榮成博 趙爽 宋爽 王晶 劉宇

（北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所 北京市食用菌工程技術(shù)研究中心，北京 100097）

白靈側(cè)耳（Pleurotus tuoliensis）是我國(guó)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的珍稀食用菌品種［1-2］。野生白靈側(cè)耳主要寄生或腐生于傘形花科植物阿魏的根莖，在我國(guó)白靈菇僅產(chǎn)于新疆木壘、青河、托里、塔城和阿勒泰等地［3］。20世紀(jì)90年代我國(guó)實(shí)現(xiàn)人工栽培，商品名白靈菇［4］。白靈側(cè)耳子實(shí)體色澤潔白，風(fēng)味獨(dú)特，被譽(yù)為草原上的牛肝菌［5］。白靈側(cè)耳營(yíng)養(yǎng)豐富，且有很高的藥用價(jià)值，其多糖具有抗腫瘤［6］、增強(qiáng)機(jī)體免疫力［7］、抗氧化、降血脂［8］和改善心腦血管疾病［9］等功效。但由于白靈菇生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、出菇整齊度差、畸形菇比例高等問(wèn)題制約產(chǎn)業(yè)發(fā)展［10］。探索參與白靈菇子實(shí)體發(fā)育形成的基因能夠?yàn)榉肿虞o助育種提供有效、快速標(biāo)記，為選育出具有優(yōu)良性狀的白靈菇菌株奠定基礎(chǔ)。

白靈菇子實(shí)體發(fā)育相關(guān)基因研究進(jìn)展緩慢，陳苗苗等［11］通過(guò)mRNA差異顯示技術(shù)篩選白靈菇菌絲和原基兩個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的差異，獲得了8個(gè)差異片段，分別與細(xì)胞色素P450、糖基轉(zhuǎn)移酶、擴(kuò)展蛋白、糖苷水解酶家族3、核糖體蛋白L29、高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶和未知蛋白具有同源性；Fu等［12］通過(guò)比較轉(zhuǎn)錄組分析了白靈側(cè)耳在后熟菌絲期、冷刺激的菌絲期、原基期和子實(shí)體形成期4個(gè)生長(zhǎng)不同階段基因的表達(dá)情況，篩選出了不同時(shí)期的差異表達(dá)基因，主要涉及形態(tài)發(fā)生、基礎(chǔ)碳代謝、冷刺激和藍(lán)光反應(yīng)相關(guān)基因。

本實(shí)驗(yàn)室前期將白靈菇10號(hào)（JZB2106010）通過(guò)原生質(zhì)體單核化獲得兩個(gè)不同極性的單核體后進(jìn)行自交，獲得一株具有鎖狀聯(lián)合、菌絲潔白濃密的雙核自交菌株 45×49（JZB2106103）［13］。出菇實(shí)驗(yàn)表明JZB2106010能夠形成子實(shí)體，而JZB2106103不形成子實(shí)體。因此，JZB2106010和JZB2106103是挖掘白靈菇子實(shí)體發(fā)育相關(guān)基因的優(yōu)良實(shí)驗(yàn)材料。本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)白靈菇菌株JZB2106010和JZB2106103進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)部分差異表達(dá)基因進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)了文獻(xiàn)報(bào)道之外的基因參與了白靈菇的子實(shí)體發(fā)育。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 白靈菇10號(hào)（JZB2106010）和白靈菇自交菌株45×49（JZB2106103）由北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所提供。

1.1.2 試劑 SYBR Premix Ex Taq II購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，RNase-Free DNase Set和RNeasy Mini kit購(gòu)自Qiagen公司，瓊脂糖購(gòu)自Sigma公司，PDB和PDA培養(yǎng)基購(gòu)自Difco公司，Revert Aid First stand cDNA synthesis kit購(gòu)自Thermo公司，所用引物在生工生物工程（上海）股份有限公司合成

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取 JZB2106010和JZB2106103在PDB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 d，過(guò)濾收集菌絲，采用RNeasy Mini kit提取RNA，RNase-Free DNase Set消化殘余的DNA。通過(guò)瓊脂糖電泳和Nanodrop檢測(cè)RNA的完整性，OD260/280為1.8-2.2之間，28S：18S≥ 1。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 用Oligo（dT）25磁珠進(jìn)行mRNA的純化；mRNA破碎后，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈和第二鏈，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，利于cluster station制備測(cè)序樣品簇，Hiseq2000上機(jī)測(cè)序，每個(gè)菌株測(cè)定1個(gè)樣品。

1.2.3 生物信息學(xué)分析數(shù)據(jù) 過(guò)濾原始數(shù)據(jù)后，采用Trinity軟件進(jìn)行序列組裝，利于Blast進(jìn)行Unigene的比對(duì)；對(duì)Unigene進(jìn)行GO注釋及功能分類統(tǒng)計(jì)；將Unigene和COG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析及功能分類統(tǒng)計(jì)；在KEGG網(wǎng)站進(jìn)行代謝通路的分析；采用FPKM法進(jìn)行基因表達(dá)量計(jì)算，進(jìn)行基因差異表達(dá)分析。

1.2.4 熒光定量PCR（qPCR） 按照1.2.1進(jìn)行RNA的提取以及DNA的消化，采用Revert Aid First stand cDNA synthesis kit 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行熒光定量PCR，反應(yīng)體系如下：上下游引物各10 pmol，cDNA 1 μL，SYBR Premix Ex Taq Mix 10 μL，RoxⅡ 0.4 μL，ddH2O補(bǔ)充水至20 μL。ABI7500進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及數(shù)據(jù)組裝注釋

白靈側(cè)耳JZB2106010和JZB2106103菌株采用Hiseq2000進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，采用Trinity進(jìn)行序列的組裝拼接。JZB2106010獲得26 136個(gè)Unigene，JZB2106103獲 得 27 753個(gè) Unigene， 共計(jì)獲得30 125個(gè)Unigene。通過(guò)blastx將Unigene序列比對(duì)到蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)NR、Swiss-Prot、KEGG和COG（evalue＜0.00001）， 并 通 過(guò) blastn 將 Unigene比對(duì)到核酸數(shù)據(jù)庫(kù) Nt（evalue＜0.00001），得到跟給定Unigene具有最高序列相似性的蛋白，從而得到該Unigene的蛋白功能注釋信息。共計(jì)22 923個(gè)Unigene能夠比對(duì)到NR數(shù)據(jù)庫(kù)，占Unigene基因總數(shù)的76.1%。

2.2 Unigene的GO和COG分類

對(duì)Unigene進(jìn)行GO功能注釋和分類，在生物過(guò)程（Biological process）、細(xì)胞組成（Cellular component）和分子功能（Molecular function）3個(gè)本體中，分別獲得15 821、8 250和10 647個(gè)注釋條目。COG是對(duì)基因產(chǎn)物進(jìn)行直系同源分類的數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)白靈菇的Unigene進(jìn)行了功能分類，其中4 203個(gè)Unigene被歸在了R類（General function prediction only）， 占 Unigene總 數(shù) 的 17.1%；其 中 2099個(gè)Unigene被歸在了K類（Transcription），占Unigene總數(shù)的8.6%（圖1）。

圖1 COG功能注釋

2.3 Unigene差異表達(dá)分析

由圖2可知，白靈側(cè)耳JZB2106103相對(duì)于JZB2106010有1 056個(gè)Unigene表達(dá)量上調(diào)，658個(gè)Unigene表達(dá)量下調(diào)。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能分析，結(jié)果（圖3）顯示在生物過(guò)程中差異基因數(shù)目最多的是代謝過(guò)程（Metabolic process），共計(jì)224個(gè)基因；細(xì)胞組成中差異基因數(shù)目最多的是細(xì)胞膜（Membrane），共計(jì)64個(gè)基因；分子功能中差異基因最多的是催化活性（Catalytic activity）共計(jì)276個(gè)基因。

圖2 白靈側(cè)耳JZB2106010和JZB2106103的基因差異表達(dá)

圖3 白靈側(cè)耳JZB2106010和JZB2106103的差異表達(dá)基因功能分類

2.4 差異表達(dá)基因的驗(yàn)證

選取代謝過(guò)程（metabolic process）和催化活性（catalytic activity）中部分差異表達(dá)量顯著的基因進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證，同時(shí)也選取白靈菇JZB2106010和JZB2106103差異表達(dá)量最大的Unigene7793進(jìn)行驗(yàn)證（引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1）。從圖3中可以看出Unigene7793、Unigene7650、Unigene9911、Unigene9496、Unigene9850、Unigene8969、Unigene9302、Unigene9849在不形成子實(shí)體的白靈菇JZB2106103中比JZB2106010表達(dá)顯著上調(diào)，其中Unigene7793的表達(dá)量上調(diào)幅度大，為1 046.41倍，Unigene8969基因表達(dá)量上調(diào)幅度在供試基因中最低，為8.75倍；CL4509和CL2173在JZB2106010表達(dá)顯著上調(diào)，分別是JZB2106103的3.33倍和8.33倍（表2）。結(jié)果顯示CL4509和CL2173的高表達(dá)利于白靈側(cè)耳子實(shí)體的發(fā)育，而其他8個(gè)基因的低表達(dá)有利于白靈側(cè)耳子實(shí)體的發(fā)育。

3 討論

食用菌子實(shí)體發(fā)育相關(guān)基因的研究是一項(xiàng)復(fù)雜且具有重要理論和實(shí)際意義的工作［14］。在食用菌中常通過(guò)分析菌絲期和子實(shí)體形成期基因差異表達(dá)情況分析與子實(shí)體發(fā)育相關(guān)的基因，包括mRNA差異顯示技術(shù)［15］、轉(zhuǎn)錄組技術(shù)、雙向電泳技術(shù)［16］和蛋白質(zhì)組分析［17］等。其中轉(zhuǎn)錄組技術(shù)優(yōu)勢(shì)顯著，該方法無(wú)需預(yù)先設(shè)計(jì)特異性探針，因此無(wú)需了解物種基因或基因組信息，直接對(duì)任何物種進(jìn)行最全面的轉(zhuǎn)錄組分析，且高通量測(cè)序成本的降低為全局考慮食用菌子實(shí)體形成的基因表達(dá)狀態(tài)及調(diào)控提供便利。

近年來(lái)利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在挖掘食用菌子實(shí)體發(fā)育相關(guān)基因上取得了一定的進(jìn)展。Fu等［12］通過(guò)比較轉(zhuǎn)錄組分析了白靈菇在后熟菌絲期、冷刺激的菌絲期、原基期和子實(shí)體形成期4個(gè)生長(zhǎng)不同階段基因的表達(dá)情況，篩選出了不同時(shí)期的差異表達(dá)基因，主要涉及形態(tài)發(fā)生、基礎(chǔ)碳代謝、冷刺激和藍(lán)光反應(yīng)相關(guān)基因。Tao等［18］分別采集了草菇生長(zhǎng)發(fā)育不同階段的樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，菌絲體到原基期共得到1 503個(gè)差異表達(dá)基因，子實(shí)體形成的蛋形期到伸長(zhǎng)期具有1 367個(gè)差異基因，通過(guò)對(duì)差異基因進(jìn)行功能富集和代謝途徑分析表明，在原基期上調(diào)表達(dá)的基因主要涉及到對(duì)細(xì)胞和代謝過(guò)程的調(diào)節(jié)，下調(diào)的基因參與的主要生物過(guò)程為細(xì)胞組分的生物合成；蛋形期到伸長(zhǎng)期顯著下調(diào)的是參與細(xì)胞分裂的基因。Yu等［19］對(duì)靈芝菌絲和子實(shí)體進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，在菌絲生長(zhǎng)階段表達(dá)上調(diào)的是生物合成相關(guān)的基因，如氨基酸代謝合成，ATP合成等，而相反的在子實(shí)體階段與降解相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)，同時(shí)電子傳遞、能量代謝相關(guān)的基因在子實(shí)體中的表達(dá)量也上調(diào)。Zhou等［20］同樣采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析了毛木耳菌絲與子實(shí)體發(fā)育不同階段的基因差異表達(dá)，結(jié)果表明homeobox類型的轉(zhuǎn)錄因子在子實(shí)體中表達(dá)上調(diào)，而鋅指類轉(zhuǎn)錄因子在菌絲中表達(dá)上調(diào)，裂褶菌中具有同樣的結(jié)果。

表1 熒光定量PCR所用的基因及引物

表2 基因表達(dá)量的熒光定量PCR驗(yàn)證

本實(shí)驗(yàn)首次分別以能夠正常形成子實(shí)體的白靈菇雙核菌株JZB2106010和不能夠形成子實(shí)體的白靈菇雙核菌株JZB2106103為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得了兩株菌基因差異表達(dá)數(shù)據(jù)，并進(jìn)行富集分析，獲得了一些與白靈側(cè)耳子實(shí)體發(fā)育相關(guān)的基因，包括文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道的基因（如碳代謝相關(guān)基因），JZB2106010和JZB2106103中具有表達(dá)差異的基因有22 個(gè)，包括CL3723.Contig1、CL3291.Contig1、Unigene1780等；選取部分表達(dá)量差異顯著的基因進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證，獲得了一些之前文獻(xiàn)未報(bào)道過(guò)的與白靈側(cè)耳子實(shí)體發(fā)育相關(guān)的基因。JZB2106010和JZB2106103中基因表達(dá)差異最大的Unigene7793，編碼 ATP依賴的DNA解旋酶，解旋酶是一類參與核酸代謝的重要保守酶類，如核酸復(fù)制、重組、修復(fù)和轉(zhuǎn)錄等［21］，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DNA解旋酶基因的表達(dá)與子實(shí)體發(fā)育呈負(fù)相關(guān)。類苯丙烷類在維管植物的生長(zhǎng)、發(fā)育中是必需的，苯丙氨酸裂解酶（PAL）是類苯丙烷類代謝途徑的第一步，參與黃酮類、苯丙烷類和木質(zhì)素等物質(zhì)的合成［22］，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)了PAL與白靈側(cè)耳的子實(shí)體發(fā)育相關(guān)；乙醇氧化酶參與了真菌木質(zhì)素的降解［23］，在能夠形成子實(shí)體的白靈側(cè)耳中乙醇氧化酶基因表達(dá)量顯著提高，也說(shuō)明它與白靈側(cè)耳子實(shí)體的發(fā)育相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)的與白靈側(cè)耳子實(shí)體發(fā)育相關(guān)基因?yàn)榘嘴`側(cè)耳的分子遺傳育種奠定基礎(chǔ)，后續(xù)應(yīng)進(jìn)一步明確基因功能以及遺傳性狀之間的關(guān)系。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以JZB2106010和JZB2106103為實(shí)驗(yàn)材料，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得了兩個(gè)菌株的差異表達(dá)基因并進(jìn)行了功能富集分析，其中催化活性和代謝過(guò)程本體中差異基因數(shù)目最多，選取部分表達(dá)差異顯著的基因通過(guò)熒光定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示編碼苯丙氨酸裂解酶的基因（CL4509）和編碼乙醇氧化酶的基因（CL2173）在JZB2106010中表達(dá)量顯著提高，與白靈側(cè)耳的子實(shí)體發(fā)育相關(guān)；另外還發(fā)現(xiàn)一個(gè)編碼DNA解旋酶的基因（Unigene7793）在JZB2106103中的表達(dá)量是JZB2106010的1046倍，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該基因的大量表達(dá)是JZB2106103不能結(jié)實(shí)的一個(gè)原因。

［1］ 譚笑, 滕立平, 路楊, 等. 白靈側(cè)耳（白靈菇）雜交育種研究進(jìn)展［J］. 菌物研究 , 2015, 13（3）：175-180.

［2］ Zhao M, Zhang J, Chen Q, et al. The famous cultivated mushroom Bailinggu is a separate species of thePleurotus eryngiispecies complex［J］. Scientific Reports, 2016, 6：33066.

［3］ 馮作山, 胡清秀, 張瑞穎等. 白靈側(cè)耳研究進(jìn)展［J］. 食用菌學(xué)報(bào) , 2010, 17（3）：73-77.

［4］ Fu YP, Liang Y, Dai YT, et al.De Novosequencing and transcriptome analysis ofPleurotus eryngiisubsp.tuoliensis（Bailinggu）mycelia in response to cold stimulation［J］,Molecules, 2016, 21（5）. pii：E560.

［5］ 許峰, 劉宇, 王守現(xiàn), 等. 北京地區(qū)白靈菇菌株的RAPD分析［J］. 生物技術(shù) , 2010, 20（4）：21-23.

［6］ Cha YJ, Alam N, Lee JS, et al. Anticancer and immunopotentiating activities of crude polysaccharides fromPleurotus nebrodensison mouse sarcoma 180［J］. Mycobiology, 2012, 40（4）：236-243.

［7］ Wang C, Cui H, Wang Y, et al. Bidirectional immunomodulatory activities of polysaccharides purified fromPleurotus nebrodensis［J］. Inflammation, 2014, 37（1）：83-93.

［8］ Ren Z, Li J, Xu N, et al. Anti-hyperlipidemic and antioxidant effects of alkali-extractable mycelia polysaccharides byPleurotus eryngiivar. tuolensis［J］. Carbohydr Polym, 2017, 175 ：282-292.

［9］ Yan B, Jing L, Wang J, et al. A polysaccharide（PNPA）fromPleurotus nebrodensisoffers cardiac protection against ischemiareperfusion injury in rats［J］. Carbohydr Polym, 2015, 133 ：1-7.

［10］ 張金霞, 黃晨陽(yáng), 張瑞穎, 等. 白靈菇中農(nóng)1號(hào)特征特性和栽培技術(shù)要點(diǎn)［J］. 食用菌學(xué)報(bào), 2010（3）：87-89.

［11］ 陳苗苗, 黃晨陽(yáng), 陳強(qiáng), 等. 白靈側(cè)耳結(jié)實(shí)相關(guān)基因片段的篩選與分析［J］. 生物技術(shù), 2013, 23（3）：4-8.

［12］ Fu Y, Dai Y, Yang C, et al. Comparative transcriptome analysis identified candidate genes related to Bailinggu mushroom formation and genetic markers for genetic analyses and breeding［J］.Scientific Reports, 2017, 7（1）：9266.

［13］ 李莎, 劉宇, 等. 原生質(zhì)體單核化技術(shù)在白靈菇菌種提純復(fù)壯中的作用［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 43（5）：248-250.

［14］ 申進(jìn)文, 粱思思, 邱立友, 等. 糙皮側(cè)耳子實(shí)體發(fā)育相關(guān)基因fst3的克隆及分析［J］. 食用菌學(xué)報(bào), 2015, 22（1）：15-20.

［15］ 季哲, 李玉祥, 趙明文, 等. 運(yùn)用mRNA差異顯示技術(shù)研究黃傘發(fā)育相關(guān)基因［J］. 菌物學(xué)報(bào), 2007, 26（2）：243-248.

［16］ 陳美元. 雙孢蘑菇子實(shí)體原基與菇蕾蛋白質(zhì)表達(dá)變化分析［J］.食用菌學(xué)報(bào),2012, 19（3）：15-20.

［17］ 陳美元, 廖劍華, 李洪榮, 等. 雙孢蘑菇子實(shí)體發(fā)育不同階段蛋白質(zhì)組分析［J］. 菌物學(xué)報(bào), 2015, 34（6）：1153-1164.

［18］ Tao Y, van Peer AF, Chen B, et al. Gene expression profiling reveals large regulatory switches between succeeding stipe stages in Volvariella volvacea［J］. PLoS One, 2014, 9（5）：e97789.

［19］ Yu GJ, Wang M, Huang J, et al. Deep Insight into theGanoderma lucidumby comprehensive analysis of its transcriptome［J］.PLoS One, 2012, 7（8）：e44031.

［20］ Zhou Y, Chen L, Fan X, et al.De novoassembly ofAuricularia polytrichatranscriptome using Illumina sequencing for gene discovery and SSR marker identification［J］. PLoS One, 2014, 9（3）：e91740.

［21］ Limudomporn P, Moonsom S, Leartsakulpanich U, et al.Characterization ofPlasmodium falciparumATP-dependent DNA helicase RuvB3［J］. Malaria Journal, 2016, 15（1）：526.

［22］ Purwar S, Sundaram S, Sinha S, et al. Expression and in silico characterization of Phenylalanine ammonium lyase against karnal bunt（Tilletia indica）in wheat（Triticum aestivum）［J］.Bioinformation, 2013, 9（20）：1013-1018.

［23］ Galperin I, Javeed A, Luig H, et al. An aryl-alcohol oxidase ofPleurotus sapidus：heterologous expression, characterization, and application in a 2-enzyme system［J］. Appl Microbiol Biotechnol,2016, 100（18）：8021-8030.