陳吉香，謝體波，馮才偉

（貴州勤邦食品安全科學(xué)技術(shù)有限公司，貴州貴陽550009）

阿維菌素是一種高效、廣譜的抗生素類藥物，由鏈霉菌中灰色鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生，由一組大環(huán)內(nèi)酯類化合物組成。阿維菌素類藥物主要包括阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素和埃比菌素等物質(zhì)[1]，是一種優(yōu)良的新型農(nóng)畜兩用抗生素[2-3]，其作用機(jī)制獨(dú)特，使用方便，被譽(yù)為近幾十年來抗寄生蟲藥物研究進(jìn)展的重大突破。該物質(zhì)殺蟲活性強(qiáng)，抗菌面廣[4]，廣泛用于蔬菜、水果、煙草等作物。但在動物體內(nèi)殘留時間長，被世界衛(wèi)生組織列為高毒化合物[5-6]。具有神經(jīng)毒性和免疫毒性，多見為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害[7-8]，大劑量可引起人或動物昏迷乃至死亡[9]。

目前，阿維菌素類藥物在蔬菜中的殘留分析方法主要是液相色譜法和液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法等儀器分析方法，但儀器法樣品前處理復(fù)雜，檢測時間長，儀器昂貴，成本較高[10-12]。

該研究采用間接競爭酶聯(lián)免疫吸附劑測定（enzyme linked immunosorlent assay，ELISA）方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，留的阿維菌素類藥物與酶標(biāo)板上的偶聯(lián)抗原競爭阿維菌素抗體，加入酶標(biāo)二抗后，用 3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺（3，3'，5，5'-Tetrarnethy lbenzidinep，TMB）底物顯色，終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450 nm處測定吸光度，樣本吸光度值與其所含阿維菌素類藥物殘留量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出阿維菌素類藥物殘留含量。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

新鮮蔬菜：白菜、胡蘿卜；干菜和高淀粉含量樣品：干洋蔥、土豆；均屬市售。

阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）、埃比菌素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）：上海安譜科學(xué)儀器有限公司；甲醇、乙腈、無水硫酸鈉、堿性氧化鋁（100目～200目）、正己烷，均為分析純：貴陽誠承化工設(shè)備有限公司；去離子水；阿維菌素類藥物快速檢測試劑盒產(chǎn)品[全套產(chǎn)品包括：96孔酶標(biāo)板1塊（包被有偶聯(lián)抗原）、標(biāo)準(zhǔn)品6瓶：1 mL/瓶（0、0.5 、1.5、4.5 、13.5、40.5 μg/mL）、高濃度標(biāo)準(zhǔn)品：1 mL/瓶（1 mg/L）、酶標(biāo)二抗 12 mL（紅色帽）、抗體工作液10 mL（綠色帽）、底物液A液7 mL（白色帽）、底物液B液7 mL（紅色帽）、終止液7 mL（黃色帽）、20×濃縮洗滌液40 mL（透明帽）、2×濃縮復(fù)溶液50 mL（藍(lán)色帽）]：北京勤邦生物技術(shù)有限公司。

配液1：復(fù)溶工作液

用去離子水將2×濃縮復(fù)溶液1∶1（體積比）進(jìn)行稀釋（1份+1份去離子水）用于樣本的復(fù)溶。

配液2：洗滌工作液

用去離子水將20×濃縮洗滌液1∶19（體積比）進(jìn)行稀釋（1份+19份去離子水）用于酶標(biāo)板的洗滌。

1.1.2 儀器與設(shè)備

S7-360微孔板酶標(biāo)儀（450/630 nm）：上?？迫A生物工程股份有限公司；EV311旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀/Kwin6800氮?dú)獯蹈裳b置：北京萊伯泰科儀器有限公司；FJ-200均質(zhì)器：常州國宇儀器制造有限公司；HY-2振蕩器：常州國華電器有限公司；GZ-21M離心機(jī)：湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；QL-901渦旋儀：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；JY2002天平（感量0.01 g）：上海恒平科學(xué)儀器有限公司；10 mL刻度移液管、洗耳球、10 mL玻璃試管、2、50mL聚苯乙烯離心管：貴陽誠承化工設(shè)備有限公司；單道 20 μL～200 μL 微量移液器、100 μL～1 000 μL微量移液器、多道250 μL微量移液器：賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

1.2.1.1 新鮮蔬菜：白菜、胡蘿卜

1）用均質(zhì)器均質(zhì)蔬菜樣本：

2）稱取（1.0±0.05）g均質(zhì)后的組織樣本至 50 mL聚苯乙烯離心管中，加入5 mL正己烷，用振蕩器震動10 min，3 000 g以上，15℃（59℉）離心10 min；

3）取1 mL上層清液至10 mL潔凈干燥玻璃試管中，于50℃～60℃（122℉～140℉）水浴氮?dú)饬飨麓蹈桑?/p>

4）加入1 mL復(fù)溶工作液（見配液1），用渦旋儀渦動30 s以上，超聲10 min，再用渦旋儀渦動30 s，混勻：

5）取 20 μL 用于分析。

1.2.1.2 樣品（干洋蔥、土豆）

1）用均質(zhì)器均質(zhì)蔬菜樣本；

2）稱?。?.0±0.05）g均質(zhì)后的組織樣本至 50 mL聚苯乙烯離心管中，加入6 mL去離子水，充分混勻，再加入5 mL正己烷，用振蕩器震動10 min，3 000 g以上，15℃（59℉）離心10 min；

3）取1 mL上層清液至10 mL潔凈干燥玻璃試管中，于50℃～60℃（122℉～140℉）水浴氮?dú)饬飨麓蹈桑?/p>

4）加入1 mL復(fù)溶工作液，必須用渦旋儀渦動30 s以上，超聲10 min，再用渦旋儀渦動30 s，混勻；

5）取 20 μL 用于分析。

1.2.2 樣品檢測

1）將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，使用之前將模具內(nèi)所有試劑與酶標(biāo)板放實(shí)驗(yàn)桌上回溫至室溫（20℃～25℃/68℉～77℉），將每種液體試劑搖勻；

2）取出需要數(shù)量的微孔板，將不用的微孔板放回鋁箔袋重新真空密封，保存于2℃～8℃（36℉～46℉）環(huán)境中；

3）編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置；

4）加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本和抗體工作液：加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本20 μL到對應(yīng)的微孔中，然后加入抗體工作液80 μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃（98.6℉）避光環(huán)境中反應(yīng)30 min；

5）洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，加入洗滌工作液（見配液2）250 μL/孔，充分洗滌4次～5次，每次間隔10 s，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭戳破）；

6）加酶標(biāo)二抗：加入酶標(biāo)二抗 100 μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃（98.6℉）避光環(huán)境中反應(yīng)30 min，取出重復(fù)洗板步驟5；

7）顯色：加入底物液 A 液 50 μL/孔，再加入底物液B液50 μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃（98.6℉）避光環(huán)境中顯色15 min；

8）測定：加入終止液 50 μL/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450 nm處測定每孔OD值（在5 min內(nèi)讀完）。

2 試劑盒相關(guān)指標(biāo)檢測方法

分別對試劑盒的特異性、檢測限、精密度、準(zhǔn)確度進(jìn)行試驗(yàn)，并將其中檢測限、精密度和準(zhǔn)確度與儀器方法檢測的檢測限、精密度和準(zhǔn)確度進(jìn)行對比。

2.1 線性關(guān)系

標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即

式中：B為標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值；B0為0 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。

分別測定阿維菌素和埃比菌素 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 μg/kg 6個濃度的標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度值（A）。求出其濃度對數(shù)值（y）和對應(yīng)濃度的百分吸光率（x）的線性關(guān)系。結(jié)果顯示如表1。

表1 藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Table 1 Equation of standard curve of drugs

阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=-2.210x+1.524，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999，埃比菌素中標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=-0.750x+0.273，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999，說明試劑盒線性關(guān)系良好。

將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中阿維菌素類藥物的實(shí)際濃度。其中，新鮮蔬菜樣本、干菜和高淀粉樣本的稀釋倍數(shù)均為5倍。

2.2 試劑盒特異性的測定結(jié)果

特異性用交叉反應(yīng)率來表示，交叉反應(yīng)率是指抗體與結(jié)構(gòu)不同的抗原決定簇發(fā)生結(jié)合的能力。交叉反應(yīng)率小，可證明抗體的特異性高。選擇與阿維菌素類似結(jié)構(gòu)和類似功能的3種藥物，將不同濃度的阿維菌素類似物，替代阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定其標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算IC50抑制濃度，并根據(jù)各藥物的IC50抑制濃度計(jì)算交叉反應(yīng)率。結(jié)果顯示如表2。

表2 交叉反應(yīng)率Table 2 Cross response rate

該酶聯(lián)免疫試劑盒對阿維菌素類藥物類似物生物交叉反應(yīng)率均較低，具有良好的特異性。

2.3 試劑盒檢測限的測定結(jié)果

分別對20份白菜、胡蘿卜、干洋蔥、土豆樣本進(jìn)行檢測，計(jì)算阿維菌素類藥物的濃度，測定結(jié)果的平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差為試劑盒的實(shí)際樣品的最低檢測限。結(jié)果顯示如表3，該酶聯(lián)免疫試劑盒對白菜、胡蘿卜、干洋蔥、土豆中阿維菌素和埃比菌素的檢測限均為 3 μg/kg。

表3 試劑盒最低檢測限Table 3 Minimum detection limit of kit

續(xù)表3 試劑盒最低檢測限Continue table 3 Minimum detection limit of kit

表4 試劑盒準(zhǔn)確度檢測結(jié)果Table 4 Accuracy test results of kit%

表5 試劑盒精密度檢測結(jié)果Table 5 Precision test results of kit%

2.4 試劑盒精密度和準(zhǔn)確度測定結(jié)果

精密度又稱可重復(fù)性，反應(yīng)測定方法對某一特定樣品多次測定所得結(jié)果的重復(fù)程度，這是評價(jià)酶聯(lián)免疫試劑盒質(zhì)量的最基本參數(shù)，常用變異系數(shù)表示。準(zhǔn)確度是指測定值與真實(shí)值間的符合程度，試劑盒的準(zhǔn)確度常用回收率表示。

在檢測為陰性的白菜、胡蘿卜、干洋蔥、土豆樣本中分別添加 5、10 μg/kg 和 20 μg/kg 阿維菌素、埃比菌素，每種樣品、每個濃度各6個平行，用試劑盒提供的操作方法提取測定。分別測定計(jì)算樣品的回收率及變異系數(shù)。結(jié)果顯示如表4、表5，對于阿維菌素，4種樣品平均回收率均在92.0%～99.6%之間，對于埃比菌素，4種樣品平均回收率均在91.3%～100.1%之間，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于10%，說明該酶聯(lián)免疫試劑盒具備較高的精密度和準(zhǔn)確度。

表6 試劑盒與儀器檢測方法比較Table 6 Comparison of kit and instrument detection method

2.5 試劑盒與儀器方法檢測結(jié)果比較

隨機(jī)抽取市場上售賣的白菜、胡蘿卜、干洋蔥、土豆樣本各80份，分別用試劑盒和儀器方法進(jìn)行檢測。儀器方法參考GB 23200.20-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中阿維菌素殘留量的測定液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》。

儀器方法中阿維菌素與埃比菌素的檢測限為5 μg/kg，以此為陽性判定線，高于或等于陽性判定線的值以實(shí)際值表示。結(jié)果顯示如表6，公司自主研制的阿維菌素三合一酶聯(lián)免疫試劑盒檢測結(jié)果與儀器檢測結(jié)果相吻合，表明這試劑盒的準(zhǔn)確度達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)檢測水平。

3 結(jié)論與討論

本文對自主研發(fā)的阿維菌素三合一酶聯(lián)免疫試劑盒的特異性、檢測限、精密度和準(zhǔn)確度進(jìn)行研究，并對白菜、胡蘿卜、干洋蔥、土豆4種樣品中阿維菌素類藥物的殘留量進(jìn)行檢測，將其檢測結(jié)果與儀器方法相比較。結(jié)果表明，阿維菌素三合一酶聯(lián)免疫試劑盒特異性強(qiáng)、靈敏度高，對白菜、胡蘿卜、干洋蔥、土豆4種樣品的最低檢測限為3 μg/kg：阿維菌素測定時4種樣品平均回收率在92.0%～99.6%之間，埃比菌素測定時4種樣品平均回收率在91.3%～100.1%之間，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于10%，說明該酶聯(lián)免疫試劑盒具備較高的精密度和準(zhǔn)確度；其對市售白菜、胡蘿卜、干洋蔥、土豆4種樣品的檢測結(jié)果與儀器檢測結(jié)果相吻合，說明該試劑盒達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)檢測水平，且分析周期短，樣品前處理方法簡單，操作方便，檢測設(shè)備投入少，耗能低，可實(shí)現(xiàn)對蔬菜中殘留阿維菌素類藥物的快速檢測。

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