鄭覃，王青霞，李建穎

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300134）

黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）是一種枸杞屬（Lycium）茄科（Solanceae）的多年生灌木野生荒漠植物。黑果枸杞果實(shí)在成熟后呈近球形，為藍(lán)紫色，富含花色苷類色素，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他有色果實(shí)[1]?；ㄉ帐腔ㄇ嗨嘏c糖以糖苷鍵結(jié)合而成的一類化合物，是一種天然的抗氧化劑[2]，其抗氧化活性遠(yuǎn)強(qiáng)于維生素C、維生素E等[3-4]，因其結(jié)構(gòu)上含有的眾多酚羥基能夠阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而有效清除活性氧簇（Reactive Oxygen Species，ROS）[5-6]。目前國(guó)內(nèi)研究大多采用溶劑提取的方法對(duì)黑果枸杞中的花色苷進(jìn)行提取[7]，采用生物酶輔助提取黑果枸杞花色苷的研究還相對(duì)較少。由于花色苷存在于細(xì)胞內(nèi)或吸附在由纖維素組成的細(xì)胞壁上，常規(guī)方法提取花色苷很難獲得較高的提取率，果膠酶可以破壞細(xì)胞壁，使花色苷得到充分的釋放[8]，且生物酶的反應(yīng)條件相對(duì)溫和，更加有助于花色苷這種光敏、熱敏性物質(zhì)的提取[9-12]。本試驗(yàn)采用果膠酶輔助乙醇提取黑果枸杞中花色苷，在單因素的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化出最佳提取工藝條件，這對(duì)黑果枸杞花色苷的開發(fā)利用及工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

黑果枸杞干果：甘肅省民勤縣；果膠酶（酶活力500 U/mg）：上海源葉生物科技有限公司；乙醇（AR）：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；鹽酸（AR）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；冰乙酸（AR）：天津大學(xué)科威公司；醋酸鈉（AR）：天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；氯化鉀（AR）：天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司。

1.1.2 儀器

BSA224S-CW分析天平、PB-10pH計(jì)：德國(guó)Sartorius；RV10DIGITAL 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國(guó) IKA；UV-2600紫外可見分光光度計(jì)：日本Shimadzu；Spex 6875冷凍研磨儀：美國(guó)Spex；Heraguard ECO超凈工作臺(tái)：美國(guó)Thermo；DK-8AS電熱恒溫水浴鍋、DH-101電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海精密科學(xué)儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長(zhǎng)城科技工貿(mào)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

將黑果枸杞摘去葉子，放入35℃干燥箱中烘干40 min，黑果枸杞干粉是通過將黑果枸杞干果粉碎得到，粉碎工藝為：溫度嚴(yán)格控制在20℃以內(nèi)，每次粉碎時(shí)間為0.5 min，相鄰兩次粉碎時(shí)間間隔為5 min，粉碎3次，之后過30目篩。

1.2.2 緩沖液的配置

pH 1.0 的緩沖溶液：0.2 mol/L KCl∶0.2 mol/L HCl=25∶67，體積比；pH 4.5 的緩沖溶液：0.2 mol/L NaAc·3H2O∶0.2 mol/L HAc=1∶1，體積比。

1.2.3 總花色苷提取工藝

準(zhǔn)確稱取0.500 0 g黑果枸杞干粉，按一定料液比加入蒸餾水中，復(fù)水30 min，加入0.10%果膠酶，用醋酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)pH值至3.0，充分混合，于40℃水浴中進(jìn)行酶解反應(yīng)2 h，4 000 r/min，離心15 min，取上清液。濾渣按液料比20∶1（mL/g），加入80%體積濃度的乙醇溶液，在50℃條件下水浴回流提取1 h，4 000 r/min，離心15 min，與酶解后得到的上清液合并，即得提取液。

1.2.4 總花色苷含量測(cè)定

用pH試差法，以錦葵色素-3-葡萄糖苷為計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定總花色苷含量。

將提取液轉(zhuǎn)移至100.0 mL容量瓶?jī)?nèi)，用乙醇定容，再分別用pH 1.0和pH 4.5緩沖液稀釋10倍，混勻后，放入40℃水浴中靜置平衡40 min。對(duì)照組將乙醇用pH 1.0和pH 4.5緩沖液稀釋10倍，混合均勻后放入40℃水浴中平衡40 min，平衡結(jié)束后，測(cè)其在530 nm和700 nm處的吸光度A530和A700。按下式計(jì)算總花色苷含量[13-14]：

式中：Mw為錦葵色素-3-葡萄糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量，493 200 mg/mol；DF為稀釋因子；V為提取液的體積，0.1 L；ε為摩爾消光系數(shù)，29 600 L/（mol·cm）；L為光程厘米數(shù)，1 cm；m為原料的質(zhì)量，0.500 0 g。

1.2.5 單因素試驗(yàn)

按照1.2.3所述花色苷提取工藝，分別研究在提取時(shí)間 1 h、乙醇濃度 80%、液料比 20∶1（mL/g）、提取溫度50℃和加酶量0.10%條件下，改變其中單一因素對(duì)花色苷提取率（以花色苷含量表示）的影響，單因素試驗(yàn)水平如下：提取時(shí)間 0.5、1、1.5、2、2.5 h，乙醇濃度50%、60%、70%、80%、90%，液料比 10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1（mL/g），提取溫度 30、40、50、60、70 ℃，加酶量0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%。每個(gè)單因素試驗(yàn)平行重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.2.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面的設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果（加酶量0.10%），選取提取時(shí)間、乙醇濃度、液料比和提取溫度4個(gè)因素，以花色苷提取率作為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)[15-17]。因素水平表見表1。

表1 試驗(yàn)因素水平Table 1 Experimental factors and levels

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

作圖采用Origin8.0軟件，采用Design-Expert 8.0軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)花色苷提取效果的影響

提取時(shí)間對(duì)黑果枸杞花色苷提取率的影響如圖1所示。

從圖1可以得出，隨著提取過程的不斷進(jìn)行，花色苷的提取率開始有所增加。但當(dāng)時(shí)間超過1 h后，花色苷的提取率呈明顯下降的趨勢(shì)，一方面是由于提取時(shí)間過長(zhǎng)，氧化或光照作用會(huì)導(dǎo)致花色苷發(fā)生分解，使其提取率降低；另一方面是由于提取時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致其它非花色苷成分大量溶出，從而使得提取率降低。所以最佳提取時(shí)間為1 h。

圖1 提取時(shí)間對(duì)花色苷提取效果的影響Fig.1 Effect of extraction time on the anthocyanins extraction

2.1.2 乙醇濃度對(duì)花色苷提取效果的影響

乙醇濃度對(duì)黑果枸杞花色苷提取的影響如圖2所示。

圖2 乙醇濃度對(duì)花色苷提取效果的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the anthocyanins extraction

由圖2可知，隨著乙醇濃度的不斷增高，黑果枸杞花色苷的提取率逐漸上升，說明在一定范圍內(nèi)，隨著乙醇濃度的增加，溶劑的滲透力也隨之增加，從而有利于花色苷的溶出，但當(dāng)乙醇濃度過高時(shí)，溶液的極性降低不利于極性的花色苷的溶出。所以80%的乙醇為最佳提取劑。

2.1.3 液料比對(duì)花色苷提取效果的影響

液料比對(duì)黑果枸杞提取效果的影響如圖3所示。

由圖3可以看出，隨著液料比的逐漸增加，黑果枸杞花色苷的提取率逐漸上升后趨于平穩(wěn)，原因是溶劑在一定范圍內(nèi)能較為充分的提取花色苷，若進(jìn)一步增加液料比，對(duì)其影響不大，且成本會(huì)增大，所以最佳液料比為 20∶1（mL/g）。

圖3 液料比對(duì)花色苷提取效果的影響Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on the anthocyanins extraction

圖4 提取溫度對(duì)花色苷提取效果的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the anthocyanins extraction

圖5 加酶量對(duì)花色苷提取效果的影響Fig.5 Effect of enzyme dose on the anthocyanins extraction

2.1.4 提取溫度對(duì)花色苷提取效果的影響

提取溫度對(duì)花色苷提取效果的影響如圖4所示。

由圖4可知，隨著溫度的升高，花色苷的提取率開始上升。由分子運(yùn)動(dòng)論可知，溫度升高會(huì)使分子運(yùn)動(dòng)加快，溶解和擴(kuò)散的速度也隨之加快，溫度較高可能會(huì)使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，更易使花色苷被釋放到溶劑中，從而使其花色苷的提取率逐漸上升。但溫度到達(dá)50℃以后，花色苷的提取效果明顯下降。可能是由于溫度過高產(chǎn)生的強(qiáng)氧化作用使部分花色苷的結(jié)構(gòu)遭到破壞，最終使得提取效果降低，所以50℃為最佳提取溫度。

2.1.5 加酶量對(duì)花色苷提取效果的影響

加酶量對(duì)花色苷提取效果的影響如圖5所示。

由圖5可知，隨著加酶量的增大，花色苷的提取率也在逐漸上升。由于黑果枸杞細(xì)胞壁主要成分為果膠和纖維素，但果膠所占比例較大，所以提取時(shí)所加果膠酶的量越多，更有利于花色苷被釋放到溶劑中。但加酶量超過0.10%之后，花色苷的提取效果明顯降低。是由于過量的果膠酶能夠使花色苷中的糖苷鍵水解斷裂[18]，使部分花色苷的結(jié)構(gòu)遭到破壞，最終使得提取效果降低，所以0.10%為最佳加酶量。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Result of response surface test

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)回歸擬合后，得到黑果枸杞花色苷提取率對(duì)各試驗(yàn)因子的二次多項(xiàng)回歸方程為：

各因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度可以由此方程中各項(xiàng)系數(shù)的絕對(duì)值的大小直接反映，系數(shù)的正、負(fù)決定了影響的方向。因?yàn)榇朔匠讨械钠椒巾?xiàng)系數(shù)是負(fù)的，可以知道方程所對(duì)應(yīng)的是開口向下的拋物面，所以最高點(diǎn)即為極大值點(diǎn)，能夠進(jìn)行優(yōu)化分析。回歸方程中一次項(xiàng)系數(shù)的大小比較之后得出結(jié)論，上述試驗(yàn)中影響黑果枸杞中花色苷提取效果因素的重要程度順序?yàn)椋篋（提取溫度）＞B（乙醇濃度）＞A（提取時(shí)間）＞C（液料比）。

為進(jìn)一步對(duì)得到的回歸方程進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，使用Design-Expert 8.0軟件對(duì)其進(jìn)行方差分析[19-20]，見表3。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由方差分析可知，模型（p＜0.0001）是有意義的：失擬項(xiàng)（p=0.4840＞0.05）不顯著，表明模型和實(shí)際情況擬合較好：矯正R2=0.9511表明該模型能夠說明95.11%響應(yīng)值的變化。一次項(xiàng)B、D顯著，A、C不顯著，AD交互項(xiàng)影響顯著，其他交互項(xiàng)不顯著，二次項(xiàng) A2、B2、C2、D2影響極其顯著。圖6為回歸模型中提取溫度—提取時(shí)間的交互作用的響應(yīng)曲面圖，其他交互項(xiàng)類似，但影響不顯著。

圖6 提取溫度與提取時(shí)間對(duì)花色苷含量的交互作用Fig.6 Effect of interaction between extraction time and extraction temperature on the anthocyanin content

2.3 最佳提取工藝的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證

應(yīng)用Design-Expert 8.0求解經(jīng)過優(yōu)化的回歸方程，在試驗(yàn)范圍內(nèi)可以得出，當(dāng)加酶量為0.10%時(shí)，提取花色苷的最佳條件：提取時(shí)間1.047 h，乙醇濃度80.55%，液料比 20.72∶1（mL/g），提取溫度 49.22 ℃，此條件下理論值可達(dá)到24.7115 mg/g。考慮到實(shí)際試驗(yàn)條件的精度，將其校正為：提取時(shí)間1.05 h，乙醇濃度80%，液料比 21∶1（mL/g），提取溫度 49 ℃，在此條件下進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，提取得到的花色苷含量為（24.675±0.027）mg/g，結(jié)果與預(yù)測(cè)值基本相符，證明了該模型的有效性。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)對(duì)果膠酶輔助乙醇提取黑果枸杞中花色苷進(jìn)行了單因素試驗(yàn)，各因素對(duì)花色苷提取效果的影響依次為：提取溫度＞乙醇濃度＞提取時(shí)間＞液料比；并進(jìn)一步優(yōu)化出最佳工藝條件，在加酶量為0.10%條件下，提取時(shí)間1.05 h，乙醇濃度 80%，液料比 21∶1（mL/g），提取溫度49℃時(shí)提取得到黑果枸杞花色苷含量為（24.675 ±0.027）mg/g。

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