龔睿 孫凱 謝道月

（農(nóng)田生態(tài)保育與污染防控安徽省重點實驗室 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院 合肥230036）

漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，它能夠以氧分子作為最終的電子接受體催化氧化酚類和非酚類底物的氧化、降解或聚合反應(yīng)［1-2］。目前，自然界中關(guān)于漆酶的研究主要集中于真菌分泌的胞外漆酶，分泌漆酶的真菌主要包括擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、子囊菌門（Ascomycota）和半知菌類（Deuteromycota），其中最重要的是擔(dān)子菌門中的白腐真菌［3-5］。漆酶的催化活性中心包含3個Cu2+結(jié)合位點，共結(jié)合4個Cu2+協(xié)同介導(dǎo)酚類和非酚類底物的催化氧化反應(yīng)［6-8］。Park等［9］主要采用紫外分光光度法測定漆酶的催化氧化活性，其常用的顯色底物包括2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、2，6-甲氧基苯酚（DMP）和愈創(chuàng)木酚等。漆酶對不同底物的親和力和催化效能具體表現(xiàn)在米氏常數(shù)（Km）和最大反應(yīng)速率常數(shù)（Vmax）值上［10-12］。

漆酶的底物廣譜性和多功能特征決定了其能夠作為一種環(huán)境友好型“綠色催化劑”，并在各個領(lǐng)域得到廣泛地應(yīng)用［13-14］。例如，漆酶已經(jīng)用于有機(jī)污染物轉(zhuǎn)化、合成染料脫色、造紙廢水、食品加工、生物傳感器和環(huán)境質(zhì)量指示器等諸多綠色環(huán)境化學(xué)工程中［15-20］。此外，固定化技術(shù)的快速發(fā)展也為增強(qiáng)真菌漆酶在環(huán)境中的催化活性、穩(wěn)定性和循環(huán)再利用能力提供了可靠保障［7，21］。本文綜述了真菌漆酶的分子組成、結(jié)構(gòu)特征及其催化氧化酚類和非酚類底物的作用機(jī)制，系統(tǒng)地比較了固定化漆酶的制備技術(shù)及其優(yōu)缺點，重點剖析了真菌漆酶在綠色環(huán)境化學(xué)中的最新研究進(jìn)展及其潛在的應(yīng)用價值，旨在為拓展和開發(fā)固定化漆酶技術(shù)解決環(huán)境領(lǐng)域面臨的諸多問題提供有力的參考依據(jù)。

1 真菌漆酶的分子組成、結(jié)構(gòu)特征及其催化機(jī)制

1.1 分子組成和結(jié)構(gòu)特征

漆酶分子一般由單一多肽組成，共含有18種氨基酸（約500-550個）。真菌漆酶是一種酸性等電點單體糖蛋白，其分子量為40-110 kD，糖基化程度占10%-25%［22-23］。一方面，糖基化對真菌漆酶的分泌、異源性生產(chǎn)、催化活性和穩(wěn)定性等均可能產(chǎn)生不同程度的影響且難以克服；另一方面，糖基化也可以防控漆酶的蛋白質(zhì)降解［24-25］。漆酶的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)研究結(jié)果表明［11，26］，漆酶含有3個Cu2+結(jié)合位點，根據(jù)氧化還原電勢、光學(xué)和磁學(xué)特征可分為 3 種類型：T1（I Cu2+）、T2（II Cu2+）和 T3（IIIa Cu2+和IIIb Cu2+）（圖 1-A、B）。第一類（T1）和第二類（T2）各1個，是單電子受體，呈順磁性。漆酶的T1位點在610 nm處有強(qiáng)烈的光吸收作用，導(dǎo)致漆酶呈現(xiàn)出藍(lán)綠色，其吸收光譜帶來源于Cu2+與半胱氨酸的共價結(jié)合；漆酶介導(dǎo)的底物催化氧化過程發(fā)生在T1位點，它可以從底物中獲取電子并傳遞給水中的溶解氧分子［11，27-28］。漆酶的T2位點不穩(wěn)定，由兩分子咪唑和單分子水配位形成松散的扭曲四面體幾何構(gòu)型，在可見光區(qū)的吸收峰較弱；當(dāng)有螯合劑存在時，T2位點能夠被選擇性的還原去除，從而導(dǎo)致漆酶的活性顯著性下降［29］。漆酶的第三類（T3）位點呈反磁體，由兩個III Cu2+構(gòu)成一個雙核銅簇中心，該銅簇中心在330 nm的紫外可見光譜處具有明顯地吸收峰［24，27，30-31］。漆酶的 T1、T2 和 T3位點共同構(gòu)成銅簇位點的四面體幾何構(gòu)型（圖1-A）。

1.2 漆酶的作用機(jī)制

真菌漆酶能夠催化氧化酚類和非酚類底物的單電子氧化產(chǎn)生自由基中間體，隨后這些自由基中間體涉及到氧化耦合或目標(biāo)底物的鍵斷裂，最終導(dǎo)致底物發(fā)生氧化、降解或聚合反應(yīng)（圖1-C）。酶促反應(yīng)過程主要包括漆酶分子對底物的作用、電子在漆酶分子中的傳遞、氧分子對漆酶分子的還原和產(chǎn)物的反作用［25］，即T1活性位點的Cu2+從還原態(tài)的底物吸收電子，底物被氧化形成自由基，從而導(dǎo)致不同非銅簇的次級反應(yīng)，如羥化、歧化和聚合反應(yīng)等。真菌漆酶的整個催化循環(huán)過程中，單個分子的氧被還原成兩個分子的水，4個底物分子被氧化形成4個自由基中間體［6，32］。芳烴類、抗生素、藥物和木質(zhì)素等大分子或具有較高氧化還原電勢的底物分子需要氧化還原介質(zhì)的參與才能被漆酶催化氧化［27，33-35］。這些介質(zhì)分子與漆酶進(jìn)行反應(yīng)，生成的自由基狀態(tài)分子再氧化大體積或高氧化還原電勢的底物分子［36］。以芳烴類化合物為例，漆酶分子催化氧化芳烴類化合物，首先從底物傳遞一個電子到專門的含銅位點以形成自由基，這些自由基能夠重新排列并通過歧化或互變異構(gòu)化等反應(yīng)生成等量的醌和氧化底物，并進(jìn)一步促使烷基-苯基裂開，苯基醇氧化及支鏈和芳香環(huán)裂解［37-39］。

2 固定化真菌漆酶的制備及其優(yōu)缺點

圖1 真菌漆酶的二級空間結(jié)構(gòu)、活性中心位點和催化氧化功能示意圖

雖然，漆酶作為一種“綠色催化劑”具有低成本、高效率、環(huán)境友好和可持續(xù)等優(yōu)點，但是，其在綠色環(huán)境化學(xué)中的應(yīng)用受到諸多限制，如缺乏長期的穩(wěn)定性、難以回收和循環(huán)再利用等［26］。此外，漆酶的活性也會受到溫度、pH、金屬離子和抑制劑等諸多環(huán)境因子的影響，其作用機(jī)理可能是氨基酸的修飾作用、酶空間結(jié)構(gòu)的改變或者是與底物結(jié)合位點的相互作用［40］。如何增強(qiáng)漆酶的催化活性、穩(wěn)定性和循環(huán)再利用功效是推廣其在環(huán)境中應(yīng)用的首要任務(wù)。研究指出［7，41］，采用吸附、包埋、共價綁定和交聯(lián)結(jié)合等方法（圖2）將游離態(tài)漆酶固定在載體上制備固定化漆酶，可以提高漆酶的催化活性、穩(wěn)定性和重復(fù)利用率，增強(qiáng)漆酶在實際環(huán)境中的應(yīng)用。常用的固定化載體具有以下特點［7，41］：（1）載體材料易獲得且價格低廉；（2）固定化操作簡便且能用于大規(guī)模生產(chǎn)；（3）載體機(jī)械強(qiáng)度高且具有較長的使用周期和重復(fù)利用率。

2.1 吸附法

吸附法包括物理吸附法和離子吸附法。（1）物理吸附法是指將漆酶液與活潑吸附載體接觸，利用分子間相互作用力使酶吸附在載體表面［21］。采用物理吸附法固定漆酶的研究中，常用的載體包括石墨、纖維素和活性炭等可導(dǎo)電物質(zhì)，它們能夠與漆酶形成高性能的生物傳感器，可以用來監(jiān)測水溶液中的酚類物質(zhì)。物理吸附的優(yōu)點是固定化技術(shù)簡單、可供選擇的載體較多、不會改變酶的空間構(gòu)象和催化性能等，其主要的缺點是酶和載體之間的結(jié)合力較弱、固定化酶的可重復(fù)利用率低［42］。（2）離子吸附法是指將漆酶與含有離子交換基團(tuán)的疏水性載體以靜電作用力相結(jié)合的一種固定化方法，其常用的載體有陰離子交換劑和陽離子交換劑［43］。該方法反應(yīng)條件溫和且不會改變漆酶的空間結(jié)構(gòu)和活性中心的氨基酸序列，可以獲得較高活性的固定化漆酶。

2.2 包埋法

包埋法分為網(wǎng)格型和微囊型兩種，即將漆酶包裹于凝膠形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中或半透膜聚合物的超濾膜內(nèi)，從而實現(xiàn)漆酶的固定化［44］。包埋法主要采用惰性材料作為載體，維持酶促反應(yīng)過程中漆酶的活性，其優(yōu)點是反應(yīng)條件溫和、不會引起漆酶的空間構(gòu)象和分子結(jié)構(gòu)變化、漆酶活性和回收利用率較高［45］。（1）凝膠包埋法。凝膠包埋法常用的載體包括海藻酸鈉凝膠、瓊脂凝膠、明膠和角叉萊膠等。例如，采用明膠和海藻酸鈉的聚合作用與海藻酸鈣凝膠球的包埋作用制備固定化漆酶，不僅可以延長固定化漆酶的使用周期，也能夠提高其機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定性。（2）微囊包埋法。微囊包埋法可以使漆酶存在于類似細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境中，增強(qiáng)漆酶的穩(wěn)定性，其常用的載體有硝酸纖維素、乙基纖維素和聚苯乙烯等［45］。代云容等［46］研究指出，采用乳液靜電紡絲技術(shù)將漆酶包埋在纖維內(nèi)部，能夠顯著增強(qiáng)漆酶對pH和溫度等環(huán)境因素變化的耐受性，其穩(wěn)定性得到顯著性提高。

圖2 漆酶的固定化技術(shù)

2.3 共價綁定法

漆酶的共價綁定法一般分為兩類：一是將固定化載體上的有關(guān)基團(tuán)用二酰亞胺等活化，隨后與漆酶發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)；二是在載體上加入一個雙功能試劑，然后將漆酶偶聯(lián)上去。該方法在酶蛋白分子上的功能基團(tuán)和載體表面上的反應(yīng)基團(tuán)之間形成牢固的化學(xué)共價鍵結(jié)合，致使漆酶不易從載體上脫落并保持較高的穩(wěn)定性。例如，采用特定的化學(xué)試劑活化廉價易得的硅膠、陶瓷、土壤和蒙脫石等載體用于固定Trametes versicolor漆酶已經(jīng)取得了較好的固定化效果，且該類固定化漆酶具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)利用性［42］。Xu等［47］研究指出，將酶固定在氨基修飾的介孔分子篩（SBA-15）上能夠保證其具有更好的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定效能，且該酶重復(fù)使用五次后，其活性仍可達(dá)到初始值的49.2%。然而需指出，共價綁定法的缺點是載體的活化和固定化操作比較復(fù)雜、反應(yīng)比較劇烈，需要嚴(yán)格控制條件才能獲得活力較高的固定化漆酶［21］。

2.4 交聯(lián)結(jié)合法

交聯(lián)結(jié)合法的基本原理是利用雙功能或多功能試劑在酶分子間、酶分子與惰性蛋白或酶分子與載體間進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，把酶蛋白分子彼此交叉連接起來形成交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。常用的交聯(lián)劑是戊二醛，該固定化方法常與吸附法和包埋法結(jié)合使用，不僅可以提高固定化漆酶的活性，也起到加固作用［48］。王穎等［49］研究表明，與游離態(tài)漆酶相比，以殼聚糖為載體通過交聯(lián)法固定漆酶，在pH 2.5-4.0范圍內(nèi)其活性較為穩(wěn)定，25℃保存10 d后酶活仍為初始酶活性的88.70%。杜東霞等［50］以海藻酸鈉為載體，戊二醇為交聯(lián)劑制備的固定化漆酶在pH 4.5、底物濃度40 mg/L和反應(yīng)溫度65℃的水浴鍋中脫色降解3 h后，對染料剛果紅的脫色率高達(dá)92.6%，并且該酶可以重復(fù)使用。基于以上結(jié)果可知，與游離態(tài)漆酶相比，采用交聯(lián)結(jié)合法固定漆酶可以顯著地提高酶的適應(yīng)能力、耐熱性和貯存穩(wěn)定性等。

2.5 固定化漆酶的利弊

與游離態(tài)漆酶對比，固定化漆酶有很多優(yōu)勢，如提高酶的活性、穩(wěn)定性、溫度和pH適應(yīng)性及循環(huán)再利用率等［7，51］。同時，固定化漆酶也可實現(xiàn)酶促反應(yīng)的連續(xù)生產(chǎn)及嚴(yán)控酶反應(yīng)過程、增加產(chǎn)物回收率、提高產(chǎn)物質(zhì)量，適用于產(chǎn)業(yè)化、連續(xù)化和自動化生產(chǎn)［52］。與此同時，由于漆酶的分離和固定化處理等原因，其也具備一些弊端，如固定化過程中造成酶活性損失、可能改變漆酶的空間構(gòu)象和分子結(jié)構(gòu)、引起酶活性位點的變化等。表1總結(jié)了4種常見的漆酶固定化方法的優(yōu)缺點。

3 真菌漆酶在環(huán)境中的應(yīng)用

固定化酶是酶工程的核心，它有利于實現(xiàn)酶的重復(fù)再利用及產(chǎn)物與酶的再分離，使酶工程達(dá)到一個嶄新的應(yīng)用水平。真菌漆酶因具備多功能特性和廣譜功效而備受關(guān)注。目前，漆酶已經(jīng)在化學(xué)、生物學(xué)和生物工程等多個學(xué)科領(lǐng)域得到廣泛地應(yīng)用，并取得了較好的經(jīng)濟(jì)效益和實際價值（圖3）。例如，漆酶在環(huán)境有機(jī)污染物去除、合成染料脫色、造紙廢水、食品工業(yè)、生物監(jiān)測和環(huán)境質(zhì)量指示劑等綠色化學(xué)中皆有應(yīng)用［15-20］。

表1 四種固定化方法的優(yōu)缺點

圖3 漆酶在綠色環(huán)境化學(xué)中的多功能應(yīng)用

3.1 催化氧化有機(jī)污染物

環(huán)境中酚類污染物、多環(huán)芳烴（PAHs）、抗生素和藥物等污染備受國際關(guān)注。其在環(huán)境中長期穩(wěn)定存在，對野生物種具有毒害作用，且難以通過化學(xué)和生物過程降解代謝［53-54］。漆酶能催化氧化多種難降解有機(jī)污染物（表2），其催化氧化能力與漆酶的氧化還原能力和底物的電勢能密切相關(guān)，電勢能較高的底物會阻礙漆酶的氧化還原能力［17，36，55］。漆酶介導(dǎo)酚類污染物的轉(zhuǎn)化主要通過氧化耦合反應(yīng)形成多種復(fù)雜性聚合物［2］；而針對非酚類惰性有機(jī)污染物，漆酶需要反應(yīng)活性分子的參與共同完成底物的氧化降解過程。添加氧化還原介質(zhì)可以極大的促進(jìn)漆酶的活性及其對惰性有機(jī)污染物的催化氧化反應(yīng)。研究表明［56］，漆酶能夠通過聚合和氧化降解反應(yīng)有效地摧毀雌激素類化合物的雌激素活性。另有研究指出［57］，從菌株白腐真菌（Marasmius quercophilus）中分離出的不同亞類漆酶能夠有效地轉(zhuǎn)化PAHs中的蒽和苯并［a］芘，但對萘和菲無效果。PAHs的電離電位影響它們的酶促反應(yīng)效能，該亞類漆酶僅能夠轉(zhuǎn)化電離電位小于7.55 eV的PAHs。

3.1.1 催化氧化水中有機(jī)污染物 研究指出［2，58］，Pleurotus ostreatus漆酶能夠催化氧化雌二醇和三氯生，并通過自由基介導(dǎo)的C-C或C-O-C耦合反應(yīng)形成二聚體、三聚體和四聚體等聚合產(chǎn)物。夏青等［59］研究表明，漆酶能夠有效地催化雙酚A、雌二醇、炔雌醇、雌銅和辛基酚等雌激素的轉(zhuǎn)化；當(dāng)呈現(xiàn)天然有機(jī)質(zhì)時，在反應(yīng)初期可抑制該5種雌激素的去除效率，而反應(yīng)后期無顯著性影響。陳輝等［60］研究證實，固定化漆酶能夠提高酶的穩(wěn)定性和重復(fù)利用率，可用于連續(xù)降解2，4-二氯苯酚（2，4-DCP），在連續(xù)反應(yīng)6 h后其對2，4-DCP的降解率仍然保持在60%以上。王穎等［49］研究指出，采用殼聚糖固定漆酶對2，4-DCP具有良好的吸附-催化氧化效能，且隨著反應(yīng)時間的遞增，溶液中氯離子濃度逐漸增加。氣相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)技術(shù)分析結(jié)果表明，2，4-DCP的可溶性降解產(chǎn)物主要包括2-羥基丙二酸和3-羥基-順，順-黏糖酸。

3.1.2 催化氧化土壤中有機(jī)污染物 固定化漆酶在土壤中的應(yīng)用主要表現(xiàn)在修復(fù)土壤污染。Singh等［61］研究表明，漆酶對土壤中17β-雌二醇的轉(zhuǎn)化具有較好的調(diào)控作用，反應(yīng)5 h后土壤中17β-雌二醇的去除率高達(dá)98%以上，而漆酶的活性無顯著性變化。趙月春等［62］采用游離態(tài)漆酶處理土壤二氯二苯三氯乙烷（DDT）污染，DDT總降解率為50.53%，而在固定化反膠團(tuán)漆酶處理中DDT總降解率高達(dá)69.17%，且固定化反膠團(tuán)漆酶對DDT各組分的降解均高于游離態(tài)漆酶。另有研究［63-64］將Trametes orientalis漆酶加入老化的PAHs污染土壤，培養(yǎng)10 d后，該酶對蒽和苯并［a］芘的轉(zhuǎn)化率分別為52.7%和40.8%，添加ABTS可以提高其對PAHs的轉(zhuǎn)化效率。此外，采用可生物降解的高分子外消旋聚乳酸作為原料，結(jié)合乳液電紡技術(shù)將漆酶包埋固定在納米纖維中，也可以有效地去除土壤中菲、熒蒽、苯并［a］蒽和苯并［a］芘等 PAHs［65］。

3.2 合成染料的脫色反應(yīng)

合成類染料已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于染色工藝和印刷產(chǎn)業(yè)，其種類繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜且難降解，并具有生物毒性和致畸效應(yīng)。每年大約有10%的合成染料經(jīng)過不同的水通道進(jìn)入環(huán)境中，它們可以改變水體的理化性質(zhì)，對水生物種造成潛在的危害。研究指出［22］，采用高效脫色生物酶進(jìn)行合成染料的脫色處理，具有成本低、無二次污染和經(jīng)濟(jì)有效等特點。真菌漆酶能夠有效地去除生色團(tuán)化合物，如偶氮、三芳基甲烷、酸性紫、蒽醌和靛藍(lán)類染料等，實現(xiàn)對合成染料的脫色，且多數(shù)在10 min內(nèi)即可達(dá)到80% 的脫色率［6-7，75-76］。例如，Trametes hirsute產(chǎn)生的漆酶不僅可以用于紡織染料的脫色和解毒，對靛藍(lán)類染料、偶氮和蒽醌染料也具有相同的效果［19］。趙林果等［77］研究發(fā)現(xiàn)，采用自制復(fù)合型載體丙烯酸酯類聚合物固定的漆酶在酶用量為12.5 U/mL、染料濃度為150 mg/L、反應(yīng)溫度為45-55℃和pH 4.5-5.0的條件下脫色降解酸性紫43，反應(yīng)4 h后染料酸性紫43的脫色率高達(dá)98.5%。另有研究指出［78］，綠椰纖維對染料RB5的吸附脫色率為23%，固定化空白小球?qū)θ玖蟁B5的吸附脫色率為11.95%，而采用固定化漆酶-介體系統(tǒng)對染料RB5的脫色率高達(dá)92.5%。由此可見，利用漆酶的固定化技術(shù)可以對合成染料進(jìn)行有效脫色。

表2 真菌漆酶催化氧化有機(jī)污染物的轉(zhuǎn)化動力學(xué)及其主要產(chǎn)物分布

3.3 造紙工業(yè)中的應(yīng)用

漆酶在造紙工業(yè)中的應(yīng)用主要包括紙漿的生物漂白、木質(zhì)素降解和造紙廢水處理等。與傳統(tǒng)的化學(xué)方法相比，通過漆酶參與的生物制漿工藝在降低能耗和節(jié)約設(shè)備的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步避免了傳統(tǒng)化學(xué)方法降解木質(zhì)素時不夠徹底的問題。與此同時，用漆酶進(jìn)行的生物制漿也避免了傳統(tǒng)的氯化物漂白產(chǎn)生廢水污染和漂白后紙張極易反彈等一系列的弊端現(xiàn)象，顯著地提高了紙張的質(zhì)量和強(qiáng)度。

生物漂白技術(shù)是一種綠色環(huán)保型漂白方法，可提高紙漿的可漂性，減少化學(xué)藥品的使用量及其對環(huán)境的污染。付時雨等［79］研究了漆酶/介體系統(tǒng)漂白尾葉桉硫酸鹽漿，結(jié)果表明，Panus conchatus漆酶在介體N-羥基乙酰苯胺的存在下進(jìn)行尾葉桉硫酸鹽漿的生物漂白，可使紙漿的卡伯值降低30%。在漆酶處理時添加表面活性劑可以增加木質(zhì)素的溶出、提高紙漿的白度，并且保持漆酶的穩(wěn)定性。漆酶在木質(zhì)素的生物降解中起著重要的作用，對纖維素原料的解構(gòu)也有很大的潛力［80］。Wang等［81］指出，不同漆酶電荷和處理時間下對木質(zhì)素的去除體現(xiàn)在兩個階段：快速初始階段和緩慢的第二階段，并發(fā)現(xiàn)大多數(shù)木質(zhì)素的降解發(fā)生在漆酶處理的前2 h內(nèi)，其后木質(zhì)素的降解率保持在一個較高的水平，直至5 h后木質(zhì)素被徹底降解。在造紙廢水方面，劉娜娜［82］指出在序批式反應(yīng)器（SBR）中投加200 mL以海藻酸鈉固定的Trametes versicolor漆酶，能夠有效地改善造紙廢水的水質(zhì)質(zhì)量，并增強(qiáng)SBR抵抗進(jìn)水負(fù)荷的沖擊能力。劉帥等［83］研究也表明，采用最佳工藝條件（反應(yīng)時間6 h、溫度50-55℃、pH 4.0）處理造紙廢水時，固定化漆酶對廢水中COD去除率為74%，色度去除率為77%。該固定化漆酶具備反應(yīng)溫度耐受性強(qiáng)、pH適應(yīng)性廣、處理效果好和反應(yīng)周期短等特點。因此，固定化漆酶技術(shù)可以廣泛地應(yīng)用于造紙工業(yè)。

3.4 在食品工業(yè)中的應(yīng)用

漆酶在食品行業(yè)具有多方面的應(yīng)用，可以用于調(diào)整食物或飲料的外觀顏色、提高葡萄酒的穩(wěn)定性。在烘焙食品中，漆酶可增加面團(tuán)的機(jī)械強(qiáng)度、穩(wěn)定性并降低它的黏性，從而改善面團(tuán)的機(jī)械加工性；漆酶在食品氣味控制和品質(zhì)提高方面也有諸多應(yīng)用［84］。此外，漆酶可以提高食品的生產(chǎn)效率和質(zhì)量，且投資成本較低［85］。漆酶能降解白酒、啤酒和果汁中的酚類物質(zhì)，保持食品的風(fēng)味、減緩食品變色和變質(zhì)的速度。很多漆酶底物，如碳水化合物、不飽和脂肪酸、酚類化合物及含疏基的蛋白質(zhì)是各種食品和飲料的重要組成部分，應(yīng)用漆酶可以改善食品品質(zhì)、降低成本。Alberts等［86］指出，Pleurotus ostreatus漆酶能夠降解一種黃曲霉毒素AFB1，并且其漆酶活性比Trametes versicolor和Penicillium等真菌強(qiáng)。例如，利用來源于Frametes versicolor的漆酶處理低芥酸菜籽產(chǎn)品（通常作為飼料飼養(yǎng)畜禽），3 h內(nèi)低芥酸菜籽中酚含量降低90%，其可能代替大豆蛋白用于食品和飼料的產(chǎn)生［88］。此外，漆酶添加在漱口水、牙膏、口香糖和薄荷糖等各種口腔用品中可以起到抑制口臭的作用［87］。

3.5 生物檢測

漆酶在催化氧化反應(yīng)中消耗氧分子，該過程容易被轉(zhuǎn)化為電信號而得到高靈敏度檢測。目前，已經(jīng)有多種漆酶在生物檢測中得到廣泛地應(yīng)用［89］。例如，利用漆酶生物傳感器可以方便快速地檢測到廢水中的酚類、芳香胺類、有機(jī)磷化合物和二噁英等有毒物質(zhì)［90-91］。

3.5.1 生物傳感器 生物傳感器是以固定化的生物成分（酶、蛋白質(zhì)、DNA抗體、抗原和生物膜等）或生物本身（細(xì)胞、微生物和組織等）為敏感材料，與適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)轉(zhuǎn)換器相結(jié)合產(chǎn)生的一種快速檢測各種物理、化學(xué)和生物量的器件，其通過各種物理、化學(xué)換能器捕捉目標(biāo)物與敏感物之間的反應(yīng)，然后將反應(yīng)的程度轉(zhuǎn)換成電信號，根據(jù)電信號推算出被測量的大小［92］。固定化漆酶使漆酶的活性、穩(wěn)定性和環(huán)境適應(yīng)能力較游離態(tài)漆酶均有所提高，其為生物傳感器的制備提供了良好的條件。漆酶傳感器是以固定化漆酶作為感受器，以基礎(chǔ)電極作為換能器的裝置。Liu等［93］將Trametes versicolor漆酶包埋在高分子聚合膠的原位電紡和納米金顆粒中，該生物傳感器在靈敏度線性范圍內(nèi)能夠檢測氯酚，檢測順序依次為 2，4-DCP ＞ 2，4，6-三氯酚 ＞ 4-氯苯酚，檢測范圍0.04-12.10 μmol/L；30 d儲存期后，漆酶依舊保留較高的重復(fù)性和酶活力（＞ 60%）。運(yùn)用纖維質(zhì)的DEAE-纖維素固定漆酶，制成兩種類型的高活力和穩(wěn)定性傳感器，用于檢測茶葉加工過程中兒茶酚的變化情況，每個酶單元可以作500次以上檢測，并在室溫下保存2個月。這種類型的傳感器也可以用來檢測來自煤炭、石油、天然氣和造紙等工業(yè)污水中的木質(zhì)素和酚類物質(zhì)等。

3.5.2 免疫檢測 在免疫檢測中，漆酶有望替代辣根過氧化物酶而成為新的標(biāo)記酶，因為漆酶具有以下幾個優(yōu)點：氧氣作為第二底物，不形成非產(chǎn)物型的酶-底物復(fù)合物；相比于過氧化物酶，漆酶對介質(zhì)中不同價態(tài)的金屬離子濃度的敏感性較低；無需特殊的儀器和試劑。漆酶在生物檢測中的應(yīng)用具有重要意義，使免疫檢測更靈敏、結(jié)果更準(zhǔn)確，使生物傳感器測定的范圍更寬、操作更簡便，不僅可以用更低廉的費(fèi)用分析更多的樣品，而且減少了有機(jī)溶劑的使用量，優(yōu)于物理化學(xué)方法［94］。

3.6 環(huán)境質(zhì)量指示器

如果采用未知污染物對環(huán)境進(jìn)行定性和定量，必須測定多種屬性，共同評估環(huán)境質(zhì)量和狀態(tài)，主要包括修復(fù)過程的實施和總結(jié)。通常選擇指示器的最小數(shù)據(jù)集，它們具有響應(yīng)性、可承受性、可解釋性、國際接受性和生態(tài)意義等。研究指出［95-96］，土壤酶能夠用于評估人類活動對土壤質(zhì)量的影響和生態(tài)系統(tǒng)的擾動，而在絲狀真菌中表達(dá)的重組漆酶可應(yīng)用于環(huán)境中酚類化合物的檢測。將漆酶吸附在碳上制成固定化酶電極能有效地催化負(fù)極氧化還原，間接地進(jìn)行環(huán)境監(jiān)測。這種方法的特點就是專一性強(qiáng)、速度快、可連續(xù)操作、手續(xù)簡便、測定結(jié)果直觀顯示并有數(shù)據(jù)記錄儲存，環(huán)境及人為因素對其影響較小，可精確測量濃度在2.0×10-5-7.0×10-4mol/L范圍內(nèi)的多酚和多氨基苯等底物，適用于一些有特殊要求的區(qū)域環(huán)境監(jiān)測，如海洋環(huán)境監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)、三峽庫區(qū)環(huán)境監(jiān)測、環(huán)境應(yīng)急響應(yīng)監(jiān)測和突發(fā)性環(huán)境事故的應(yīng)急監(jiān)測。

4 展望

綜上所述，真菌漆酶可以介導(dǎo)多種底物形成自由基中間體，并通過這些中間體的氧化、分解或耦合反應(yīng)轉(zhuǎn)化底物。吸附、包埋、共價綁定和交鏈結(jié)合等固定化技術(shù)能夠增強(qiáng)漆酶在環(huán)境中的活性、穩(wěn)定性和循環(huán)再利用能力。結(jié)合漆酶的多功能特征和固定化技術(shù)的優(yōu)勢，固定化漆酶已經(jīng)在諸多綠色環(huán)境化學(xué)中得到了廣泛地應(yīng)用。例如，將漆酶嵌入生物傳感器中可提高其探測和多功能分析能力，并有效地評估污染環(huán)境中的分子類型、檢測污染物的濃度和去除效率。此外，納米技術(shù)、微電子和微流體技術(shù)的應(yīng)用也使得漆酶生物傳感器對環(huán)境中化學(xué)物質(zhì)的檢測更加快速、準(zhǔn)確和可靠。

然而需指出，我國關(guān)于固定化漆酶在綠色環(huán)境化學(xué)中的應(yīng)用仍處于初級階段。能否建立一整套漆酶與環(huán)境之間的理想模型體系，通過分析環(huán)境中漆酶的活性和污染物之間的關(guān)系，評估污染物對環(huán)境質(zhì)量和健康指標(biāo)的影響？該理論模型值得深入發(fā)掘。另一方面，如何拓展和探究漆酶在綠色環(huán)境化學(xué)中新的應(yīng)用途徑和技術(shù)手段也是研究者今后亟待解決的難點問題。鑒于此，我國學(xué)者今后研究的重點仍需從以下幾個方面著手：（1）分離篩選高產(chǎn)漆酶真菌，推動漆酶的大規(guī)模生產(chǎn)和工業(yè)化應(yīng)用；（2）優(yōu)選高效、穩(wěn)定的固定化漆酶載體，通過修飾和改性載體提高其固定化效能；（3）將固定化漆酶與環(huán)境處理工藝相結(jié)合，拓展漆酶在環(huán)境污染治理中的應(yīng)用；（4）采用基因工程對產(chǎn)漆酶真菌進(jìn)行異源表達(dá)，改善漆酶的理化性質(zhì)，挖掘其在綠色環(huán)境化學(xué)工藝領(lǐng)域中新的應(yīng)用前景和價值。

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