魏敏，宋旭艷，羅誠浩，潘曦，郭國寧

（湖北中煙工業(yè)有限責任公司技術(shù)中心，湖北武漢430040）

咖啡（coffea.spp.）是茜草科（Rubiaceae）、咖啡屬（coffea）常綠灌木或小喬木，和茶葉、可可并稱為世界三大飲料，是世界第二大貿(mào)易產(chǎn)品。目前對咖啡香氣成分及各種影響因素的研究較多，周斌等[1-4]研究了不同溶劑、方法、烘焙時間、不同產(chǎn)地對烘焙咖啡的香氣成分的影響，吳桂蘋等[5]采用電子鼻對咖啡的品質(zhì)進行了研究，佟世生等[6]對發(fā)酵處理和酶解偶聯(lián)發(fā)酵處理的云南小粒咖啡鮮果和生豆進行電子舌檢測及主成分分析和聚類分析，程金煥等[7]研究了酶促發(fā)酵在咖啡初加工過程中的影響；Alonso-Salces等[8]采用高效液相色譜-二極管陣列檢測器-電噴霧碰撞誘導解離-串聯(lián)質(zhì)譜在線檢測了咖啡豆中的化學成分，Baggenstoss等[9]研究了咖啡豆烘焙過程中時間-溫度對芳香性成分形成的影響，F(xiàn)rauendorfer等[10]對烘焙前后咖啡豆中的芳香性成分進行了比較分析。本試驗研究產(chǎn)香菌（桑腸桿菌L4-3）發(fā)酵對咖啡提取物揮發(fā)性成分的影響，鮮見報道，旨在為開發(fā)生物產(chǎn)香咖啡香料提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

桑腸桿菌Enterobacter mori VL4-3 CCTCC M2012020，從香莢蘭植物的莖中篩選得到，于2012年1月16日保藏于武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心；斜面培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，BR）、原始種子培養(yǎng)基（麥芽糖蛋白胨培養(yǎng)基：麥芽糖50 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，BR）：北京三藥科技開發(fā)公司；發(fā)酵培養(yǎng)基：市售咖啡豆粉粹到60目后，回流提取3 h的濾液；葡萄糖、瓊脂、麥芽糖、蛋白胨、氯化鈉、二氯甲烷、無水硫酸鈉、95%乙醇：國藥集團化學試劑有限公司，AR；馬鈴薯：市售；發(fā)酵底物為咖啡提取物：市售咖啡豆（產(chǎn)地巴西）。

SHP-080生化培養(yǎng)箱：上海精宏試驗設(shè)備有限公司；YX.350Z滅菌鍋：上海三申醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺：蘇凈集團安泰公司；HQL 300B恒溫搖床：武漢中科科儀技術(shù)發(fā)展有限責任公司；Agilent 6890N/5973型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：安捷倫科技公司。

1.2 方法

1.2.1 微生物發(fā)酵咖啡提取物的制備

用接種環(huán)挑取一環(huán)L4-3到裝有200 mL液體種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，32℃，100 r/min培養(yǎng)48 h。將咖啡豆粗粉和水按質(zhì)量比1：20混合，回流提取4.5 h后，抽濾，取濾液，115℃滅菌20 min；將產(chǎn)香菌株L4-3接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，在恒溫培養(yǎng)箱中32℃、pH自然，靜置培養(yǎng)60 h后置于4℃冰箱中；用上述斜面培養(yǎng)物，接種到種子培養(yǎng)基，在32℃，轉(zhuǎn)速100 r/min條件下振蕩培養(yǎng)28 h，連續(xù)轉(zhuǎn)接3次后制得種子培養(yǎng)液；將種子培養(yǎng)液按體積比18%接種到咖啡濾液中，裝罐量為30%，在pH自然、溫度32℃、轉(zhuǎn)速100 r/min，避光條件下，發(fā)酵48 h，得到咖啡發(fā)酵液，抽濾濃縮得到相對密度約為1.3的浸膏，與95%乙醇按質(zhì)量比1∶3進行醇沉，靜置過夜后抽濾，保留濾液，減壓濃縮，制得黃褐色浸膏，密度為1.16，為微生物發(fā)酵咖啡提取物。

1.2.2 揮發(fā)性成分GC/MS對比分析

1.2.2.1 同時蒸餾萃取

將5 g微生物發(fā)酵咖啡提取物裝入圓底燒瓶中，加入400 mL水，用電熱套加熱至沸騰，另一側(cè)的圓底燒瓶中加入200 mL的二氯甲烷，60℃水浴沸騰，待中間分液管處液面出現(xiàn)分層后計時萃取4 h。萃取結(jié)束后，向二氯甲烷萃取液中加入無水硫酸鈉，過夜，過濾并濃縮至1 mL，濃縮液用于進行GC/MS分析。同樣的方法進行5 g未發(fā)酵咖啡提取物對照的同時蒸餾萃取，進行GC/MS分析。

1.2.2.2 揮發(fā)性成分GC/MS分析

HP-5MS（50 m×0.25 mm×0.25 μm）毛細管柱；進樣溫度：250 ℃；分流比 10 ∶1；載氣：He，1 mL/min；升溫程序：從 50℃（1 min）以 5℃/min升到 250℃（5 min）；傳輸線溫度：250℃；離子源：EI源；電子能量：70 eV；掃描范圍：50 amu～400 amu；使用WILEY和MINILAB譜庫進行檢索。

2 結(jié)果與分析

微生物（桑腸桿菌L4-3）發(fā)酵咖啡提取物及其對照的揮發(fā)性成分GC/MS分析結(jié)果見表1。

表1 微生物發(fā)酵咖啡提取物及其對照的揮發(fā)性成分GC/MS對比分析Table 1 Comparative analysis of volatile components in GC/MS between the microbial fermented coffee extract and its control

續(xù)表1 微生物發(fā)酵咖啡提取物及其對照的揮發(fā)性成分GC/MS對比分析Continue table 1 Comparative analysis of volatile components in GC/MS between the microbial fermented coffee extract and its control

由表1可知：咖啡提取物對照共分離鑒定出32種揮發(fā)性香氣成分，主要包括酮類、高級脂肪酸酯類、呋喃和酚類；微生物發(fā)酵咖啡提取物共分離鑒定出34種香氣成分，其中酸類3種（25.48%），烯類7種（11.15%），醇類6種（8.62%），酯類 4種（6.84%），醛類5種（2.21%），酮類5種（2.04%），酚1種（6.46%），烷烴1種，其他雜環(huán)化合物2種；微生物發(fā)酵咖啡提取物揮發(fā)性成分中，新出現(xiàn)了17種香氣成分，主要有異戊醛、3-甲基丁酸、2-甲基丁酸、青葉醛、苯甲醇、3-甲氧基苯乙酮、香蘭素、棕櫚酸乙酯及其他烯酮、烯醛、呋喃、醇、酯等。其中，異戊醛能提調(diào)嗅香，3-甲基丁酸是酸性物質(zhì)成分，增添水果、酒和乳脂等風味，改善辛辣刺激，對喉部有柔和滋潤作用；2-甲基丁酸相對含量較高（約17%），能賦予堅果和黃油的香氣。有些小分子的有機酸、烯酮類、四氫呋喃類物質(zhì)可能是酯類等大分子物質(zhì)微生物轉(zhuǎn)化、氧化分解等代謝產(chǎn)物；香蘭素能增加食品的香莢蘭香氣，豐富香氣提升品質(zhì)，可能是咖啡液中的阿魏酸、愈創(chuàng)木酚、對乙烯基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚等經(jīng)微生物酶體系催化轉(zhuǎn)化而來；4-甲氧基苯乙酮，有山楂花和類似茴香醛香；雙丙酮醇，有愉快香氣；棕櫚酸乙酯是高級脂肪酸酯，具有淡甜柔和香氣；微生物發(fā)酵咖啡提取物中，己酸、2-糠醇、苯乙醇、亞油酸乙酯等成分的含量有不同程度的提高。己酸是低碳鏈的有機酸；2-糠醇帶焦香；苯乙醇具有清甜玫瑰香氣；亞油酸乙酯具有典型的果香味；⑤經(jīng)微生物發(fā)酵，咖啡提取物中的一些大分子成分消失或含量降低，如2-甲基戊酸甲酯、愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、對乙烯基愈創(chuàng)木酚、苯乙烯、2，4-二叔丁基苯酚、鄰苯二甲酸丁基-2-乙基己酯、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸單（2-乙基己基）酯等。鄰苯二甲酸二丁酯及其他兩種鄰苯二甲酸酯類、2，4-二叔丁基苯酚、苯乙烯等屬有害成分，吸入可引起喉部刺激，經(jīng)微生物酶體系作用而分解、降解，有利于咖啡提取物香氣質(zhì)的提高。所有這些香氣糅合在一起，賦予發(fā)酵咖啡提取物具有咖啡特征香氣的同時，帶有濃郁堅果奶香等豐富、醇厚香氣，其香氣質(zhì)提高，刺激性、苦澀感、有害物質(zhì)減少。

3 結(jié)論

咖啡提取液經(jīng)微生物（桑腸桿菌Enterobacter mori L4-3）發(fā)酵后，對其揮發(fā)性香氣成分影響較大，新增、相對含量變化以及消失的成分較多，賦予發(fā)酵咖啡提取物在富有咖啡特征香氣的同時也具有濃郁堅果奶香等豐富、醇厚香氣，刺激性成分減少、苦澀感減少，香氣自然豐富，香氣質(zhì)提高。本研究旨在研究采用微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)提升天然香料品質(zhì)，為提高天然香料的可用性和經(jīng)濟價值提供新的參考途徑，并且提供其在食品中的應(yīng)用轉(zhuǎn)化理論基礎(chǔ)，未來將進一步深入研究生物技術(shù)對天然香原料的提質(zhì)加工的作用。

參考文獻：

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[2]周斌,任洪濤,秦太峰.兩種前處理方法在云南小?？Х认銡獬煞址治鲋械膶Ρ萚J].現(xiàn)代食品科技,2013,29(7):1716-1720

[3]張豐,董文江,王凱麗,等.云南不同地區(qū)烘焙咖啡豆揮發(fā)性成分的HS SPME/GC MS分析[J].食品工業(yè)科技,2015,36(11):273-280

[4]周斌,任洪濤.烘焙時間對云南小粒咖啡揮發(fā)性成分影響的研究[J].現(xiàn)代食品科技,2015,31(1):236-244

[5]吳桂蘋,胡榮鎖,盧少芳,等.電子鼻在咖啡產(chǎn)品品質(zhì)檢測中的應(yīng)用研究[J].香料香精化妝品,2011,10(5):7-9

[6]佟世生,王麗,靳靜言,等.酶解偶聯(lián)發(fā)酵體外模擬麝香貓咖啡的電子舌相關(guān)性分析[J].食品工業(yè)科技,2015,36(22):133-142

[7]程金煥,何紅艷,李慧敏,等.酶促發(fā)酵在咖啡初加工過程中的應(yīng)用初探[C].昆明:第十六屆中國科協(xié)年會——分17精品咖啡豆認證與公平交易及莊園標準化國際論壇論文集,2014

[8]Alonso-Salces RM,Guillou C,Berrueta LA.Liquid chromatography coupled with ultraviolet absorbance detection,electrospray ionization,collision-induced dissociation and tandem mass spectrometry on a triple quadrupole for the on-line characterization of polyphenols and methylxanthines in green coffee beans[J].Rapid Commun Mass Spectrom,2009,23:363-383

[9]Baggenstoss J,Poisson L,Kaegi R,et al.Coffee roasting and aroma formation:application of different time-temperature conditions[J].Agric.Food Chem.,2008,56:5836-5846

[10]Frauendorfer F,Schieberle P.Changes in key aroma compounds of criollo cocoa beans during roasting[J].Agric Food Chem,2008,56:10244-10251