董偉峰

（山東萊州市文昌路畜牧獸醫(yī)站，山東 萊州 261400）

禽流感是正黏病毒科A型流感病毒屬成員，我國(guó)自1994年首次在廣東省分離到H9N2亞型AIV以來(lái)，該亞型的流感病毒一直在我國(guó)雞群中廣泛流行[1]。近年來(lái)H7N9、H10N8感染人群的相關(guān)研究報(bào)道顯示，H9N2在這些病毒的重組演化過(guò)程中為其提供了內(nèi)部基因，對(duì)病毒的變異起到了關(guān)鍵的作用[2,3]。山東地區(qū)是全國(guó)重要的肉雞規(guī)?；B(yǎng)殖大省，近年來(lái)冬春季節(jié)H9N2的發(fā)病率居高不下，感染禽臨床表現(xiàn)上呼吸道感染、支氣管栓塞、氣囊炎等癥狀，與其它病原體共感染時(shí)，還可引起免疫抑制[4]，導(dǎo)致雞群生長(zhǎng)緩慢，死亡率增加，給商品肉雞養(yǎng)殖造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

HA蛋白是流感病毒表面最重要的糖蛋白，是流感病毒的主要保護(hù)抗原，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體。基于抗原性和HA基因血凝素分析，H9N2在國(guó)內(nèi)被劃分為三種主要的遺傳分支：①A/Chicken/Beijing/1/94(BJ94)或the A/Duck/Hong Kong/Y280/97(Y280)；② A/Quail/Hong Kong/G1/97(G1)； ③ A/Duck/Hong Kong/Y439/97(Y439)。研究報(bào)道，近幾年在中國(guó)的雞群中一種由A/chicken/Zhejiang/HJ/2007為代表的新的基因型(G57分支)占到主導(dǎo)地位[5]。BJ94型病毒主要在雞中流行，而在華東和華南地區(qū)已經(jīng)被A/Ck/Shanghai/F/98(F98)所代表的F98型病毒逐漸取代[6]。

當(dāng)前H9N2滅活疫苗在山東地區(qū)商品肉雞中廣泛應(yīng)用，但臨床發(fā)病仍然居高不下，為了在分子水平上闡述當(dāng)前山東地區(qū)商品肉雞H9N2的遺傳變異特征，本研究對(duì)2016～2017年從山東省膠東地區(qū)發(fā)病肉雞分離的13株AIV（H9N2亞型）的HA基因進(jìn)行了序列分析，以期從分子生物學(xué)角度了解山東省H9N2亞型禽流感病毒的變異規(guī)律，為商品肉雞H9N2禽流感的預(yù)防提供參考。

1 材料和方法

1.1 毒株 13株H9N2亞型禽流感病毒流行株由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所按照參考文獻(xiàn)中的方法進(jìn)行分離、鑒定及純化[1]。其毒株代表號(hào)依次為XT31、XT33、XT34、XT35、XT39、XT43、XT44、XT46、XT205、XT208、XT211、MHS3、MHS5。

1.2 主要試劑 SPF雞和雞胚均由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所SPF雞研究中心提供。Trizol、DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、pMD18-T Vector、限制性內(nèi)切酶和一步法RT-PCR試劑盒均購(gòu)自大連寶生物有限公司。

1.3 引物合成 參考GenBank上已發(fā)表的H9N2亞型禽流感病毒HA基因序列，利用Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，由上海生工生物工程有限公司合成，用于擴(kuò)增HA基因全長(zhǎng)序列。

HA1片段預(yù)計(jì)擴(kuò)增長(zhǎng)度為574bp，引物序列為:

HA1-U:AGCAAAAGCAGGGGAATTTCAC；HA1-L:CTCTATTATTTGTGTATTGGGCGTC。

HA2片段預(yù)計(jì)擴(kuò)增長(zhǎng)度為1353bp，引物序列為:

HA2-U:ACTAAGGTCACTTTTTAGCTCTGCT；HA2-L:AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTGC。

1.4 病毒 RNA的提取及HA基因的RT-PCR擴(kuò)增 按照Trizol試劑盒說(shuō)明書提取病毒RNA，取適量DEPC處理的超純水溶解RNA。RT-PCR采用大連寶生物工程有限公司的一步法提取試劑盒，按說(shuō)明書進(jìn)行。

1.5 PCR產(chǎn)物的克隆與序列分析 凝膠提取試劑盒回收陽(yáng)性產(chǎn)物，將回收物連接pMD18-T Vector，16℃，1.5h， 后轉(zhuǎn)化至感受態(tài) DH5α，37℃震蕩1h后，均勻涂布含Amp、IPTG和X-gal的LB固體培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)14～16h。挑取白色菌落37℃培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒做EcoRⅠ酶切和PCR擴(kuò)增雙重鑒定。將所得的兩段HA序列拼接，并結(jié)合GenBank上已發(fā)表的16株H9N2禽流感病毒株的HA基因序列，毒株具體信息及登錄號(hào)詳見(jiàn)表1。

表1 H9N2毒株及其具體信息和基因登錄號(hào)

取HA基因的全長(zhǎng)氨基酸片段對(duì)分離株和參考株進(jìn)行基因分型，利用DNASTAR和Mega5.10軟件，分析H9N2的HA1/HA2裂解位點(diǎn)氨基酸序列，比較分離毒株與國(guó)內(nèi)外近期發(fā)生的不同宿主源H9N2的HA基因的同源性，繪制系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù)，從而對(duì)上述毒株的HA基因分子遺傳變異情況進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR結(jié)果 RT-PCR產(chǎn)物在0.01g/ml的瓊脂糖凝膠中電泳，發(fā)現(xiàn)HA1在600bp處出現(xiàn)特異條帶，HA2在1300bp處出現(xiàn)特異條帶，電泳結(jié)果與預(yù)期大小一致。

2.2 重組質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶鑒定結(jié)果 將提取的質(zhì)粒通過(guò)PCR和酶切后獲得兩條電泳帶，分別為600bp和1300bp左右，初步表明HA基因分段擴(kuò)增獲得了陽(yáng)性克隆。

2.3 分離株HA基因核苷酸和氨基酸序列分析與比較 將雙向測(cè)序結(jié)果用Dnaman軟件拼接，獲得13株H9N2亞型AIV的HA基因的cDNA全序列，全長(zhǎng)1742bp，ORF全長(zhǎng)為1683個(gè)核苷酸，位置為34～1716位核苷酸，編碼560個(gè)氨基酸。將13個(gè)分離株與GenBank上發(fā)表的參考毒株進(jìn)行核苷酸序列和氨基酸序列的同源性比較，結(jié)果如圖1、圖2所示。分離株與BJ94參考毒株HA基因的核苷酸之間的同源性為89.1%～91.3%，氨基酸序列之間的同源性為90.0%～93.4%；與A/chicken/Zhejiang/HJ/2007（G57分支）參考毒株 HA基因的核苷酸之間的同源性為89.1%～91.3%，氨基酸序列之間的同源性為93.6%～97.0%；而分離株之間的HA基因核苷酸同源性為94.1%～99.8%，氨基酸序列之間的同源性為94.3%～100%。

圖1 H9N2分離株與參考株HA基因核苷酸同源性比較

圖2 H9N2分離株與參考株HA基因氨基酸同源性比較

通過(guò)DNAStar軟件對(duì)所分離毒株的氨基酸序列進(jìn)行分析，包括HA裂解位點(diǎn)附近的氨基酸序列、構(gòu)成受體結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸序列和潛在的糖基化位點(diǎn)，具體結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

表2 分離株HA基因裂解位點(diǎn)序列及潛在糖基化位點(diǎn)分析

表3 H9N2分離株與參考株HA基因序列關(guān)鍵位點(diǎn)的比較

所有分離株的HA裂解位點(diǎn)均為RSSR↓GLF，有 6～8個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)（N-X-T/S，X 為除 P外的氨基酸），XT39毒株在 218～220位和313～315位出現(xiàn)糖基化位點(diǎn)雙缺失，XT205和XT208毒株在218～220位糖基化位點(diǎn)缺失，XT33和MHS3毒株在 551～553位潛在糖基化位點(diǎn)缺失。13株分離株構(gòu)成HA唾液酸受體結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸在191位非常保守，為N（天冬酰胺），與經(jīng)典的禽流感國(guó)內(nèi)分離株一致。13株分離株中有3株在198位上變異為A （丙氨酸），6株變異為T（蘇氨酸），1株變異為M（甲硫氨酸）三種形式。13株分離毒在234位受體結(jié)合位點(diǎn)均為L(zhǎng)（亮氨酸），具有與哺乳動(dòng)物唾液酸a，2-6受體結(jié)合的特征，該類毒株的流行在公共衛(wèi)生上應(yīng)值得重視。

2.4 HA基因進(jìn)化分析 利用 Mega5.10軟件，結(jié)合已發(fā)表的16株H9N2禽流感參考毒株的HA基因序列對(duì)HA基因的遺傳進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析，并繪制了基因進(jìn)化樹(shù)（圖3）。由圖3可知新分離株同屬于歐亞分支中的A/Chicken/Beijing/1/1994(A/Duck/Hong Kong/Y280/97)亞群，與近年在中國(guó)雞群中流行的由A/chicken/Zhejiang/HJ/2007為代表新的基因型(G57分支)遺傳關(guān)系最近，推測(cè)是由其進(jìn)化演變而來(lái)。

圖3 H9N2AIV分離株和參考毒株HA基因氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

3 討論

自1966年首次分離獲得H9N2亞型AIV以來(lái)，目前該亞型病毒已普遍存在于世界各國(guó)禽群中，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。鑒于HA基因在病毒的吸附、穿膜過(guò)程以及病毒的致病力方面均起著關(guān)鍵作用，因此持續(xù)開(kāi)展對(duì)H9N2亞型禽流感病毒的HA基因變異分析的研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究對(duì) 2016～2017年來(lái)源于山東省商品肉雞樣品中分離鑒定的13株H9N2亞型AIV的HA基因進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序。結(jié)果表明，分離株與BJ94參考疫苗毒株HA基因核苷酸之間的同源性為89.1%～91.3%，氨基酸序列之間的同源性為90.0%～93.4%；與 A/chicken/Zhejiang/HJ/2007（G57分支）參考毒株HA基因的核苷酸之間的同源性為89.1%～91.3%，氨基酸之間的同源性為93.6%～97.0%；而13株分離株之間的HA基因核苷酸同源性為94.1%～99.8%，氨基酸序列之間的同源性為94.3%～100%。結(jié)果顯示與當(dāng)前疫苗毒株具有較大差異。13株分離毒HA基因均與A/chicken/Zhejiang/HJ/2007（G57分支）在同一分支，這是否是當(dāng)前商品肉雞免疫失敗引起臨床發(fā)病的原因還需進(jìn)一步研究。

HA裂解位點(diǎn)的氨基酸序列是決定AIV毒力的關(guān)鍵因素。研究表明，高致病力禽流感在機(jī)體內(nèi)可被多種蛋白酶識(shí)別和裂解，具有廣泛的組織嗜性，而低致病力毒株的HA在其裂位點(diǎn)附近通常只有一個(gè)精氨酸，只能被消化道和呼吸道內(nèi)有限的蛋白酶識(shí)別，通常只引起這些組織的局部感染[7]。本研究中所分離的13株毒株的裂解位點(diǎn)氨基酸序列均為RSSR↓GLF，符合低致病性禽流感裂解位點(diǎn)的氨基酸序列特征。

HA基因除了決定病毒的致病力外，還決定其宿主范圍。Matrosovich等[8]研究表明人源和禽源禽流感病毒在HA糖基化程度及受體不同成分結(jié)合能力均存在差異，禽流感HA上的受體結(jié)合位點(diǎn)呈 袋 狀 ， 由 109、151、163、191、198、202、203 和146～150、232～237aa 構(gòu)成，這些位點(diǎn)的氨基酸相當(dāng)保守，其中191aa(組氨酸)被認(rèn)為是13種亞型的AIV病毒HA中都十分保守的一個(gè)氨基酸[9]，本研究中分離株191aa均為天冬酰胺，與葉賀佳等[10]報(bào)道的一致。而198aa的變異為A、T、M。其他構(gòu)成受體結(jié)合位點(diǎn)袋狀結(jié)構(gòu)的氨基酸在H9亞型內(nèi)都很保守。劉金華等[11]報(bào)道可以感染哺乳動(dòng)物和人類的H9N2亞型禽流感病毒在HA的234位為L(zhǎng)（亮氨酸），具有與哺乳動(dòng)物唾液酸α，2～6受體結(jié)合的特征，不能使人致病的H9N2亞型禽流感病毒HA基因的234位氨基酸是Q（谷氨酰胺），而本研究中所有分離株在234位為L(zhǎng)（亮氨酸），因此商品肉雞場(chǎng)中該類型毒株的流行在公共衛(wèi)生上更值得重視。

HA上潛在的糖基化位點(diǎn)對(duì)病毒的受體親和力、病毒毒力等多種生物學(xué)特性有影響。受體結(jié)合位點(diǎn)附近的糖基化會(huì)影響AIV和宿主細(xì)胞的結(jié)合水平，裂解位點(diǎn)附近的糖基化位點(diǎn)還可能影響到蛋白酶對(duì)HA前體蛋白的裂解。本研究中所有分離毒株在245～247位糖基化位點(diǎn)缺失，但在313～315位出現(xiàn)了一個(gè)新的潛在糖基化位點(diǎn)，糖基化位點(diǎn)的對(duì)本毒株毒力的影響尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。分離株HA基因與16株參考株的HA基因遺傳系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系表明，分離株與A/chicken/Zhejiang/HJ/2007（G57分支）分離株遺傳關(guān)系最近，與疫苗株關(guān)系已遠(yuǎn)，懷疑該病毒可能是通過(guò)某種方式從長(zhǎng)三角地區(qū)傳遞過(guò)來(lái)的。禽流感H9N2病毒也是多個(gè)片段共同作用的結(jié)果，除HA外，NA、NS、PB2等基因均可影響該分離株的致病力和抗原性，這些基因的變異能否改變病毒的毒力有待進(jìn)一步研究。

本研究中通過(guò)對(duì)分離株分子生物學(xué)特征進(jìn)行分析表明，目前H9N2病毒亞型呈現(xiàn)變異趨勢(shì)，盡管裂解位點(diǎn)序列為RSSR↓GLF，顯示仍為低致病力毒株。但生產(chǎn)中不斷出現(xiàn)的商品肉雞發(fā)病，給我們的臨床防控工作帶來(lái)了一定的難度，同時(shí)給我們的疫苗開(kāi)發(fā)和疫情監(jiān)測(cè)提出了更高的要求。因此，我們應(yīng)該加強(qiáng)H9N2病毒的分子流行病學(xué)監(jiān)測(cè)工作，及時(shí)了解掌握該病毒的變異趨勢(shì)和進(jìn)化規(guī)律，更好地為生產(chǎn)一線防控工作提供依據(jù)和指導(dǎo)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 陳伯倫，張澤紀(jì)，陳偉斌.禽流感研究 I：雞A型禽流感病毒的分離與血清學(xué)初步鑒定[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,1994，22(10):3-5.

[2] Watanabe T,Kiso M,Fukuyama S,et al.Characterization of H7N9influenza A viruses isolated from humans[J].Nature,2013,501(7468):551-5.

[3] Chen H,Yuan H,Gao R,et a.Clinical and epidemiologicalcharacteristics ofa fatalcase of avian influenza A H10N8 virus infection:a descriptive study[J].Lancet,2014,383(9918):714-721.

[4] 劉紅旗,彭大新,程堅(jiān),等.H9N2亞型禽流感病毒血凝素基因的遺傳變異[J].揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào):農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版,2002,23(2):6-9.

[5] Pu J,Wang S,Yin Y,et al.Evolution of the H9N2influenza genotype thatfacilitated the genesis of the novel H7N9virus[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2015,112(2):548.

[6] 石火英，孫蕾，陳素娟，等.H9N2亞型禽流感病毒復(fù)制特性的基因分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，39(2):189-194.

[7] Rohm C,Horimoto T,kawaoka Y,et al.Do hemagglutinin genes ofhighly pathogenic avian influenza virus constitute unique phylogenetic lineages?[J].Virology,1995,209(2):664-670.

[8] M N Matrosovich,A S Gambaryan,S Teneberg,et al.Avian influenza A viruses differ from human viruses by recognition of sialyloligosaccharides and gangliasides and by a higher conservation of the HA receptor-binding site[J].Virology,1997,233:224～234.

[9] Nobusawa E,Aoyama T,Kato H.Comparison of complete amino acid sequences and receptor-binding propertiesamong13 serotypeofhemagglutinin of influenza A virus[J].Virology,1991,182:475-485.

[10] 葉賀佳，梁昭平，彭特，等.2012～2015年 H9N2亞型AIV分離株HA基因的克隆及序列分析 [J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2016，43(5):1148-1155.

[11] 劉金華，吳清民，陳福勇，等.雞源株與人源株H9N2流感病毒血凝素受體結(jié)合位點(diǎn)氨基酸比較與分析[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2003,25(6):416～418.