秦日甜 盧玉麗 梁高麗 謝占玲，2 雷亞男

（1. 青海大學生態(tài)環(huán)境工程學院微生物實驗室，西寧 810016；2. 青海省高原作物種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用重點實驗室，西寧 810016；3. 西北農(nóng)林科技大學，楊凌 712100）

有研究發(fā)現(xiàn)，在降解纖維素的過程中，纖維素酶與蛋白酶存在協(xié)同作用［1-2］。田飛等［3］利用比較蛋白質(zhì)組學技術，對鐮刀菌Q7-31T的植物細胞壁降解酶系組成進行研究，發(fā)現(xiàn)共有28種蛋白質(zhì)，蛋白酶有6種，約占總蛋白數(shù)量的21%，其中3種為金屬蛋白酶，分別屬于M14家族和M28家族，2種為假定蛋白，1種為GMP合酶。前期已經(jīng)成功分離純化出Q7-31糖苷水解酶中內(nèi)切葡聚糖酶Egn20［4］、Egn21［5］和木聚糖酶 Xyn9［6］。

金屬蛋白酶是活性中心依賴于金屬離子（大多為Zn2+），能高效水解蛋白質(zhì)和多肽的一類蛋白酶，這類蛋白酶主要是中性蛋白酶，最適pH 7-8［7］。其存在范圍廣泛，目前發(fā)現(xiàn)植物、動物、微生物均可以分泌金屬蛋白酶，其作用區(qū)域多樣，在細胞內(nèi)、細胞基質(zhì)、細胞膜和細胞外均發(fā)現(xiàn)有一定數(shù)量且具有活性的金屬蛋白酶［8］，且其性質(zhì)特異，具有重要的經(jīng)濟和應用價值。目前主要應用于洗滌劑、食品、化妝品及抗腫瘤等藥物和疾病的機理研究等方面［9］。由于金屬蛋白酶來源有限，限制了其進一步發(fā)展，而微生物所產(chǎn)胞外金屬蛋白酶具有種類多，易分離，產(chǎn)量大等優(yōu)勢。細菌中許多屬，如單胞菌屬（Alteromonassp.）［10］，沙雷氏菌屬（Serratia marcescens）［11］，嗜堿芽孢桿菌屬（Bacillus halodurans）［12］等中都有產(chǎn)金屬蛋白酶菌株的報道。報道發(fā)現(xiàn)真菌細胞壁酶系發(fā)達，其中一部分為金屬蛋白酶，但目前挖掘關注點少。

本研究選取分離自青藏高原的一株能高效降解植物細胞壁的鐮刀菌 Q7-31T 為材料，通過Sephacryl S-100凝膠過濾層析、DEAE Sepharose Fast Flow 離子交換層析、SDS-PAGE凝膠電泳等技術，分離純化Q7-31T中蛋白酶，并對其酶學性質(zhì)進行研究，旨在為蛋白酶研究以及蛋白酶在纖維素降解過程中的作用探究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 鐮刀菌Q7-31（青海大學生態(tài)環(huán)境工程學院微生物實驗室2007年5月從青海湖地區(qū)分離得到）。和硫酸銨（天津市恒興化學試劑制造有限公司），酪蛋白（北京索萊寶公司生產(chǎn)），蛋白胨（Sigma公司生產(chǎn)），葡萄糖（天津市大茂化學試劑廠），丙烯酰胺、考馬斯亮藍 R-250（上海華瞬生物工程有限公司），N，N，N’，N’-四甲基乙烯胺（TEMED），尿素（華美生物工程公司），甘氨酸、十二烷基硫酸鈉（SDS）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、低分子量蛋白Marker（上海生工生物工程有限公司），Sephacry S-100、DEAE-Sepharose Fast Flow（Pharmacia公司）。

1.1.2 儀器 全溫搖瓶柜HYG-A（太倉市實驗設備廠）；紫外可見光光度計UV-9200（北京瑞力利分析儀器公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-6（國華電器有限公司）；離心機TDL-40B（上海安亭科學儀器廠）；電子精密天平（奧豪斯國際貿(mào)易有限公司）；垂直電泳儀BG-ver MINI（北京百晶生物技術有限公司）；電泳儀電源BG-Power300（北京百晶生物技術有限公司）；pH計PH3-3C（上海盛磁儀器有限公司）；自動部分收集器BSZ-160（上海青浦滬西儀器廠）；SW-CJ-ZFD型雙人單面凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；梯度混合器TH-1 000（上海青浦滬西儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng) 從液體石蠟封存的菌種中挑取直徑0.5 cm的瓊脂塊，接種到PDA平板培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂15-20 g，蒸餾水1 000 mL）中心，25℃恒溫培養(yǎng)箱中活化5 d；從菌落邊緣切下直徑1 cm的瓊脂塊，轉(zhuǎn)接至液體種子培養(yǎng)基（葡萄糖20 g/L、蛋白胨3 g/L、Mendels營養(yǎng)鹽：（NH4）2SO41.4 g/L、KH2PO42.0 g/L、 尿 素 0.3 g/L、CaCl20.3 g/L、MgSO40.3 g/L、FeSO45.0 mg/L、MnSO41.6 mg/L、ZnSO41.4 mg/L、CoCl22.0 mg/L，pH自然，裝液量60 mL/150 mL），室溫靜置培養(yǎng)72 h；將液體種子培養(yǎng)基按10%的量接種至產(chǎn)酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基（燕麥秸稈5 g/L、蛋白胨3 g/L、Mendels營養(yǎng)鹽，pH自然，三角瓶裝液量100 mL/250 mL），20℃，120 r/min搖床培養(yǎng)120 h。發(fā)酵液經(jīng)8層無菌紗布過濾，得到粗酶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 酶活力的測定 用福林-酚試劑法測定蛋白酶的活力［13］。采用2%酪蛋白為底物，反應時間為20 min，在一定pH值和40℃溫度條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸為一個蛋白酶活力單位U。采用DNS法（3'，5' -二硝基水楊酸法）測定CMC酶、外切酶、木聚糖酶及燕麥秸稈酶的活力及還原性糖的產(chǎn)量。分別采用 0.5%羧甲基纖維素、0.5%微晶纖維素、0.5%木聚糖、0.5%燕麥秸稈為底物，反應時間為30 min，40℃，在 40℃下每分鐘產(chǎn)生1 μmol 還原糖所需的酶液量為一個酶活力單位（U）。

1.2.3 蛋白含量測定 蛋白含量的測定采用Bradford法，標準曲線是以牛血清白蛋白為標準繪制。在1.5 mL 離心管中加入適當稀釋的牛血清白蛋白200 μL，在加入1 mL G-250 考馬斯亮藍染液5-30 min內(nèi)在595 nm下測定光吸收值。

1.2.4 蛋白酶的分離純化

1.2.4.1 硫酸銨分級沉淀 將固體硫酸銨研磨細，緩慢加入粗酶液中，調(diào)節(jié)飽和度到10%-90%，充分混勻后，4℃ 靜置過夜，隨后4℃、12 000×g離心20 min收集沉淀；沉淀以pH7.5的Tris-HCl緩沖液重懸，4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.2 Sephacryl S-100葡聚糖凝膠層析 硫酸銨分級沉淀后的樣品加入到Sephacry S-100葡聚糖凝膠層析柱（26 mm×700 mm），以Tris-HCl緩沖液（0.02 mol/L、pH 7.5）洗脫、流速為1.5 mL/min，每2 min收集1管。用核酸蛋白檢測儀檢測蛋白的分布，福林-酚試劑法檢測蛋白酶的分布（方法如1.2.2、1.2.3所述）。

1.2.4.3 DEAE弱陰離子交換層析 取凝膠層析柱收集的蛋白酶活性部分，添加到DEAE瓊脂糖凝膠弱陰離子交換柱（15 mm×50 mm）上，用含有NaCl（0.02 mol/L-1.0 mol/L，pH 7.5）的緩沖液做線性梯度洗脫（2 mL/min），用核酸蛋白檢測儀檢測蛋白分布，用福林酚法檢測蛋白酶的分布（方法如1.2.2、1.2.3所述）。1.2.5 SDS-PAGE 以SDS-PAGE法［14］檢測蛋白質(zhì)的分子量。濃縮膠濃度5%，電泳電壓為80 V；分離膠濃度為12%，電泳電壓為120 V。

1.2.6 酶學性質(zhì)研究

1.2.6.1 最適溫度及穩(wěn)定性測定 將2.0 %的干酪素溶液，分別在 4、10、20、30、40、50、60、70和80℃水浴中預熱5 min，然后加入1 mL 酶液，水浴中保溫10 min，采用福林-酚法測定酶活力，以確定最適溫度；將1 mL 酶液分別在上述溫度條件下保溫30 min，將預熱后的酶液加入到50℃預熱的5 mL酪素溶液中，50℃保溫10 min，采用福林酚法測酶活力，研究酶的熱穩(wěn)定性。

1.2.6.2 最適pH及穩(wěn)定性測定 將2.0%的干酪素溶液處于不同pH的緩沖液中，pH范圍為3. 0-10. 0，將1 mL 酶液加入到5 mL已在50℃水浴鍋中預熱的不同pH的干酪素溶液中，50℃保溫10 min，然后用福林酚法，測定酶在不同 pH下的酶活力，以確定最適pH；將酶液加入到各pH值緩沖液中，室溫保溫30 min，然后用福林酚法測定蛋白酶的酶活力，研究酶的pH穩(wěn)定性。

1.2.6.3 底物特異性測定 分別以2%的酪蛋白、膠原蛋白、卵清蛋白、牛血清白蛋白、頭發(fā)（主要為角蛋白粗品）、蛋白胨及牛肉膏作為底物，將純化的蛋白酶分別與不同的底物在pH 7.0，40℃條件下反應30 min，按照酶活力測定方法測定酶活性。以最高酶活力為100%，計算對不同底物的相對酶活。

1.2.6.4 米氏常數(shù)的測定 米氏常數(shù)Km的測定采用Lineweaver-burk法：固定酶濃度，在酶量不變的情況下改變底物酪蛋白的濃度，測定酶活力隨底物濃度的改變而變化的情況。

1.2.6.5 金屬離子對蛋白酶活力的影響 分別在酶液中加入不同金屬離子化合物：Na+、K+、Zn2+、Fe2+、Mg2+、Mn2+、Ca2+，各種金屬離子在反應體系中的終濃度達到4 mmol/L，pH調(diào)整到7.0，40℃處理30 min后，測定蛋白酶的酶活力。以未加金屬離子的酶活力作為100%。

1.2.7 蛋白鑒定 蛋白的鑒定是由北京華大基因完成，具體的實驗方法參照田飛等［1］的研究。對鐮刀菌Q7-31菌株發(fā)酵液中所產(chǎn)的蛋白酶進行庫中的鑒定，通過與質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫比對分析，鑒定蛋白酶。

1.2.8 鐮刀菌 Q7-31T 植物細胞壁降解酶系協(xié)同作用 在鐮刀菌Q7-31T發(fā)酵培養(yǎng)的5 d內(nèi)，分別以羧甲基纖維素（CMC）、微晶纖維素、燕麥秸稈、酪蛋白和木聚糖為底物，測出CMC酶、外切酶、纖維素酶、蛋白酶和木聚糖酶的酶學活性及總蛋白含量。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)酵時間對菌株產(chǎn)酶的影響

用福林酚法測定不同培養(yǎng)時間下粗酶液的蛋白酶酶活。結(jié)果如圖1所示，發(fā)酵液中蛋白酶活力呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。第6天的酶活是最高的，故選擇產(chǎn)蛋白酶的最佳培養(yǎng)時間為第6天。

圖1 發(fā)酵時間對菌株產(chǎn)蛋白酶的影響

2.2 鐮刀菌Q7-31T金屬蛋白酶的分離純化

大部分蛋白樣品在硫酸銨為10%-90%的飽和度條件下沉淀下來。蛋白樣品以0. 02 mol/L pH7.5 Tris-HCl緩沖液重懸，取25 mL重懸液添加到Sephacry S-100葡聚糖凝膠柱進行初步分級分離，洗脫圖譜如圖2所示。主要有5個蛋白峰（P1、P2、P3、P4和P5），蛋白酶的酶活力主要集中在P3處。將P3處的樣品收集、濃縮，上樣到DEAE瓊脂糖凝膠弱陰離子交換柱進一步分離純化，洗脫圖譜如圖3所示，包括一個穿透峰（P6）和一個洗脫峰（P7），活性分析發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn) P6處的蛋白樣品有明顯的蛋白酶酶活力，而P7處的蛋白樣品無酶活力。對P6處樣品進行SDS-PAGE檢測（圖4），發(fā)現(xiàn)為單一條帶，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析，分子量為30 kD，將該蛋白酶命名FQME14。

圖2 Sephacryl S-100凝膠過濾洗脫圖譜

圖3 DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換洗脫圖譜

圖4 鐮刀菌Q7-31T金屬蛋白酶的SDS-PAGE電泳圖

以600 mL發(fā)酵液開始，蛋白酶FQME14從粗酶液到最后的純化產(chǎn)物共純化了8.64倍，回收率為3%，酶純化后的比活力為2.85 U/mg，分離純化結(jié)果如表1所示。

表 1 蛋白酶Protease Q7-31A的純化

2.3 蛋白酶酶學性質(zhì)分析

2.3.1 最適溫度、pH及穩(wěn)定性測定 FQME14 最適反應溫度、pH 及其耐受情況如圖5、6 所示。最適反應溫度為40℃，最適反應pH 為7；純化的酶在50℃以下恒溫水浴仍能維持原有酶活力的80% 以上，溫度超過50℃后，酶活力呈現(xiàn)出下降的趨勢；pH 穩(wěn)定性檢測發(fā)現(xiàn)該酶在pH 5.0-pH 9.0之間具有較好的穩(wěn)定性，相對酶活均超過80%，pH超過9.0之后，酶活出現(xiàn)下降的趨勢。

2.3.2 金屬離子對蛋白酶活力的影響 金屬離子對蛋白酶活力的影響如圖7所示，Mn2+和Co2+對酶活性有強烈的激活作用，對蛋白酶相對酶活均提高4-5倍；Fe2+、Mg2+、Na+、K+、Ca2+和 Zn2+對酶活性有不同等程度的抑制作用。

2.3.3 底物特異性測定 底物特異性測定如圖8所示，蛋白酶的最適底物為酪蛋白，對牛血清白蛋白和卵清蛋白也有較高的降解能力。

2.3.4 蛋白酶的米氏常數(shù)測定 采用Lineweaverburk作圖法得到1/V和1/S的關系曲線如圖9所示，由此計算出蛋白酶的米氏常數(shù)為8.99 mg/mL，最大反應速度為 9.14 μg/（min·mL）。

2.4 蛋白酶的鑒定

對蛋白酶FQME14的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果顯示，蛋白酶FQME14的分子量為30 kD；進行串聯(lián)質(zhì)譜分析先通過一級質(zhì)譜獲得蛋白的肽指紋圖譜（PMF），再選取有代表性的肽段，進一步破碎后進行二級質(zhì)譜檢測，質(zhì)譜圖如圖10所示，二級質(zhì)譜獲得 2 段多肽序列：GSKPAIVFHGTVHAR和AKYSYTIELRDRGTYGFSLPANQIQPTVR；二級質(zhì)譜結(jié)果結(jié)合母離子信息和PMF 的結(jié)果進行搜庫（NCBI）比較，經(jīng) Mascot 搜索引擎檢索，蛋白酶Q7-31A對應結(jié)果為M14家族蛋白酶（gi|342881706），與 hypothetical protein FOXB_06955（Sequence ID：EGU82539.1）94%相似；經(jīng)Mascot搜索引擎檢索，檢索最高得分為62分（75為陽性結(jié)果），結(jié)合蛋白酶的酶學特性對應結(jié)果分析，該蛋白酶屬于M14家族，是一種新的金屬蛋白酶。

圖5 金屬蛋白酶FQME14的最適溫度（A）和溫度穩(wěn)定性（B）

圖6 蛋白酶的最適pH（A）和pH耐受性（B）

圖7 金屬離子對蛋白酶活力的影響

圖8 蛋白酶底物特異性檢測

圖9 Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線

圖10 蛋白酶質(zhì)譜鑒定圖譜

2.5 鐮刀菌Q7-31T植物細胞壁降解酶系協(xié)同作用

如圖11所示，1-2 d CMC酶酶活遠高于外切酶酶活。2-3 d，CMC酶活下降，外切酶酶活上升；3-5 d CMC酶酶活再次上升，外切酶酶活略有下降，蛋白酶酶活開始表現(xiàn)并上升趨勢。

圖11 發(fā)酵時間對菌株產(chǎn)酶的影響

3 討論

經(jīng)本次實驗得出蛋白酶FQME14的最適pH 為7.0，為中性蛋白酶，是M14家族的一種新的金屬蛋白酶。該金屬蛋白酶具有較低的回收率，與Hang等［15］研究的金屬蛋白酶相似，這可能與蛋白酶本身的自溶現(xiàn)象［16］有關。經(jīng)酶學特性研究發(fā)現(xiàn)它的最適反應溫度為40℃，在pH 5.0-9.0范圍內(nèi)酶活較穩(wěn)定，溫度在50℃以下保持較穩(wěn)定的酶活，Mn2+和Co2+對它有激活的作用，Mg2+、Fe2+、K+、Ca2+、Zn2+和Na+對酶活有不同等程度的抑制作用，與Wu［17］和母智深等［18］的研究相似，而與Matsubara等［19］研究的金屬蛋白酶有所不同，這可能是因為它們是不同的蛋白酶家族，也可能是由于產(chǎn)生于不同的微生物以及培養(yǎng)方式不同所導致。已知金屬蛋白酶家族的活性中心均存在Zn2+，但是實驗研究發(fā)現(xiàn)Zn2+對金屬蛋白酶FQME14的酶活性具有抑制作用。目前研究［5-6，20］發(fā)現(xiàn)，在降解纖維素的過程中，纖維素酶與蛋白酶存在協(xié)同作用，但具體的作用機理尚不明確。在探究鐮刀菌Q7-31T植物細胞壁降解酶系協(xié)同作用時，在發(fā)酵培養(yǎng)期間，總蛋白質(zhì)含量變化主要與蛋白酶酶活變化相關，二者幾乎同步，因此，推測在纖維素酶降解纖維素的過程中蛋白酶起調(diào)節(jié)CMC酶和外切酶活性的作用。纖維素酶降解機制的研究，一直是一個難點，本研究能豐富鐮刀菌Q7-31T對植物細胞壁降酶系的信息，并為后期對鐮刀菌高效降解纖維素機制的研究提供數(shù)據(jù)支持。

4 結(jié)論

從燕麥秸稈誘導發(fā)酵的鐮刀菌Q7-31T粗酶液中分離純化到一種新型的M14家族金屬蛋白酶FQME14，并研究了其酶學性質(zhì)。其相對分子質(zhì)量為30 kD；最適反應溫度40℃、最適pH7，在10-50℃、pH 5.0-9.0范圍內(nèi)具有80% 以上酶活力；Mn2+和Co2+對FQME14酶活性有較強激活作用，F(xiàn)e2+、Mg2+、Na+、K+、Ca2+和 Zn2+對其酶活性質(zhì)有不同程度的抑制作用。FQME14的最適底物為酪蛋白，對牛血清白蛋白和卵清蛋白也有較高的降解能力；米氏常數(shù)為8.99 mg/mL，最大反應速度為9.14 μg/（min·mL）。

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