崔鵬，高元棟，李玉文，袁岐山

（1.黃河水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院環(huán)境與化學(xué)工程系，河南開封475004；2.開封市綠色涂層材料重點實驗室，河南開封475004；3.河南大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，河南開封475004；4.河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，河南鄭州450000）

花椒，落葉灌木或小喬木，生于林緣、灌叢或坡地石旁，是一種重要的中藥材。花椒葉中含有芳香油、糖苷、蛋白質(zhì)、纖維素、維生素、礦物質(zhì)元素、黃酮類化合物等多種成分[1-2]。其中的活性成分黃酮類化合物具有抑菌、抗癌、抗氧化、抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗衰老等藥理功效，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品、藥品、日用化工等領(lǐng)域[3-5]。目前常用的黃酮提取方法有：浸提法、大孔樹脂吸附法、萃取法、超聲輔助法[6-7]。其中浸提法較為成熟，但提取緩慢，溶劑消耗量大，提取效率略低：大孔樹脂吸附法吸附速度快，選擇性好，但操作復(fù)雜，工藝要求較高：溶劑萃取法，純化度高，生產(chǎn)周期短，但提取率低，試劑成本高，有毒且易燃[8]：超聲輔助法操作簡單、方便快捷、精度高、溶劑消耗量少、成本低、無污染等優(yōu)點[9-13]。因此本試驗利用超聲輔助法探討花椒葉中黃酮的提取工藝，并用中心組合設(shè)計法（Central Composite Design，CCD）響應(yīng)面對其進行優(yōu)化，確定最佳工藝參數(shù)，為花椒葉的進一步開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品與試劑

花椒葉：山西省運城近郊；蘆丁標準品（試劑純度≥98%）：中國藥品生物制品鑒定所本試驗所；無水乙醇（分析純）：安徽安特食品股份有限公司；亞硝酸鋁（分析純）：焦作市化工三廠；氫氧化鈉（分析純）、硝酸鋁（分析純）：天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；過氧化氫（分析純）：天津市富宇精細化工有限公司；硫酸亞鐵（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；水楊酸（分析純）：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；2，2-聯(lián)氮基-雙-（3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽[2，2-azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic），ABTS]（分析純）：合肥博美生物科技有限公司。

1.1.2 樣品預(yù)處理

取新鮮的花椒葉，洗凈后60℃干燥、粉碎并過篩，裝入棕色瓶中備用。

1.1.3 儀器與設(shè)備

TU-1810紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；FA2004N電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；KQ-100E超聲波：南京先歐儀器制造有限公司；GM-0.33A隔膜真空泵：天津津騰科技發(fā)展有限公司；FW-100高速萬能粉碎機：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；101-1A電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 提取

準確稱取處理后的花椒葉樣品1.000 0 g，與不同體積分數(shù)的乙醇混合、攪拌并靜置15 min，在不同的超聲溫度下，選擇不同的超聲時間制得待測樣品提取液，用30%乙醇定容至50 mL容量瓶中，低溫保存。進行3次平行試驗，取算術(shù)平均值。

1.2.2 蘆丁標準曲線及黃酮含量的測定

準確稱取0.020 0 g蘆丁標準品，用30%乙醇定容至100 mL，配置成濃度為0.20 mg/mL的標準溶液。用移液管準確移取 0.00、2.50、5.00、7.50、10.00、12.50 mL的標準溶液于25 mL容量瓶中，加入1.00 mL 5%亞硝酸鈉溶液、1.00 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻靜置5 min，然后分別加入10.00 mL 4%氫氧化鈉溶液，用30%乙醇定容至刻度線，搖勻靜置15 min。在波長為505 nm的條件下測吸光度。以蘆丁濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.3 單因素試驗

取1.000 0 g花椒葉，選取不同的乙醇體積分數(shù)，相應(yīng)的液料比，不同的提取時間和不同的超聲溫度制得待測樣品，測定吸光度值，試驗平行3次，取算數(shù)平均值。具體各因素水平見表1。

表1 單因素試驗條件Table 1 Experimental conditions of single-factor

1.2.4 花椒葉黃酮抗氧化試驗

以·OH和ABTS+·的清除率來考察花椒葉中黃酮的抗氧化性。

1.2.4.1 ·OH的清除

參照羅松明等[14-15]的方法，以水楊酸比色法測定羥基自由基清除率。取不同濃度的樣品液1.00 mL，依次加入2.00 mL亞硫酸鐵、1.50 mL水楊酸、0.10 mL過氧化氫，搖勻，置于暗處30 min，以蒸餾水作參比，于510 nm波長測定吸光度。清除率公式為：

式中：A0為生成的羥基自由基溶液吸光度值；A1為樣品液和生成羥基自由基溶液吸光度值；A2為樣品液吸光度值。

1.2.4.2 ABTS+·的清除

參照韓光亮等[16]方法，以分光光度法測定ABTS+·清除率。取不同體積分數(shù)樣品液2.00 mL，與8.00 mLABTS溶液混合，混勻，置于暗處30 min，以蒸餾水作參比，于517 nm波長測定吸光度。ABTS+·清除率公式為：

式中：A0為樣品液和ABTS溶液吸光度值；A1為ABTS溶液吸光度值；A2為不含ABTS溶液時樣品液吸光度值。

1.2.5 CCD響應(yīng)面試驗設(shè)計與優(yōu)化

依據(jù)單因素試驗結(jié)果，參照周輝[17-18]等方法，運用Design Expert 8.0.6軟件CCD響應(yīng)面試驗設(shè)計四因素五水平試驗，并優(yōu)化提取工藝，試驗平行3次，取算數(shù)平均值。具體因素水平編碼條件見表2。

表2 因素水平編碼表Table 2 Factors and levels of CCD test

1.3 數(shù)據(jù)處理

參照王彥平等[19-20]方法，試驗數(shù)據(jù)采用origin7.5軟件制圖，分析單因素試驗結(jié)果：運用Design Expert 8.0.6軟件進行響應(yīng)面結(jié)果分析和圖形輸出。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線

試驗獲得蘆丁標準系列方程為：y=9.4186x+0.0032，R2=0.999 6，該標準曲線在0 mg/mL～0.01 mg/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。

蘆丁標準曲線如圖1所示。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 乙醇體積分數(shù)對花椒葉黃酮提取率的影響

稱取1.000 0 g待測樣，以不同體積分數(shù)的乙醇，一定液料比、超聲時間、超聲溫度進行單因素試驗，測定、計算黃酮提取率，結(jié)果見圖2。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 The standard curve of rutin

圖2 乙醇體積分數(shù)對花椒葉黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of percentage of ethanol volume on the extraction rate of flavonoids from leaves of Zanthoxylum

如圖2所示，隨著乙醇體積分數(shù)的增大黃酮提取率增大，在60%時黃酮提取率最大，之后呈現(xiàn)下降趨勢。推測是由于體積分數(shù)過高，不利于溶解黃酮物質(zhì)。此外，當(dāng)體積分數(shù)過高時，會溶出醇溶性的雜質(zhì)、色素和脂類物質(zhì)影響黃酮的提取率。因此選擇乙醇體積分數(shù)為60%。

2.2.2 液料比對花椒葉黃酮提取率的影響

稱取1.000 0 g待測樣，以不同液料比，一定體積分數(shù)的乙醇、超聲時間、超聲溫度進行單因素試驗，測定、計算黃酮提取率，結(jié)果見圖3。

如圖3所示，隨著液料比的增大黃酮提取率也逐漸增大，在20∶1（mL/g）時提取率達到最大，之后呈下降趨勢。液料比的增加有利于黃酮類物質(zhì)溶出，但液料比過大時，會導(dǎo)致溶液濃度變小，從而影響黃酮類物質(zhì)對超聲的提取，以至于黃酮提取率下降。因此選擇液料比為 20∶1（mL/g）。

2.2.3 超聲時間花椒葉黃酮提取率的影響

稱取1.000 0 g待測樣，以不同超聲時間，一定體積分數(shù)的乙醇、液料比、超聲溫度進行單因素試驗，測定、計算黃酮提取率，結(jié)果見圖4。

圖3 液料比對花椒葉黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on the extraction rate of flavonoids from leaves of Zanthoxylum

圖4 超聲時間對花椒葉黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the extraction rate of flavonoids from leaves of Zanthoxylum

圖5 超聲溫度對花椒葉黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic temperature on the extraction rate of flavonoids from leaves of Zanthoxylum

表5 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 5 Design and result of CCD

如圖4所示，隨著超聲時間的增加黃酮提取率增加，在20 min時提取率達到最大，而后又下降。這可能是由于隨著時間的增加，乙醇揮發(fā)加快，反應(yīng)體系中溫度升高，溶出黃酮有所分解，從而影響提取率。因此選擇超聲時間為20 min。

2.2.4 超聲溫度花椒葉黃酮提取率的影響

稱取1.000 0 g待測樣，以不同超聲溫度，一定體積分數(shù)的乙醇、液料比、超聲時間進行單因素試驗，測定、計算黃酮提取率，結(jié)果見圖5。

如圖5所示，隨著超聲溫度的增加黃酮提取率增加，在60℃時提取率達到最大，而后呈現(xiàn)急劇下降趨勢。這可能是因為溫度越高，超聲產(chǎn)生了大量熱能，導(dǎo)致黃酮物質(zhì)分解。因此選擇超聲溫度為60℃。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化工藝條件

2.3.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

根據(jù)響應(yīng)面設(shè)計原理和因素編碼表（如表5所示），響應(yīng)值為花椒葉中黃酮的提取率（Y），使用Design-Expert8.0.6軟件的CCD模塊進行試驗設(shè)計和結(jié)果分析，具體如表5所示。

2.3.2 模型的建立及方差分析

參照王燕等[21-23]的方法，使用Design-Expert8.0.6軟件將試驗?zāi)Ｐ瓦M行分析，得經(jīng)回歸擬合后，由響應(yīng)面分析法得出關(guān)于超聲輔助法提取黃酮得率的二次回歸擬合方程

對所建模型進行一系列分析，具體結(jié)果如表6所示。

表6 多元回歸模型方差分析Table 6 Analysis of variance for the response surface quadratic model

由表6可得，該模型總體水平上為顯著。R2=0.9954，說明方程的線性關(guān)系顯著。模型的變異系數(shù)CV=0.89%，說明模型的變異系數(shù)低。P＜0.000 1說明該模型具有極顯著性。失擬項P=0.119 5，不顯著，說明非試驗因素對提取率影響較小。證明該試驗值有較高的精密度及可靠性。綜合發(fā)現(xiàn)該模型是可以用來分析和預(yù)測花椒葉中黃酮的提取量。根據(jù)F值的大小，推測本試驗幾個影響因素的重要性為：乙醇體積分數(shù)（A）＞超聲時間（B）＞液料比（C）＞超聲溫度（D）。用模型預(yù)測出來的最佳條件是：乙醇體積分數(shù)為60.07%，超聲時間為20.35 min，液料比為 20.12∶1（mL/g），超聲溫度 60.22 ℃，此時花椒葉中黃酮的提取量為10.18 mg/g。

2.3.3 響應(yīng)面分析

用Design-Expert8.0.6軟件繪制以黃酮提取率為響應(yīng)值的各因子交互作用的響應(yīng)面圖。具體如圖6～11所示。

圖6 超聲時間與超聲溫度的響應(yīng)面和等高線Fig.6 The response surface and contour figure about ultrasound time and ultrasonic temperature

圖7 超聲時間與液料比的響應(yīng)曲面和等高線Fig.7 The response surface and contour figure about ultrasound time and liquid-solid ratio

圖8 液料比與超聲溫度的響應(yīng)曲面和等高線Fig.8 The response surface and contour figure about liquid-solid ratio and ultrasonic temperature

圖9 乙醇體積分數(shù)與超聲時間的響應(yīng)曲面和等高線Fig.9 The response surface and contour figure about percentage of ethanol volume and ultrasound time

圖10 乙醇體積分數(shù)與液料比的響應(yīng)曲面和等高線Fig.10 The response surface and contour figure about percentage of ethanol volume and liquid-solid ratio

圖11 乙醇體積分數(shù)與超聲溫度的響應(yīng)曲面和等高線Fig.11 The response surface and contour figure about percentage of ethanol volume and ultrasonic temperature

由圖6～9可以看出，提取率隨著超聲時間的增大而增大，在20 min時達到最大值，而后開始下降。超聲溫度和液料比呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。隨著液料比的增加，提取率呈增加趨勢，超聲溫度也呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。乙醇體積分數(shù)與超聲時間趨勢也大致相同。由等高線圖可以看出，等高線呈橢圓形，說明超聲時間與超聲溫度、超聲時間與液料比、液料比與超聲溫度、乙醇體積分數(shù)與超聲時間的交互影響較為顯著。由圖10可以看出，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，提取率也呈先上升后下降的趨勢，液料比的變化趨勢也與之相似。說明乙醇體積分數(shù)與液料比的影響較大，表現(xiàn)為曲線更為陡峭。由等高線圖可以看出，等高線呈扁橢圓形趨勢，說明其交互作用影響更為顯著。由圖11可以看出，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，提取率隨超聲溫度的增加呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，表明乙醇體積分數(shù)與超聲溫度對試驗的影響更大，等高線呈更為扁平的橢圓形，表明乙醇體積分數(shù)和超聲溫度的交互作用最為顯著，因此曲線最為陡峭。由此可見，乙醇體積分數(shù)與超聲溫度的交互作用最為顯著。

2.4 最優(yōu)工藝及驗證試驗

由于考慮到實際操作，將最優(yōu)提取條件調(diào)整為乙醇體積分數(shù) 60%、超聲時間 20min、液料比 20∶1（mL/g）、超聲溫度60℃，進行3次平行試驗，得到花椒葉中黃酮提取率平均值為10.13 mg/g。與理論預(yù)測值接近，說明該模型可用于花椒葉黃酮提取工藝的優(yōu)化。

2.5 抗氧化能力測定結(jié)果分析

2.5.1 對·OH的清除

考察花椒葉中黃酮類物質(zhì)對·OH的清除能力，當(dāng)提取液濃度為2.00 mg/mL時清除率達到最高57.21%，說明花椒葉黃酮類物質(zhì)對·OH具有較好的清除作用。

2.5.2 ABTS+·的清除

考察花椒葉中黃酮類物質(zhì)對ABTS+·的清除能力，當(dāng)提取液濃度在4.00 mg/mL時自由基的清除率達到47.32%，也證明了花椒葉黃酮類物質(zhì)具有較好的抗氧化性。

3 結(jié)論

使用超聲波提取法提取花椒葉中的黃酮，經(jīng)Design-Expert8.0.6優(yōu)化，最優(yōu)試驗條件如下：乙醇體積分數(shù) 60%、超聲時間 20 min、液料比 20∶1（mL/g）、超聲溫度60℃，在此條件下黃酮平均提取率為10.13 mg/g，與模型預(yù)測值10.18 mg/g較為接近，說明該模型可用于花椒葉黃酮提取工藝的優(yōu)化。研究發(fā)現(xiàn)花椒葉中黃酮提取液對·OH的清除率57.21%，對ABTS+·的清除率47.32%，證明該提取物具有較好的抗氧化能力。另外，超聲提取作為一種清潔、高效的提取手段被用于天然有效成分的提取中，不僅可以較為顯著的降低成本，而且還可以提高其提取率，該方法對花椒葉中黃酮的提取具有一定的實際意義。

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