藍尉冰，韓鑫，陳冠余，陳美花1，，4

（1.廣西北部灣海洋生物多樣性養(yǎng)護重點實驗室/北部灣海洋生物資源開發(fā)與保護重點實驗室，廣西欽州535099；2.欽州學院，廣西欽州535099；3.廣西大學，廣西南寧530004；4.廣西北部灣特色海產(chǎn)品資源開發(fā)與高值化利用高校重點實驗室，廣西欽州535099；5.武漢理工大學，湖北武漢430063）

近江牡蠣，屬軟體幼物門[1]，是廣西沿海地區(qū)特有的名貴海洋貝類品種，主要分布在北海市西部到防城港一帶河口附近低鹽海區(qū)，欽州龍門附近茅尾海出產(chǎn)的牡蠣歷史最為悠久[2]。其以肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量超過40%，被稱為“海中牛奶”，此外，近江牡蠣含有豐富的生物活性肽物質(zhì)，當前有現(xiàn)代醫(yī)

學研究表明活性肽具有很高的醫(yī)學藥用價值，在降低血糖、血壓、抗腫瘤、抗氧化和提高免疫力等領(lǐng)域都具有特殊的生物活性[3-10]。廣西北部灣沿海天然近江牡蠣資源豐富，主要分布于茅尾海海域附近[11]，因此，充分利用地理優(yōu)勢，研究近江牡蠣活性肽提取工藝，對其藥用開發(fā)與利用具有重要意義。超聲提取作為一種新型的輔助提取手段，已廣泛應用于化學、食品等許多科學研究領(lǐng)域。超聲空化效應促進細胞壁的破壞，增強溶劑和目標化合物之間的接觸[12]，超聲波細胞破碎的原理主要是由電能轉(zhuǎn)化得到的聲能通過液體介質(zhì)而變成一系列小氣泡，氣泡炸裂隨之引起破碎細胞的作用[13]。且破壞完整的空間結(jié)構(gòu)，部分弱鍵斷裂，內(nèi)部非極性基團暴露到分子表面，增大酶接觸位點，使提取過程更高效，更環(huán)保[14]。酶解法破壞細胞壁的特殊化學鍵，達到破壁效果，其具有高度專一性，條件溫和，一般不會破壞原料物化性質(zhì)。歐成坤等[15]認為隨著水解程度的增大，大分子的蛋白質(zhì)不斷被水解成小分子肽類，與此同時水解產(chǎn)物對蛋白酶活性的抑制作用也減弱，由此可知，可通過測定酶解液氨基態(tài)氮（amino acid nitrogen，AAN）含量間接表征活性肽含量[16]。本試驗期望通過超聲波預處理輔助酶酶解，考察料水比、超聲功率、加酶量、pH值、酶解時間對近江牡蠣活性肽提取率的影響，以氨基態(tài)氮（amino acid nitrogen，AAN）含量為指標反映活性肽含量，即氨基態(tài)氮含量越大，近江牡蠣的水解程度越大，酶解液中活性肽的含量越大。利用正交試驗法對相關(guān)參數(shù)進行優(yōu)化，確定最佳提取工藝，以提高近江牡蠣活性肽提取率，為不同海域牡蠣活性肽含量對比及其結(jié)構(gòu)分析提供理論數(shù)據(jù)指導，并為近江牡蠣高值產(chǎn)品加工多樣化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

近江牡蠣：欽州市鴻發(fā)市場；堿性蛋白酶（5.0×104U/g）、胰蛋白酶（5.0×104U/g）、酸性蛋白酶（5.0×104U/g）、中性蛋白酶（5.0×104U/g）：無錫酶制劑廠；菠蘿蛋白酶：廣西南寧龐博生物工程有限公司；DKrS28型電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；H1850R型臺式高速冷凍離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；Phs-2型酸度計：上海第二分析儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 酶種的選擇

將新鮮的近江牡蠣肉清洗后用組織搗碎機搗碎，取10 g肉漿，按表1進行試驗，后加熱100℃滅酶活15 min，后將酶解液以4 000 r/min離心15 min，取其上清液到50 mL的容量瓶定容，待用[17-19]。

表1 酶種及其條件Table 1 Enzyme species and conditions

1.2.2 單因素試驗

以氨基態(tài)氮為指標，考察料水比（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5 g/mL），超聲功率（100、200、300、400、450、500 W）；加酶量（400、800、1 200、1 400、1 600 U/g），pH 值（7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5），水解溫度（40、45、50、55、60 ℃），水解時間（2、3、4、5、6 h）7 個因素對其影響，確定最佳工藝的因素水平。

1.2.3 正交試驗優(yōu)化

以單因素試驗為依據(jù)，根據(jù)正交試驗設(shè)計原理[20]，選取對近江牡蠣活性肽提取有較大影響的超聲波功率、pH值、料水比、加酶量、酶解時間5個因素，設(shè)計五因素四水平正交試驗，以優(yōu)化提取工藝。因素與水平見表2。

表2 因素水平表Table 2 actor level table

1.2.4 氨基態(tài)氮（AAN）含量測定

氨基態(tài)氮（AAN）含量測定采用電位滴定法[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶的確定

為選出合適酶種，分別選取堿性蛋白酶、胰蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶+菠蘿蛋白酶，并在其最佳作用條件下進行酶解，所得結(jié)果如圖1所示。

圖1 5種外源性蛋白酶對近江牡蠣酶解效果圖Fig.1 Effect of five exogenous proteases on enzymatic hydrolysis of Ostrea rivularis Gould

5種蛋白酶對近江牡蠣的酶解效果不一致。其中，堿性蛋白酶水解效果最大，為8.44 mg/g，中性蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶+菠蘿蛋白酶相差不大，分別為5.50、5.71、6.20 mg/g，酸性蛋白酶酶解效果最差，為4.48 mg/g，約為堿性蛋白酶1/2。不同種類酶水解效果不一致可能是不同的酶對牡蠣蛋白肽鏈的作用位點不同，在不同的環(huán)境下酶對蛋白質(zhì)的作用效果有所區(qū)別。此結(jié)果與付勁[21]效果趨勢基本是一致的。由此可選堿性蛋白酶進行酶解試驗。

2.2 料水比對近江牡蠣活性肽提取影響

料水比對近江牡蠣活性肽提取影響結(jié)果見圖2。

圖2 料水比對近江牡蠣活性肽提取影響Fig.2 Effect of solid-water ratio on extraction of bioactive peptides from Ostrea rivularis Gould

由圖2可知，料水比是影響酶對近江牡蠣活性肽的酶解效果的因素之一。隨著水分濃度的增大。溶液中活性肽含量逐漸增多，但加入過多的蒸餾水，堿性蛋白酶被稀釋，酶解效果降低，漿液本身總活性肽含量下降，造成資料浪費，超聲破碎利用不充分。加入的蒸餾水太少，近江牡蠣液濃度過高時超聲波空化作用難形成[22]，不利于蛋白質(zhì)釋放，影響到酶與底物的接觸面積，從而使酶解的效果降低。故宜選取料水比為1∶4（g/mL）。

2.3 超聲功率對近江牡蠣活性肽提取的影響

超聲波功率對近江牡蠣活性肽提取影響結(jié)果見圖3。

圖3 超聲波功率對近江牡蠣活性肽提取影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on extraction of bioactive peptides from Ostrea rivularis Gould

從圖3可知，超聲波功率對提取活性肽有顯著影響。在100 W～450 W，氨基態(tài)氮含量隨超聲波功率增大而增大，在450 W達到最大值為15.51 mg/g，后降低。其原因可能是空化效果隨超聲波功率變大增強，超聲波對細胞壁的破碎作用也隨之增強[23]，活性肽釋放率逐漸增大，表征出來的氨基態(tài)氮含量也逐漸增大。但隨著功率達到450 W后，活性肽溶出速率未見顯著提升。與江凌等[24]的研究結(jié)果基本一致，試驗宜選450 W超聲波功率。

2.4 加酶量對近江牡蠣活性肽提取影響

加酶量對近江牡蠣活性肽提取影響結(jié)果見圖4。

圖4 加酶量對近江牡蠣活性肽提取影響Fig.4 Effect of enzyme dosage on extraction of bioactive peptides from Ostrea rivularis Gould

從圖4可知，當加入酶的量越多，氨基態(tài)氮的含量就越多，當加酶量達到1 400 U/g時，含量最高，加入的量大于1 400 U/g，含量相對降低，說明在加酶量為1 400 U/g時，酶與底物的結(jié)合達到了飽和的狀態(tài)。故水解近江牡蠣的宜選加酶量為1 400 U/g。

2.5 pH值對近江牡蠣活性肽提取影響

pH值對近江牡蠣活性肽提取影響結(jié)果見圖5。

圖5 pH值對近江牡蠣活性肽提取影響Fig.5 Effect of pH on extraction of bioactive peptides from Ostrea rivularis Gould

由圖5可知，隨著pH值的增加，氨基態(tài)氮的含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。這是因為pH值是使酶變性的一個重要原因，而蛋白酶在強酸強堿的環(huán)境下，酶因相互減弱，對相同電符的基團互相排斥而表現(xiàn)不穩(wěn)定，酶分子上的催化基團、結(jié)合基團和其它基團的電離作用發(fā)生了改變，最終使酶變性失活。堿性蛋白酶對近江牡蠣水解的適宜pH值為8.5。

2.6 酶解時間對近江牡蠣活性肽提取影響

酶解時間對近江牡蠣活性肽提取影響結(jié)果見圖6。

圖6 酶解時間對近江牡蠣活性肽提取影響Fig.6 Effect of enzymolysis time on extraction of bioactive peptides from Ostrea rivularis Gould

從圖6可知，隨著酶解時間的延長，氨基態(tài)氮的含量明顯增大，當酶解時間在3 h以上時，氨基態(tài)氮含量基本保持不變，主要因為在加酶量不變的情況下，隨著酶解時間的延長，酶和底物的反應越充足，最后使蛋白酶達到飽和的狀態(tài)而不能使反應持續(xù)地進行，從而使得酶解產(chǎn)物隨著酶解時間的延長而保持產(chǎn)量不變的現(xiàn)象。但由于在試驗中在合理的情況下選取的時間越短越好，避免蛋白質(zhì)變性而給實驗帶來的誤差，因此為了合理安排試驗所需要的時間，酶解3 h時是水解的適宜時間。

2.7 正交試驗結(jié)果

在王一兵[14]對近江牡蠣的酶解工藝研究中，超聲波時間對酶解的效果影響不大，而據(jù)文獻資料中對堿性蛋白酶對牡蠣的最佳酶解工藝研究結(jié)果顯示[17]，溫度屬于次要因素，因此在正交試驗中可以不考慮這兩個因素。故選取超聲波時間為10 min，溫度為55℃，考察超聲功率、pH值、料水比、加酶量、酶解時間五因素四水平的正交試驗，結(jié)果如表3所示。

表3 正交試驗結(jié)果Table 3 Results on orthogonal test

從表 3 中的試驗結(jié)果 RD＞RC＞RE＞RB＞RA可知，各因素的對活性肽提取影響的主次順序為：D（加酶量）＞C（料水比）＞E（酶解時間）＞B（pH 值）＞A（超聲波功率）；在此試驗中試驗指標越大越好，所以堿性蛋白酶輔助超聲波后的最優(yōu)水解條件為：A3B1C2D3E2即超聲波功率為 450 W，pH 值 8.0，料水比為 1∶3（g/mL），加酶量為1 400 U/g，酶解時間3 h。

一般的，在正交試驗設(shè)計結(jié)果的方差分析中，正交表中沒有安排空列項，即沒有誤差項，則可把對水解效果影響最小的因素項當作誤差項進行方差分析。因此在本試驗中因素A可當作誤差項對試驗結(jié)果進行進一步的驗證分析。方差分析表如表4所示。

表4 方差分析表Table 4 Analysis of variance

據(jù)表4中的F值可知，因素的主次順序為D（加酶量）＞C（料水比）＞E（酶解時間）＞B（pH 值）＞A（超聲波功率），這與極差分析的結(jié)果是一致的，因此可以確定堿性蛋白酶輔助超聲波后對牡蠣的酶解的最優(yōu)方案為A3B1C2D3E2即超聲波功率為450 W，pH值為8.0，料水比為 1∶3（g/mL），加酶量為 1 400 U/g，酶解時間 3 h。

綜上所述，堿性蛋白酶輔助超聲波后對近江牡蠣活性肽提取的最佳酶解工藝為：超聲波功率450 W，超聲波時間 10 min，溫度 55 ℃，pH8.0，料水比 1∶3（g/mL），加酶量1 400 U/g，酶解時間3 h。并在此條件下進行驗證試驗，在此試驗中所測得的氨基態(tài)氮（ANN）含量為26.13 mg/g。比以上的試驗中的氨基態(tài)氮的含量都要高，由此驗證了此酶解工藝參數(shù)的準確性。確定了此酶解工藝條件對近江牡蠣活性肽提取實現(xiàn)工業(yè)化的可行性。

3 結(jié)論

采用超聲波預處理協(xié)同酶技術(shù)從近江牡蠣提取活性肽，以氨基態(tài)氮含量為指標，在單因素實驗基礎(chǔ)上設(shè)計正交試驗，考察了料水比、超聲功率、加酶量、pH值、酶解時間對近江牡蠣活性肽提取的影響，得到最優(yōu)提取工藝條件為：超聲波功率450 W，超聲波時間10 min，溫度 55 ℃，pH8.0，料水比 1∶3（g/mL），加酶量1 400 U/g，酶解時間3 h。并在此條件下進行驗證試驗，在此試驗中所測得的氨基態(tài)氮（ANN）含量為26.13 mg/g。

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