劉建兵 戚夢(mèng) 杜苑如 傅俊生 胡開(kāi)輝

（福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物工程系，福州 350002）

蛹蟲(chóng)草Cordyceps militaris（L.）Fr.俗稱北冬蟲(chóng)夏草、北蟲(chóng)草、蛹草等，屬子囊菌門(mén)Ascomycota、肉座菌目Hypocreales、麥角菌科Clavicipitaceae、蟲(chóng)草屬Cordyceps，在自然界中分布廣泛［1］。其子實(shí)體和發(fā)酵產(chǎn)物中均含有豐富的蟲(chóng)草素、蟲(chóng)草酸、腺苷及多糖等活性成分，具有抗菌、消炎、抗腫瘤、降血糖及調(diào)節(jié)人體免疫功能等作用，在我國(guó)作為食藥用真菌而廣泛應(yīng)用［2］。但目前蛹蟲(chóng)草產(chǎn)業(yè)存在著很多問(wèn)題，尤其是缺乏優(yōu)質(zhì)菌種、菌種易退化以及“同種異名”或“同名異種”現(xiàn)象嚴(yán)重等問(wèn)題是制約蛹蟲(chóng)草產(chǎn)業(yè)化的重要瓶頸。應(yīng)對(duì)這些問(wèn)題的主要手段是重新分離野生菌株以及進(jìn)行人工育種，雜交育種是最重要的育種方法之一［3］。在進(jìn)行雜交育種之前，充分認(rèn)識(shí)親本菌株間的親緣關(guān)系是必要的，限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）、簡(jiǎn)單重復(fù)間序列（ISSR）及rDNA ITS序列是研究蛹蟲(chóng)草親緣關(guān)系最常見(jiàn)的幾種分子標(biāo)記方法［4-5］。其中rDNA ITS序列因其應(yīng)用廣泛及操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)而備受研究者的喜愛(ài)，并且ITS序列分析可以比較序列中單堿基的變化，是研究真菌遺傳變異最靈敏的方法之一，所以常用來(lái)研究真菌種內(nèi)的親緣關(guān)系及遺傳分化［6］。但諸多研究表明［7-8］，ITS序列在蛹蟲(chóng)草種內(nèi)的變異率比較低，用傳統(tǒng)的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)很難分析種內(nèi)的聚類(lèi)情況及親緣關(guān)系，所以建立一種基于ITS序列直觀地分析蛹蟲(chóng)草種內(nèi)聚類(lèi)情況及親緣關(guān)系的方法具有重要意義。

蟲(chóng)草素cordycepin最初是從蛹蟲(chóng)草中分離出來(lái)的核苷類(lèi)抗菌素，也是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材蛹蟲(chóng)草和冬蟲(chóng)夏草的主要活性成分之一，具有抗腫瘤、抗菌、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)和清除體內(nèi)自由基等多種藥理作用，所以蟲(chóng)草素可作為評(píng)價(jià)菌種質(zhì)量的重要指標(biāo)［1，9］?；诖?，本研究采用ITS序列對(duì)22株蛹蟲(chóng)草行分類(lèi)鑒定，用拆分網(wǎng)絡(luò)法研究蛹蟲(chóng)草種內(nèi)的聚類(lèi)情況，并比較供試菌株發(fā)酵產(chǎn)蟲(chóng)草素能力，為蛹蟲(chóng)草菌株質(zhì)量監(jiān)測(cè)和菌種鑒定提供快速有效的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

本研究所用的蛹蟲(chóng)草菌株共22株（表1）。

表1 供試菌株

1.2 方法

1.2.1 菌株基因組DNA提取、ITS區(qū)擴(kuò)增及測(cè)序 將活化的菌株以打孔法接種到液體培養(yǎng)基（葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，酵母膏2 g，H2PO41.5 g，MgSO4·7 H2O 0.5 g，水 1 L）中，25℃、160 r/min培養(yǎng)6 d后，過(guò)濾收集菌絲。菌絲使用液氮研磨，并按照OMEGA真菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株基因組DNA，再按照Bioteke 2×power Taq PCR MasterMix試劑盒說(shuō)明擴(kuò)增ITS區(qū)序列，引物采用真菌核糖體基因間隔區(qū)通用ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'） 和 ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）。反應(yīng)條件：95℃ 2 min；95℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 1 min，28個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。擴(kuò)增樣品經(jīng)1%瓊脂糖膠檢測(cè)后送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 ITS序列分析 將序列在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中注冊(cè)獲得登錄號(hào)。利用NCBI中的BLAST對(duì)DNA序列進(jìn)行比對(duì)分析；用DNAMAN V6軟件統(tǒng)計(jì)序列長(zhǎng)度、GC含量；用系統(tǒng)發(fā)育分析軟件 MEGA6.0軟件的ClustalW功能進(jìn)行序列比對(duì)，并統(tǒng)計(jì)序列的變異情況；采用Splits Tree 4構(gòu)建折分網(wǎng)絡(luò)圖，運(yùn)行條件為默認(rèn)設(shè)置。

1.2.3 蟲(chóng)草素含量檢測(cè) 將活化的菌株以打孔法接種到液體培養(yǎng)基中，250 mL三角瓶裝100 mL培養(yǎng)基，25℃、160 r/min培養(yǎng)13 d后，抽濾分離發(fā)酵液和菌絲；HPLC法測(cè)搖瓶發(fā)酵液及菌絲體中蟲(chóng)草素含量，發(fā)酵液過(guò)0.22 μm濾膜后上機(jī)檢測(cè)，菌絲體烘干后粉碎，加水超聲浸提，料液比1∶80（g：mL），離心取上清過(guò)濾膜，后上機(jī)檢測(cè)蟲(chóng)草素含量；色譜條件：島津ODS-2 C18 色譜柱，流動(dòng)相為甲醇∶水=15∶85，流速1 mL/min，柱溫25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm，進(jìn)樣10 μL。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，不同處理組間比較采用one-way ANOVA檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x-±s表示，P＜ 0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 供試蛹蟲(chóng)草菌株的ITS序列差異

測(cè)序結(jié)果（表2）表明，22供試的株蛹蟲(chóng)草ITS序列長(zhǎng)度在518-539 bp之間，相差21 bp；G+C含量差異較小，從56.42%到57.54%。根據(jù)GenBank中已有的蛹蟲(chóng)草ITS序列信息，確定供試樣品ITS序列的ITS1、5.8S及ITS2區(qū)域，去除18S和26S區(qū)引物端序列后，將供試菌株及外類(lèi)群 ITS序列對(duì)位排列（圖1），分析菌株間ITS序列的變異情況，共有39個(gè)差異位點(diǎn)（Variable sites），其中簡(jiǎn)約信息（Parsimony informative，PI）位點(diǎn)有12個(gè)，而序列的差異主要來(lái)源于ITS1區(qū)，5.8S區(qū)和ITS2區(qū)在供試蛹蟲(chóng)草菌株間沒(méi)有堿基差異。

2.2 拆分網(wǎng)絡(luò)法分析22株蛹蟲(chóng)草的親緣關(guān)系

基于上述ITS序列的分析，拆分網(wǎng)絡(luò)分析22株蛹蟲(chóng)草菌株間的親緣關(guān)系（圖2）表明，22株蛹蟲(chóng)草聚為了三個(gè)類(lèi)群。

第一類(lèi)群由9株（MF1、5、15、17、18、19、27、28、29）蛹蟲(chóng)草組成，以其特有的第6位點(diǎn)（Site6）位點(diǎn)處的堿基替換而區(qū)別于其他菌株，在這個(gè)信息位點(diǎn)中既發(fā)生了堿基的轉(zhuǎn)換（transition）又發(fā)生了堿基的顛換（transversion），這個(gè)類(lèi)群菌株在此位點(diǎn)發(fā)生了G-T或A-T間的顛換，而顛換所占的權(quán)重（處理DNA序列時(shí)）要大于轉(zhuǎn)換，所以在拆分網(wǎng)絡(luò)上形成了一個(gè)分裂；并且在這9個(gè)菌株中，MF5、19、27由于在第11位點(diǎn)（Site11）處發(fā)生的A-C堿基的顛換，而顯示了較近的親緣關(guān)系。

表2 供試菌株r DNA-ITS區(qū)序列信息

第二類(lèi)群由菌株MF2、4、6、8、16、20、24、25、26組成，因共同表現(xiàn)在第8位點(diǎn)（Site8）和第17位點(diǎn)（Site17）處發(fā)生的堿基替換而形成親緣關(guān)系較近的類(lèi)群，明顯區(qū)別于其它菌株，此外菌株MF2、25、26以及MF4、6因ITS序列100%的相似度而處于相同的系統(tǒng)位置。

第三個(gè)類(lèi)群的4個(gè)菌株（MF21、22、23、30）均來(lái)源于江蘇，因第8位點(diǎn)的堿基顛換而形成一個(gè)小分支，表現(xiàn)為親緣關(guān)系較近，可能為“同種異名”菌株。

2.3 供試蛹蟲(chóng)草菌株液體發(fā)酵產(chǎn)蟲(chóng)草素能力

蟲(chóng)草素是蛹蟲(chóng)草的主要活性成分之一，也是作為評(píng)價(jià)產(chǎn)品品質(zhì)優(yōu)劣的主要指標(biāo)，所以篩選出高產(chǎn)蟲(chóng)草素的菌株對(duì)生產(chǎn)具有實(shí)際意義的。從圖3可以看出，蟲(chóng)草素的出峰時(shí)間為16.02 min左右，發(fā)酵液及菌絲體中的蟲(chóng)草素能夠很好的被分離開(kāi)。從表3可以看出，不同菌株間產(chǎn)蟲(chóng)草素能力相差很大，且蛹蟲(chóng)草的液體發(fā)酵物中胞外液占主要體積，而胞外液中都有較高蟲(chóng)草素含量，所以可以看出蛹蟲(chóng)草在液體發(fā)酵過(guò)程中，蟲(chóng)草素主要存在于胞外液中；從胞外液中蟲(chóng)草素含量來(lái)看，MF27產(chǎn)量最高，含量達(dá)到332.74 mg/L，是含量最低菌株MF25的31倍，且顯著的高于其它菌株（P＜0.05），這為后續(xù)的優(yōu)良菌株選育，以及優(yōu)良菌株的推廣奠定了良好基礎(chǔ)。

圖1 供試菌株ITS序列變異位點(diǎn)分析

圖2 基于ITS序列構(gòu)建的拆分網(wǎng)絡(luò)

3 討論

圖3 蟲(chóng)草素標(biāo)準(zhǔn)品（A）和MF27蟲(chóng)草胞外液（B）HPLC分析圖譜

表3 供試菌株液體發(fā)酵產(chǎn)蟲(chóng)草素能力比較

本文利用拆分網(wǎng)絡(luò)法，基于ITS序列分析22株蛹蟲(chóng)草的親緣關(guān)系，結(jié)果在拆分網(wǎng)絡(luò)上聚類(lèi)為3個(gè)類(lèi)群，發(fā)現(xiàn)每個(gè)類(lèi)群因其特有的堿基替換而區(qū)別于其他菌株，較直觀地展示了菌株間的親緣關(guān)系。拆分網(wǎng)絡(luò)splits networks法［10-12］是系統(tǒng)發(fā)育網(wǎng)絡(luò)phylogenetic networks分析中常用的方法之一，能用以描述數(shù)據(jù)集中沖突的、模糊不清的信號(hào)，檢測(cè)一些細(xì)微的差異，能提供一個(gè)二叉進(jìn)化樹(shù)不能展示的、被掩蓋了的平行事件，不確定的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)化圖像。由于拆分網(wǎng)絡(luò)的優(yōu)越性，使得其得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用和認(rèn)可。胡春云［13］分別應(yīng)用簡(jiǎn)約法系統(tǒng)樹(shù)和NeighborNet系統(tǒng)發(fā)育網(wǎng)絡(luò)，基于cpDNA序列分析梨屬植物系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，發(fā)現(xiàn)NeighborNet能解釋系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上低支持率現(xiàn)象是由沖突的信和信息位點(diǎn)不足引起的，能更好地分析種群的演化。梁宗琦［10］和周葉鳴等［14］研究表示拆分網(wǎng)絡(luò)配合系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)能更清楚地解釋物種之間的進(jìn)化關(guān)系，且拆分網(wǎng)絡(luò)更適合分析親緣關(guān)系較近的物種間的遺傳分化。

蟲(chóng)草素最早是從蛹蟲(chóng)草中分離出來(lái)的，所以又被稱作蛹蟲(chóng)草菌素、蟲(chóng)草菌素，是蛹蟲(chóng)草中標(biāo)志性的活性成分［15］。馮德龍等［16］以19株蛹蟲(chóng)草為研究材料，CYM 液體培養(yǎng)基25℃搖瓶培養(yǎng) 20 d后用HPLC法檢測(cè)各菌株發(fā)酵液的蟲(chóng)草素含量，結(jié)果蟲(chóng)草素積累量最高的達(dá)到126.33 mg/L；王蕾等［17］從14株蛹擬青霉菌株P(guān)aecilomyces militarisZ.Q. Liang中篩選到CM001菌株的蟲(chóng)草素產(chǎn)量最高，達(dá)到73.81 mg/L。本文以液體發(fā)酵產(chǎn)蟲(chóng)草素能力為指標(biāo)評(píng)價(jià)菌株的品質(zhì)特性，結(jié)果顯示MF27發(fā)酵液蟲(chóng)草素含量達(dá)到332.74 mg/L，是含量最低菌株MF25的31倍，且顯著高于其它菌株（P＜0.05），可見(jiàn)MF27具有一定的推廣應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié)論

本文建立了基于rDNA ITS序列，利用拆分網(wǎng)絡(luò)分析蛹蟲(chóng)草親緣關(guān)系的方法，并篩選出高產(chǎn)蟲(chóng)草素菌株，MF27的發(fā)酵液中蟲(chóng)草素含量為332.74 mg/L，顯著高于其它菌株（P＜0.05）。本研究為分析蛹蟲(chóng)草菌株間的親緣關(guān)系提供了科學(xué)方法。

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