胡美忠，郁建生，*，郁建平

（1.銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州銅仁554300；2.貴州梵凈山農(nóng)業(yè)高科技股份有限公司，貴州銅仁554300；3.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025）

發(fā)酵肉指原料肉中人工加入有益微生物或者利 用自然存在的有益微生物發(fā)酵，在有益微生物的作用下發(fā)生復(fù)雜的物理化學(xué)變化，使肉呈現(xiàn)出獨(dú)特風(fēng)味的一類(lèi)肉制品[1-2]，如火腿，香腸、酸魚(yú)、酸肉等肉制品。這些肉制品營(yíng)養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特、保質(zhì)期長(zhǎng)，是風(fēng)靡全球的一類(lèi)肉制品，深受廣大消費(fèi)者的歡迎。

發(fā)酵肉中的微生物種類(lèi)有乳酸菌、葡萄球菌、酵母菌和霉菌[3]，大部分乳酸菌是一類(lèi)公認(rèn)安全的微生物（generally recognized as safe，GRAS），通常認(rèn)為乳酸菌具有有助消化、產(chǎn)生人體所需的微生物和生長(zhǎng)因子、維持腸道健康、增強(qiáng)免疫等益生性。人類(lèi)利用乳酸菌來(lái)生產(chǎn)發(fā)酵食品的歷史已經(jīng)有數(shù)千年，如奶酪、酸奶、酸肉、酸菜等，乳酸菌是發(fā)酵肉的常見(jiàn)菌種，在發(fā)酵肉中乳酸菌能防止發(fā)酵肉在發(fā)酵成熟過(guò)程中病原腐敗菌的侵襲、有利于提升發(fā)酵肉質(zhì)地等功效[4-6]。篩選肉制品發(fā)酵劑菌株，乳酸菌菌種是一個(gè)重要的內(nèi)容，許多乳酸菌優(yōu)良菌株從發(fā)酵肉中分離出來(lái)，如分離自腌肉的Enterococcus sp.18，分離自火腿的Leuconostoc sp.20[7]，分離自熏制鮭魚(yú)的 Lactobacillus sakei R1333[8]。本文探討了從腌臘肉分離純化鑒定具有優(yōu)良發(fā)酵性能的乳酸菌，初步探討了乳酸菌發(fā)酵制作牛肉干的品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品及培養(yǎng)基

貴州省銅仁市周邊不同農(nóng)戶(hù)家采用傳統(tǒng)方式制備的腌臘肉，共采集5份。

MRS培養(yǎng)基、牛肉干蛋白胨培養(yǎng)基（Nutrient A－gar）、平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基（plate count agar，PCA）：北京奧博星。

1.1.2 主要儀器

ZHJH-C1214C垂直流超凈工作臺(tái)：上海智城分析儀器制造有限公司；TU-1901可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DELTA 320 p H計(jì)：上海閔勝科技有限公司；BPH-9042恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HVE-50全自動(dòng)高壓滅菌鍋：華粵集團(tuán)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集

無(wú)菌樣品袋裝置腌制臘肉，標(biāo)記編號(hào)，置于4℃冰箱保存待用。

1.2.2 乳酸菌分離

采集的腌制臘肉樣品，無(wú)菌條件下切成碎片，稱(chēng)取25 g碎片加入225 mL無(wú)菌生理鹽水，震蕩5 min，吸取100 μL樣品液涂布于添加了1%碳酸鈣的MRS培養(yǎng)基，37℃下培養(yǎng)2 d～3 d，隨機(jī)挑取形態(tài)、大小不一致，有溶鈣圈的菌落重新劃線培養(yǎng)，重復(fù)1次～2次得到純培養(yǎng)菌落，做革蘭氏染色和過(guò)氧化氫酶測(cè)試，選擇革蘭氏陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性菌株，采用甘油保藏法置于-70℃冰箱保藏待用（取1 mL純培養(yǎng)菌液與1 mL 40%～50%甘油均勻混合于2 mL無(wú)菌螺紋管中）。

1.2.3 乳酸菌發(fā)酵性能篩選

1.2.3.1 24 h產(chǎn)酸能力測(cè)試

篩選得到的乳酸菌菌株活化，得種子液，種子液按1%比例接種于100 mL MRS培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)24 h后測(cè)定各菌株菌液的pH值（重復(fù)3次，取平均值）。

1.2.3.2 15℃下生長(zhǎng)能力測(cè)試

篩選得到的乳酸菌菌株活化，得種子液，種子液按1%比例接種于100 mL MRS培養(yǎng)基，15℃靜置培養(yǎng)48 h后，以空白MRS培養(yǎng)基為對(duì)照，測(cè)定各菌株菌液的OD600（重復(fù)3次，取平均值）。

1.2.3.3 6.5%氯化鈉耐受能力測(cè)試

篩選得到的乳酸菌菌株活化，得種子液，種子液按1%比例接種于100 mL添加了6.5%氯化鈉的MRS培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)24 h后，以空白MRS培養(yǎng)基為對(duì)照，測(cè)定各菌株菌液的OD600（重復(fù)3次，取平均值）。

1.2.3.4 150 mg/L亞硝酸鈉耐受能力測(cè)試

篩選得到的乳酸菌菌株活化，得種子液，種子液按1%比例接種于100 mL添加了150 mg/L亞硝酸鈉的MRS培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)24 h后，以空白MRS培養(yǎng)基為對(duì)照，分別測(cè)定各菌株菌液的OD600（重復(fù)3次，取平均值）。

1.2.3.5 發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣能力測(cè)試

含0.8%瓊脂的MRS培養(yǎng)基，裝入無(wú)菌試管，用對(duì)數(shù)期的菌種穿刺接種，再在上傾倒2 cm 2%瓊脂封住，37℃培養(yǎng)48 h，觀察產(chǎn)生氣泡情況（試管內(nèi)出現(xiàn)氣泡或者頂起2%的瓊脂，說(shuō)明產(chǎn)氣）。

1.2.3.6 產(chǎn)黏液能力測(cè)試

篩選得到的乳酸菌菌株劃線培養(yǎng)于MRS培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)48 h后，用接種環(huán)挑取菌落觀察是否出現(xiàn)黏液。

1.2.3.7 產(chǎn)蛋白酶能力測(cè)試

蛋白酶活性測(cè)定方法使用瓊脂板法[9]。篩選得到的乳酸菌菌株劃線培養(yǎng)于MRS培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)48 h活化，活化的菌落轉(zhuǎn)接種于含有10%脫脂牛奶的MRS培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)72 h后觀察菌落周?chē)欠癯霈F(xiàn)蛋白水解圈。

1.2.3.8 產(chǎn)脂肪酶能力測(cè)試

篩選得到的乳酸菌菌株劃線培養(yǎng)于MRS培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)48 h活化，活化的菌落轉(zhuǎn)接種于含有1%三丁酸甘油酯的MRS培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)72 h后觀察菌落周?chē)欠癯霈F(xiàn)脂肪水解圈。

1.2.4 乳酸菌產(chǎn)廣譜抑菌能力細(xì)菌素的篩選

篩選得到的乳酸菌菌株活化后接種于MRS培養(yǎng)基，37℃下靜置培養(yǎng)10 h得種子液，種子液按1%比例接種于100 mL MRS培養(yǎng)基，37℃下靜置培養(yǎng)24 h后，菌液6 000 g離心10 min，得上清液，以金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）和大腸桿菌（ATCC 25922）為指示菌，采用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)試上清液抑菌活性[10]。具體做法為：指示菌使用NA培養(yǎng)基活化，制備出OD≈1的指示菌菌液，NA固體培養(yǎng)基融化待其溫度降至40℃左右后（手持裝置NA培養(yǎng)基的瓶子不燙手），按1%比例加入指示菌菌液，混勻，倒平板，待平板凝固，上面放置牛津杯或者打孔器打孔，孔中加入60 μL乳酸菌發(fā)酵上清液，37℃下靜置培養(yǎng)18 h～24 h，測(cè)量抑菌圈直徑。檢測(cè)乳酸菌是否產(chǎn)生廣譜抗菌作用細(xì)菌素方法流程為：100 mL乳酸菌發(fā)酵上清液，凍干，用20 mL無(wú)菌水溶解后分成3份樣品，樣品1用3 mol/L氫氧化鈉和乳酸調(diào)節(jié)pH值至5.5，樣品2加入0.5 mL過(guò)氧化氫酶（2.5 kU/mL～5 kU/mL）后37℃水浴2 h，樣品3作為對(duì)照，以金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）和細(xì)菌大腸桿菌（ATCC 25922）為指示菌，采用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)試3份樣品的抑菌活性，以檢測(cè)是否發(fā)酵液中是否含有廣譜抗菌作用細(xì)菌素。

1.2.5 乳酸菌的種屬鑒定

1.2.5.1 生理生化鑒定

經(jīng)過(guò)篩選，得到1株具有應(yīng)用于肉制品發(fā)酵潛力的菌株，編號(hào)為R3-1。根據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》[11]和凌代文的《乳酸菌細(xì)菌分類(lèi)鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》，對(duì)R3-1進(jìn)行生理生化鑒定。

菌株R3-1菌株劃線接種于MRS培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落形態(tài)、顏色和表面光滑等。菌株R3-1 MRS培養(yǎng)基活化至OD600≈1，取100 μ菌液，加入乳酸菌生化鑒定管（海博，青島，中國(guó)）中，37℃靜置培養(yǎng)24 h～48 h觀察結(jié)果。

1.2.5.2 分子生物學(xué)鑒定

菌株R3-1總DNA提取，16S rDNA擴(kuò)增和測(cè)序由金唯智生物科技有限公司完成，測(cè)序所得的16S rDNA序列校對(duì)后，與NCBI的 GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）數(shù)據(jù)庫(kù)或者 http：//www.ezbiocloud.net進(jìn)行BLAST分析，根據(jù)序列同源性，確定菌株的種屬關(guān)系確定菌株的種屬關(guān)系。

1.2.6 植物乳桿菌（Lb.Plantarum）R3-1與木糖葡萄球菌（s.xylosus）P2關(guān)系考察

在從銅仁腌臘肉尋找肉品發(fā)酵劑菌株的過(guò)程中，除了篩選到優(yōu)良的植物乳桿菌（Lb.Plantarum）R3-1外，還得到一株具有優(yōu)良發(fā)酵性能木糖葡萄球菌（s.xylosus）P2（數(shù)據(jù)未列出），兩者有可能組成復(fù)合肉品發(fā)酵劑。在研究的過(guò)程中同時(shí)發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌（Lb.Plantarum）R3-1產(chǎn)廣譜抑菌作用的細(xì)菌素，故考察植物乳桿菌（Lb.Plantarum）R3-1是否對(duì)木糖葡萄球菌（s.xylosus）P2有拮抗作用是兩者是否能成為復(fù)合肉品發(fā)酵劑的關(guān)鍵。試驗(yàn)植物乳桿菌（Lb.Plantarum）R3-1與木糖葡萄球菌（s.xylosus）P2關(guān)系采用十字交叉法，植物乳桿菌（Lb.Plantarum）R3-1在PCA培養(yǎng)基上劃直線培養(yǎng)，同時(shí)，木糖葡萄球菌（s.xylosus）P2劃直線培養(yǎng)并與植物乳桿菌（Lb.Plantarum）R3-1線交叉形成十字交叉，37℃培養(yǎng)36 h后觀察交叉處是否出現(xiàn)拮抗作用。

1.2.7 復(fù)合發(fā)酵劑發(fā)酵牛肉干初步研究

植物乳桿菌（Lb.Plantarum）R3-1和木糖葡萄球菌（s.xylosus）P2培養(yǎng)后，4℃下6 000 g離心5 min，收集菌體，適量無(wú)菌生理鹽水懸?。∣D600≈1）。選擇上好牛肉切片，煮熟瀝干后，1%葡萄糖，5%氯化鈉，2%蔗糖和0.1‰硝酸鈉腌制4℃牛肉片24 h，植物乳桿菌（Lb.Plantarum）R3-1和木糖葡萄球菌（s.xylosus）P2按體積比1∶1比例混合制作混合發(fā)酵劑（109cfu/mL），按牛肉重量10%比例接種復(fù)合發(fā)酵劑，15℃下發(fā)酵120 h后，按1%醬油，1.5%胡椒粉，1%鮮姜，0.01%白胡椒粉，0.05%料酒加入發(fā)酵好的牛肉，攪拌均勻后風(fēng)干（或60℃～70℃烘干），得發(fā)酵牛肉干成品。以不加菌和只加乳酸菌同樣制作的牛肉干為對(duì)照，發(fā)酵牛肉干成品請(qǐng)15位人員品嘗，采用9分制從顏色、風(fēng)味、質(zhì)地、味道和總體接受度打分，比較復(fù)合發(fā)酵劑的優(yōu)劣。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離純化

從貴州銅仁采集的5份腌臘肉樣品中，共得到26株革蘭氏陽(yáng)性、過(guò)氧化酶陰性的乳酸菌菌株。MRS培養(yǎng)基是一種半選擇性培養(yǎng)基，可以用來(lái)選擇性分離乳酸菌。經(jīng)過(guò)MRS篩選得到的菌株，再經(jīng)過(guò)革蘭染色和過(guò)氧化氫酶鑒定，基本上可以假定為乳酸菌（乳酸菌是革蘭氏陽(yáng)性，過(guò)氧化氫酶陰性菌）。

乳酸菌在發(fā)酵食品如酸菜、奶酪等發(fā)酵食品中豐度很高，不同發(fā)酵食品其生境不一樣，從而不同的發(fā)酵食品所含有的乳酸菌種類(lèi)及生化性質(zhì)不同。工業(yè)用乳酸菌菌種，為了使其適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)的目標(biāo)發(fā)酵環(huán)境，從相應(yīng)的發(fā)酵產(chǎn)品中分離篩選是捷徑。故分離篩選用作發(fā)酵肉制品發(fā)酵劑的乳酸菌菌株，其分離第一來(lái)源應(yīng)是發(fā)酵肉制品，比如腌肉、火腿、香腸等。

2.2 乳酸菌的發(fā)酵性能篩選

2.2.1 24 h產(chǎn)酸能力測(cè)定結(jié)果

乳酸菌在24 h產(chǎn)酸能力是衡量乳酸菌菌株品質(zhì)優(yōu)劣的一個(gè)重要指標(biāo)，產(chǎn)酸能力越強(qiáng)，說(shuō)明菌株性能越佳。分離得到的26株乳酸菌菌株產(chǎn)酸能力見(jiàn)圖1。

圖1 乳酸菌MRS培養(yǎng)基中24 h產(chǎn)酸能力Fig.1 Acid-producing ability of LAB incubated in MRS broth after 24 h

由圖1可知，分別用MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，絕大部分菌株的產(chǎn)酸能力都強(qiáng)，61.5%的菌株能夠使培養(yǎng)基的pH值從6.2下降到3.8甚至更低，少部分菌種的培養(yǎng)基pH值從6.2下降至4.1左右，也有3株乳酸菌菌株產(chǎn)酸能力較弱，其培養(yǎng)基的pH值從6.2下降到4.5左右。

2.2.2 15℃生長(zhǎng)能力、耐鹽能力及耐亞硝酸鈉能力測(cè)試結(jié)果

分離的乳酸菌15℃生長(zhǎng)能力、耐鹽能力及耐亞硝酸鈉能力見(jiàn)圖2。

圖2 乳酸菌15℃生長(zhǎng)能力、耐氯化鈉能力及耐亞硝酸鈉能力Fig.2 Tolerance to sodium chloride，sodium nitrite and growth conditions at 15℃of LAB

由圖2可知，菌株R3-1、R1-1等9株菌在15℃下生長(zhǎng)良好，37℃培養(yǎng)48 h后，培養(yǎng)基OD600值超過(guò)1，占比42.3%。在6.5%氯化鈉耐受試驗(yàn)中，46.2%的乳酸菌菌株在6.5%氯化鈉條件下生長(zhǎng)良好，37℃培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)基OD600可達(dá)到1.5甚至更高，其余乳酸菌菌株的生長(zhǎng)則受到氯化鈉不同抑制。耐亞硝酸鈉試驗(yàn)中，只有菌株R1-5顯示不耐受150 mg/L的亞硝酸鈉，其他乳酸菌菌株在此濃度的亞硝酸鈉下均能良好生長(zhǎng)。

2.2.3 產(chǎn)黏液、發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣、蛋白酶活性及脂肪酶活性結(jié)果

產(chǎn)黏液、發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣、蛋白酶活性及脂肪酶活性結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，菌株R3、R23、R12產(chǎn)生黏液，占比為11.3%，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)表明菌株R3-2、R4-5、R4-1、R2-6能夠發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣，占比為15.4%。菌株 R3-1、R1-1、R3、R2-6、R2-表現(xiàn)出蛋白酶活性，占比為19.2%。脂肪酶測(cè)試則表明這26株菌均無(wú)脂肪酶活性。

在發(fā)酵食品中，產(chǎn)酸量對(duì)于控制病原性腐敗菌和發(fā)酵食品口味至關(guān)重要[12]，但不同種屬的乳酸菌產(chǎn)酸能力不同，為了篩選得到產(chǎn)酸能力強(qiáng)的乳酸菌菌株用作發(fā)酵劑，24 h產(chǎn)酸能力是一個(gè)重要指標(biāo)，通常用培養(yǎng)基pH降低程度來(lái)衡量。

發(fā)酵肉發(fā)酵成熟時(shí)，其環(huán)境對(duì)細(xì)菌來(lái)說(shuō)不友善，通常處于15℃低溫，這個(gè)溫度很多細(xì)菌不能生長(zhǎng)或者生長(zhǎng)緩慢，這些比較極端的環(huán)境會(huì)抑制大部分細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，而作為肉制品工業(yè)用發(fā)酵劑的菌株則需要在這種環(huán)境下迅速生長(zhǎng)繁殖，故尋找肉制品乳酸菌發(fā)酵劑菌株，需要篩選其對(duì)極端環(huán)境的耐受能力[13]。

乳酸菌有兩種代謝類(lèi)型，同型發(fā)酵和異型發(fā)酵。乳酸菌通過(guò)同型發(fā)酵可以把1分子葡萄糖全部轉(zhuǎn)變?yōu)?分子乳酸，如果通過(guò)異型發(fā)酵，葡萄糖不會(huì)全部被轉(zhuǎn)換為乳酸，還會(huì)被轉(zhuǎn)換成醋酸、CO2等其他物質(zhì)。異型發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生氣體，會(huì)破壞產(chǎn)品質(zhì)地對(duì)產(chǎn)品不利[14]，故作為乳酸菌發(fā)酵劑菌株，要求其代謝途徑為同型發(fā)酵，不能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣。

部分乳酸菌代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生黏液，而黏液對(duì)肉制品來(lái)說(shuō)會(huì)危害質(zhì)地、顏色甚至口味，對(duì)于乳酸菌發(fā)酵劑菌株來(lái)說(shuō)，代謝過(guò)程不能產(chǎn)生黏液[14]。

少部分乳酸菌能產(chǎn)生蛋白酶，絕大多數(shù)乳酸菌沒(méi)有脂肪酶活性[15]。發(fā)酵肉中，乳酸菌的主要貢獻(xiàn)是產(chǎn)生有機(jī)酸來(lái)增加肉制品安全和質(zhì)地，對(duì)于發(fā)酵肉風(fēng)味的貢獻(xiàn)幾乎可忽略不計(jì)。故乳酸菌的蛋白酶和脂肪酶活性不是篩選乳酸菌肉制品發(fā)酵劑的重要指標(biāo)。

表1 乳酸菌發(fā)酵特性Table 1 The fermentation property of LAB

2.3 乳酸菌產(chǎn)廣譜抑菌能力細(xì)菌素的篩選

乳酸菌作為肉制品發(fā)酵劑菌株，乳酸菌主要起到降低pH值，抑制病原微生物的作用，故其培養(yǎng)液的廣譜抑菌能力對(duì)于乳酸菌發(fā)酵劑來(lái)說(shuō)很重要。乳酸菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)有很多，比如說(shuō)有機(jī)酸、過(guò)氧化氫、細(xì)菌素等[7，16]。故測(cè)試乳酸菌的抑菌活性及是否產(chǎn)生廣譜抗菌作用細(xì)菌素對(duì)乳酸菌發(fā)酵劑來(lái)說(shuō)具有很高的價(jià)值。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，由表1可知，在篩選得到的26株乳酸菌中，菌株 R1-5、R2-3、R2-6、R5-1、R4-2 的發(fā)酵液對(duì)指示菌沒(méi)有抑制活性，占比為19.2%，其他菌株表現(xiàn)對(duì)指示菌不同的抑菌活性。在排除酸抑制、過(guò)氧化氫抑制后，只有菌株 R3-1、R1-1、R3-9、R23 表現(xiàn)出產(chǎn)廣譜抑菌作用的細(xì)菌素，其他則無(wú)。

細(xì)菌素是由細(xì)菌核糖體代謝產(chǎn)生的一種多肽物質(zhì)，一般來(lái)說(shuō)，對(duì)親緣關(guān)系近的菌有抑制作用，但是也有少部分細(xì)菌素具有廣譜抑菌作用[17-18]。大部分乳酸菌能產(chǎn)生細(xì)菌素，少部分乳酸菌能產(chǎn)生具有廣譜抑菌作用的細(xì)菌素，這部分乳酸菌及其產(chǎn)生的細(xì)菌素在發(fā)酵食品的防腐中具有重要的作用，能在很大程度上延長(zhǎng)食品的貨架期，而且細(xì)菌素來(lái)源于乳酸菌，大部分乳酸菌是公認(rèn)安全的菌，來(lái)源安全。故乳酸菌發(fā)酵劑菌株，能產(chǎn)生廣譜抗菌作用細(xì)菌素的菌株是最佳的，能夠延長(zhǎng)貨架期。

2.4 植物乳桿菌R3-1種屬鑒定

2.4.1 生理生化鑒定

菌株R3-1 MRS培養(yǎng)基上為乳白色菌落，培養(yǎng)72 h菌落直徑3 mm左右，表面光滑，革蘭氏陽(yáng)性，過(guò)氧化氫酶陰性。

乳酸菌生化鑒定試劑盒表明，菌株R3-1能利用纖維二糖、七葉苷、麥芽糖、甘露醇、水楊苷、山梨糖醇、蔗糖、棉子糖、菊粉、乳糖和1%馬尿酸。對(duì)照《乳酸細(xì)菌分類(lèi)鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》[19]，顯示菌株R3-1最可能為植物乳桿菌。

2.4.2 分子生物學(xué)鑒定

通過(guò)細(xì)菌基因組提取試劑盒提取菌株R3-1、R1-1總DNA。利用16s rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約1.5 kb的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，由北京金唯智生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)得所得到的16S rDNA基因序列，在www.ncbi.nlm.nlh.gov網(wǎng)站中使用BLAST在基因庫(kù)中進(jìn)行同源性搜索，所得結(jié)果中表明菌株R3-1與植物乳桿菌Lactobacillus plantarum strain TMW 1.1623（complete genome） （accession number：CP017379.1），Lactobacillus plantarum strain LP2（complete genome）（accession number： CP020816.1），Lactobacillus plantarum strain CLP0611 （complete genome）（accession number：CP019722.1）相似度100%，結(jié)合生理生化試驗(yàn)以及16S rDNA同源性比較結(jié)果，鑒定R3-1植物乳桿菌（Lb.Plantarum）。

2.5 植物乳桿菌（Lb.Plantarum）R3-1與木糖葡萄球菌（S.xylosus）P2 關(guān)系

十字交叉法試驗(yàn)證明在交叉處植物乳桿菌（Lb.Plantarum）R3-1與木糖葡萄球菌（S.xylosus）P2的菌落線生長(zhǎng)正常，沒(méi)有出現(xiàn)抑制現(xiàn)象，各自菌落線與非交叉處沒(méi)有區(qū)別，表明植物乳桿菌（Lb.Plantarum）R3-1與木糖葡萄球菌（S.xylosus）P2之間不存在拮抗作用，二者可以作為復(fù)合發(fā)酵劑用作肉品發(fā)酵。

在發(fā)酵肉制品生產(chǎn)過(guò)程中，植物乳桿菌通常和木糖葡萄球菌聯(lián)合使用[20]，然而，在研究中發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌（Lb.Plantarum）R3-1能產(chǎn)生抑制金黃色葡萄球菌（革蘭陽(yáng)性代表）和大腸桿菌（革蘭陰性代表）的細(xì)菌素，所以植物乳桿菌（Lb.Plantarum）R3-1是否對(duì)木糖葡萄球菌（S.xylosus）P2有拮抗作用是兩者能否作為復(fù)合發(fā)酵劑的關(guān)鍵。試驗(yàn)證明兩者可以作為復(fù)合發(fā)酵劑，可能是因?yàn)橹参锶闂U菌（Lb.Plantarum）R3-1與木糖葡萄球菌（S.xylosus）P2都分離自同來(lái)源的傳統(tǒng)腌臘肉，它們之間已經(jīng)相互適應(yīng)，可以作為復(fù)合發(fā)酵劑菌種。

2.6 復(fù)合發(fā)酵劑發(fā)酵牛肉干初步研究

發(fā)酵牛肉干試驗(yàn)結(jié)果顯示，植物乳桿菌（Lb.Plantarum）R3-1與木糖葡萄球菌（S.xylosus）P2按照體積比1∶1比例組成的復(fù)合發(fā)酵劑，在牛肉干成品顏色、氣味，質(zhì)地，口味和總體接受度方面比單獨(dú)使用植物乳桿菌（Lb.Plantarum）R3-1或者不使用發(fā)酵劑有顯著改善（p＜0.05）見(jiàn)表 2。

表2 發(fā)酵牛肉干評(píng)估Table 2 Sensory evaluation of beef jerky

在發(fā)酵肉制品中，乳酸菌的主要貢獻(xiàn)為降低pH值，抑制病原腐敗菌，改善產(chǎn)品質(zhì)地延長(zhǎng)貨架期，而凝固酶陰性的葡萄球菌主要貢獻(xiàn)為風(fēng)味和成品顏色[21]。他們通常組成復(fù)合發(fā)酵劑在肉制品發(fā)酵生產(chǎn)中使用，試驗(yàn)植物乳桿菌（Lb.Plantarum）R3-1與木糖葡萄球菌（S.xylosus）P2表明兩者聯(lián)合使用是一種優(yōu)秀的復(fù)合發(fā)酵劑，具有應(yīng)用于肉品發(fā)酵的潛力。

3 結(jié)論

從5份腌臘肉中分離得到26株乳酸菌，經(jīng)過(guò)發(fā)酵性能篩選，得到一株發(fā)酵性能優(yōu)良，具有應(yīng)用于肉品乳酸菌發(fā)酵劑菌株R3-1，經(jīng)過(guò)生理生化和16S rDNA鑒定為植物乳桿菌（Lb.Plantarum）。植物乳桿菌（Lb.Plantarum）R3-1產(chǎn)酸能力強(qiáng)，耐低溫、耐高鹽、耐高濃度亞硝酸鹽、不產(chǎn)氣不產(chǎn)黏液，產(chǎn)廣譜抑菌作用細(xì)菌素，且對(duì)同分離來(lái)源的木糖葡萄球菌（S.xylosus）P2沒(méi)有拮抗作用，兩者聯(lián)合發(fā)酵牛肉干試驗(yàn)表明，相對(duì)于單獨(dú)使用植物乳桿菌（Lb.Plantarum）R3-1發(fā)酵劑或者不使用發(fā)酵劑，兩者復(fù)合的發(fā)酵劑制作的牛肉干成品，在顏色、氣味、質(zhì)地、口感和總體接受度上都有顯著改善，表明植物乳桿菌（Lb.Plantarum）R3-1有作為肉制品乳酸菌發(fā)酵劑菌株的潛力。

參考文獻(xiàn)：

[1]李輕舟,王紅育.發(fā)酵肉制品研究現(xiàn)狀及展望[J].食品科學(xué),2011,32(3):247-251

[2]劉宗敏.發(fā)酵肉制品研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)[J].山東食品發(fā)酵,2014(1):50-52

[3]TALON R,LEROY S,LEBERT I.Microbial ecosystems of traditional fermented meat products:The importance of indigenous starters[J].Meat Science,2007,77(1):55-62

[4]BLAIOTTA G,PENNACCHIA C,VILLANI F,et al.Diversity and dynamics of communities of coagulase-negative staphylococci in traditional fermented sausages[J].Journal of Applied Microbiology,2004,97(2):271-284

[5]COTON E,DESMONTS M H,LEROY S,et al.Biodiversity of coagulase-negative Staphylococci in French cheeses,dry fermented sausages,processing environments and clinical samples[J].International Journal of Food Microbiology,2010,137(2/3):221-229

[6]MAINAR M S,STAVROPOULOU D A,LEROY F.Exploring the metabolic heterogeneity of coagulase-negative staphylococci to improve the quality and safety of fermented meats:a review[J].International Journal of Food Microbiology,2016,247(17):24-37

[7]MARTINIS E C P D,FREITAS F Z.Screening of lactic acid bacteria from Brazilian meats for bacteriocin formation[J].FoodControl,2003,14(3):197-200

[8]TODOROV S D,RACHMAN C,FOURRIER A,et al.Characterization of a bacteriocin produced by Lactobacillus sakei R1333 isolated from smoked salmon[J].Anaerobe,2011,17(1):23-31

[9]ESSID I,MEDINI M,HASSOUNA M.Technological and safety properties of Lactobacillus plantarum strains isolated from a Tunisian traditional salted meat[J].Meat Science,2009,81(1):203-208

[10]JAGADEESWARI S,VIDYA P,KUMAR D M,et al.Isolation and characterization of bacteriocin producing Lactobacillus sp.from traditional fermented foods[J].Electronic Journal of Environmental,A－gricultural and Food Chemistry,2010,9(3):575-581

[11]SNEATH P H,MAIR N S,SHARPE M E,et al.Bergey's manual of systematicbacteriology.Volume2[M].Maryland:Williams&Wilkins,1986

[12]PETRUS.Physicochemical characteristics,microbial quality and organoleptic acceptability of Indonesian traditional fermented fresh water fish(Anabas testudineus Bloch)prepared using different concentrations of salt and lime(Citrus aurantifolia swingle)juice[J].International Journal of Biosciences,2015,6(8):157-170

[13]Cocconcelli P S,Fontana C.Characteristics and Applications of Microbial Starters in Meat Fermentations[M].New York:Springer,2008:129-148

[14]BUCKENH SKES H J.Selection criteria for lactic acid bacteria to be used as starter cultures for various food commodities[J].Fems Microbiology Reviews,2010,12(1/3):253-271

[15]DROSINOS E H,PARAMITHIOTIS S,KOLOVOS G,et al.Phenotypic and technological diversity of lactic acid bacteria and staphylococci isolated from traditionally fermented sausages in Southern Greece[J].Food Microbiology,2007,24(3):260-270

[16]DHEWA T.Screening,Production Purification and Potential Use of Bacteriocins From Lactic Acid Bacteria of Meat and Dairy Food Origin[J].International Proceedings of Chemical Biological&Environmenta,2012,39:35-41

[17]SVETOCH E A,ERUSLANOV B V,PERELYGIN V V.Inducer Bacteria,Unique Signal Peptides,and Low-Nutrient Media Stimulate in Vitro Bacteriocin Production by Lactobacillus Spp.and Enterococcus Spp.Strains[J].Journal of Agricultural&Food Chemistry,2010,58(10):6033-6038

[18]MALDONADOBARRAG N A,CABALLEROGUERRERO B,LUCENAPADR S H,et al.Induction of bacteriocin production by coculture is widespread among plantaricin-producing Lactobacillus plantarum strains with different regulatory operons[J].Food Microbiology,2013,33(1):40-47

[19]凌代文,東秀珠.乳酸菌細(xì)菌分類(lèi)鑒定及實(shí)驗(yàn)方法[M].北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社,1999

[20]GRECO M,MAZZETTE R,EPL D S,et al.Evolution and identification of lactic acid bacteria isolated during the ripening of Sardinian sausages[J].Meat science,2005,69(4):733-739

[21]LI P,KONG B,CHEN Q,et al.Formation and identification of nitrosylmyoglobin by Staphylococcus xylosus in raw meat batters:A potential solution for nitrite substitution in meat products[J].Meat Science,2013,93(1):67-72