞計數(shù)（WBC）、全血紅細胞沉降率（ESR）、超敏 C 反應(yīng)蛋白（hs?CRP）、降鈣素原（PCT）、白／球蛋白比（A／G），以及病原體構(gòu)成、抗生素使用種類和時間、住院時間、住院總費用、創(chuàng)面愈合時間和創(chuàng)面臨床愈合出院率等指標分析評價含PB?MC自體PRP在四肢軟組織感染創(chuàng)面中的臨床效果和價值。創(chuàng)面臨床愈合標準定義為創(chuàng)面面積縮小＞75%，且連續(xù)3次創(chuàng)面分泌物培養(yǎng)陰性。隨訪至創(chuàng)面達到臨床愈合標準。

1.7 統(tǒng)計學處理采用SPSS19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料中，三組比較用單因素方差分析，兩組數(shù)據(jù)比較使用t檢驗，計數(shù)資料用卡方檢驗，取P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況比較三個病例組在性別、年齡、體重指數(shù)、疼痛評分等方面差異無統(tǒng)計學意義（表1）。其病原體均為耐藥菌屬，G＋／G?構(gòu)成比差異無統(tǒng)計學意義（圖 1）。

表1 各治療組一般資料比較情況

圖1 非PRP治療組、自體PRP治療組和含PBMC自體PRP治療組病原體構(gòu)成

2.2 治療效果與應(yīng)用價值評價三組病例在治療前各炎癥指標無明顯差異（表2，圖2A～E），而在治療后首次復(fù)查時，WBC（圖2A）和ESR（圖2B）差異無統(tǒng)計學意義（FWBC＝ 0.01005，PWBC＝ 0.9900；FESR＝0.4578，PESR＝0.9553）；hs?CRP（圖 2C）、PCT（圖 2D）和A／G（圖 E）有明顯改善，差異有統(tǒng)計學意義（Fhs?CRP＝ 15.17，Phs?CRP＜ 0.001； FPCT＝ 7.676，PPCT＝0.009；FA／G＝ 6.087，PA／G＝ 0.0034）；含 PBMC 自體PRP組較非PRP組、自體PRP組改善更明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表 2）。

表2 各組病例治療前、后首次復(fù)查的炎癥指標比較

圖2 非PRP治療組、自體PRP治療組和含PBMC自體PRP治療組在治療前和治療后首次復(fù)查時的炎癥指標比較

在創(chuàng)面愈合時間上，非PRP組、自體PRP組和含PBMC 自體 PRP 組愈合時間分別為（38.0±30.8）d、（36.1±25.0）d、（28.7±17.2）d，后兩組創(chuàng)面愈合時間短，但差異無統(tǒng)計學意義（圖 3A，F(xiàn)＝1.038，P＝0.3588）。 三組的抗生素使用種類依次分別為（3.36±1.1）、（3.34±0.9）、（3.19±1.04），差異無統(tǒng)計學意義（圖 3B，F(xiàn)＝0.2289，P＝0.7959）；其抗生素使用時間分別為（21.2±6.7）d、（18.3±6.5）d、（15.9±6.4）d，差異有統(tǒng)計學意義（圖 3C，F(xiàn)＝4.835，P＝0.0103）。 三組手術(shù)次數(shù)依次為（3.09±1.18）、（2.79±1.01）、（2.74±1.02），后兩組手術(shù)次數(shù)相對較少，但差異無統(tǒng)計學意義（圖3D，F(xiàn)＝0.9353，P＝0.3965）。 三組的平均住院時間分別為（49.7±18.8）d、（41.7±18.4）d、（32.3±12.9）d，差異有統(tǒng)計學意義（圖 3E，F(xiàn)＝7.517，P＝0.001）。 三組的創(chuàng)面愈合出院率分別為 66.67%（22／33）、78.57%（22／28）、80.77%（21／26），自體 PRP 組和含 PBMC自體PRP組較高，但差異無統(tǒng)計學意義（圖3F，F(xiàn)＝1.8562，P ＝ 0.3953）。 三組患者住院總費用依次為（4.63±1.56）萬元、（4.20±1.60）萬元、（3.57±0.77）萬元，自體PRP組和含PBMC自體PRP組較少，差異有統(tǒng)計學意義（圖 3G，F(xiàn)＝4.248，P＝0.0175）。 三組病例均未出現(xiàn)感染擴散、敗血癥、創(chuàng)面惡化等情況。

圖3 非PRP治療組、自體PRP治療組和含PBMC自體PRP治療組在臨床應(yīng)用價值方面的比較

2.3 含PBMC自體PRP治療非急性感染性創(chuàng)面的典型病例例1：女性患者，88歲，車禍傷后致使右側(cè)下肢多處軟組織挫裂傷病壞死感染。創(chuàng)面經(jīng)含PB?MC自體PRP治療后2次，第2次治療2周后創(chuàng)面完全愈合（圖4）。

圖4 含PBMC自體PRP治療非急性感染創(chuàng)面典型病例1

例2：男性患者，36歲，因玻璃墜落割傷右側(cè)跟腱斷裂，后發(fā)生創(chuàng)面感染，經(jīng)過含PBMC自體PRP注射治療1次，2周后，創(chuàng)面達臨床愈合（圖5）。

圖5 含PBMC自體PRP治療非急性感染創(chuàng)面的典型病例2

3 討論

創(chuàng)面感染，尤其是亞急性、慢性感染，多為低毒性感染，病原體多為耐藥菌屬［4，7］。 創(chuàng)面常常經(jīng)久不愈合，有時甚至出現(xiàn)惡性轉(zhuǎn)化，危害較大［15－16］。 傳統(tǒng)的治療時間長，往往需要多次清創(chuàng)手術(shù)并結(jié)合負壓吸引［2，4］。創(chuàng)面愈合其實是一種組織再生過程，這個過程需要有干細胞和生長因子參與［6］。臨床上，慢性創(chuàng)面難以愈合的原因很多，與患者自身營養(yǎng)狀態(tài)、免疫力、病原體毒性以及創(chuàng)面的組織結(jié)構(gòu)、血液循環(huán)等情況密切相關(guān)［6－7，17］，而生長因子缺乏是創(chuàng)面難以愈合的重要原因之一［17－18］。另一方面，導致慢性炎癥的病原體多為低毒性病原體感染，免疫原性不強，同時機體免疫細胞常常難以到達病原體，以至于創(chuàng)面經(jīng)久不愈［6－7］。本研究中，病例大部分的病原體也是低毒性但卻耐藥的細菌，因此，傳統(tǒng)治療效果一般。

PRP 中包含了高濃度的細胞生長因子［10－11］，而外周血單個核細胞主要成份包括白細胞、吞噬細胞、樹突狀細胞和骨髓基質(zhì)干細胞［19］，這些成份為組織修復(fù)和抗感染提供了傳統(tǒng)治療方法無法具備的必要條件。血小板激活后，大量生長因子釋放，除了其本身能夠促進組織細胞再生、血管增生和上皮化以修復(fù)創(chuàng)面［20－21］，還可以通過趨化因子幫助中性粒細胞和免疫細胞生成活性氧化代謝產(chǎn)物，抑制或殺滅病原體，吸收壞死組織，為組織細胞遷徙提供空間和條件［22－23］。單核細胞中有含有骨髓來源的基質(zhì)干細胞，他們具有多向分化潛能，能夠在特定細胞分化因子和生長因子調(diào)節(jié)下演化為血細胞和組織細胞，分泌相關(guān)生物蛋白，為創(chuàng)面的修復(fù)提供種子細胞和生物材料［22－24］。另一方面，單核細胞的存在為血小板生長因子的激活提供了更好的局部環(huán)境［22－24］。

應(yīng)用PRP治療各種創(chuàng)面的療效在國內(nèi)外早已證實［11，18］，其起效機制也有研究，主要是通過含高濃度的生長因子，并且各種生長因子的所占比例與自體內(nèi)的比例基本一致，其安全性也是肯定的。在臨床應(yīng)用中，我們首次結(jié)合了血液中的單核干細胞一起應(yīng)用于非急性感染創(chuàng)面。本研究結(jié)果表明，與非PRP治療組相比，應(yīng)用PRP治療后，各炎癥指標WBC、hs?CRP、ESR、PCT、A／G 等在治療后首次復(fù)查時，hs?CRP、PCT和A／G恢復(fù)更好，WBC、ESR則無明顯差異。表明這可能與PRP、PBMC在創(chuàng)面局部發(fā)揮抑制炎癥和抗菌作用有關(guān)，未引起全身性的生理病理反應(yīng)。這也進一步證實了PRP的抗炎作用，以及治療的安全性。因為血液中的hs?CRP和PCT主要由細菌內(nèi)毒性引起的機體應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生，他們直接反應(yīng)創(chuàng)面局部的炎癥情況。A／G比例趨于好轉(zhuǎn)，可能與自身免疫狀態(tài)、住院期間患者營養(yǎng)得到改善有關(guān)。Hs?CRP是反應(yīng)組織損傷和恢復(fù)的敏感指標［25］。PCT是一種新的炎性介質(zhì)，是用于檢測細菌感染所致炎性反應(yīng)的較好指標之一，對于病毒感染、腫瘤、自身免疫性疾病及局部感染患者，PCT水平維持在正常范圍內(nèi)或者有輕度升高。隨著感染性疾病嚴重程度的增加，PCT水平也明顯升高，經(jīng)有效抗菌藥物治療后，PCT水平迅速下降［26－27］。這兩種感染標志物與患者的創(chuàng)面預(yù)后密切相關(guān)。

體外實驗［11］也表明PRP對細菌有明顯的抑制作用。當細菌的炎癥反應(yīng)被PRP有效抑制后，hs?CRP和PCT這兩個炎癥指標首先得到改善；而WBC、ESR是炎癥引起的一個后續(xù)全身性的反應(yīng)。之所以這三項指標在首次復(fù)查時非PRP組與自體PRP組患者恢復(fù)的差異不明顯，可能與患者長期處于慢性炎癥狀態(tài)有關(guān)。最終的結(jié)果表明，應(yīng)用了自體PRP的病例組愈合時間更短，創(chuàng)面達到臨床愈合的出院率更高，尤其是含PBMC的自體PRP。且各組病例均未出現(xiàn)感染加重、敗血癥、創(chuàng)面惡化等情況。雖然對于非感染性創(chuàng)面臨床應(yīng)用含白細胞自體PRP治療還有爭議［12］，但本研究的結(jié)果表明，含PBMC的自體PRP能夠促進非急性感染創(chuàng)面愈合，且比傳統(tǒng)方法的治療效果更好。同時與單純自體PRP相比，安全性與可靠性更高。

雖然創(chuàng)傷后慢性感染性創(chuàng)面采用傳統(tǒng)方法治療也能夠達到一定療效，但仍然有愈合慢、花費大、恢復(fù)時間長，部分患者在住院期間難以達到臨床愈合的問題。自PRP在臨床上應(yīng)用以來，大量臨床數(shù)據(jù)和研究都表明，PRP 能夠促進創(chuàng)面愈合［9－11，18］。 本研究結(jié)果也表明，應(yīng)用自體PRP后，患者創(chuàng)面的愈合時間縮短，創(chuàng)面臨床治愈出院率明顯提高，不僅沒有增加住院費用，反而能夠減少住院費用，其主要原因可能是患者自體PRP治療后創(chuàng)面局部的炎癥被有效抑制［11］；此時，雖然抗生素應(yīng)用的種類與傳統(tǒng)治療無明顯區(qū)別，但其可以明顯減少抗生素的使用時間、住院時間。這兩個病例組需要的傳統(tǒng)手術(shù)處理方式如負壓吸引、皮膚牽拉器以及他們配套的醫(yī)用生物材料等也相應(yīng)減少了，因此住院費用也就減少了，從而減輕了患者的經(jīng)濟負擔。而且，本研究還發(fā)現(xiàn)，含PBMC的自體PRP在住院時間、抗生素使用時間、住院總費用等指標上比單純自體PRP效果更好。創(chuàng)傷后非急性感染患者的感染主要局限于創(chuàng)面，血液中不含病原體，但因炎癥刺激機體血液中的白細胞、淋巴細胞、吞噬細胞、單核細胞持續(xù)升高［28］，未能在病灶發(fā)揮清除病原體的作用。采用含PBMC的自體PRP在創(chuàng)面注射意味著直接將血液中的含單核細胞和白細胞的高濃度生長因子作用于創(chuàng)面，消除了機體本身的物理障礙，這可能是含PBMC自體PRP產(chǎn)生較好臨床效果的機制。

當然，因為本研究主要是回顧性的病例研究，而且納入的病例主要是由創(chuàng)傷后引起創(chuàng)面的非急性感染病例，因此病例數(shù)較少。還有，因炎癥指標在臨床中復(fù)查的時間標準不一，我們僅采用治療前和治療后首次復(fù)查結(jié)果進行對比分析。該研究結(jié)論還需要進一步的前瞻性設(shè)計的研究結(jié)果支持。另外，對于急性感染的患者，因病原體細菌可直接進入機體血液，因此暫不宜使用該方法。從目前應(yīng)用的結(jié)果來看，含PBMC自體PRP對于創(chuàng)傷性的非急性感染創(chuàng)面治療效果較好，具有臨床應(yīng)用價值，值得推廣。

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