劉 潔, 王寶亮, 錢仁義

河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦病科(鄭州450000)

腦梗死發(fā)病率、致殘率高，我國每年約有160萬人死于此病。雖然現(xiàn)已確立了超早期溶栓治療的有效性，但國際上的溶栓治療時(shí)間窗嚴(yán)格限制在3～4.5 h內(nèi)[1]。電針即將電刺激與傳統(tǒng)中醫(yī)的針灸相結(jié)合，被廣泛應(yīng)用于腦卒中臨床及其機(jī)制研究動(dòng)物模型中。研究表明，電針能有效減少腦水腫的形成及腦梗死的面積，并能改善腦血流的分布及對(duì)大腦有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用[2]。PI3K/AKT信號(hào)通路是膜受體信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑，同時(shí)大量實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中參與細(xì)胞增殖、分化、代謝等生物學(xué)活動(dòng)[3-4]。因此本研究通過建立MCAO模型給予不同介入時(shí)間的電針治療來闡明腦梗死后電針治療最佳時(shí)間窗及其可能機(jī)制。

材料與方法

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康的SPF級(jí)Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠126只，由我院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，大鼠年齡大概在8周至10周，體重在250～280 g范圍內(nèi)，自由取食，2只大鼠共住一籠，在無菌的層流通風(fēng)的動(dòng)物飼養(yǎng)房中飼養(yǎng)，合格證號(hào)：SCXK(湘)2015-0004。實(shí)驗(yàn)操作部分在我院醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中心進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑：蘇木素染色劑 Sigma 公司；一抗，兔抗大鼠Anti-VEGF(血管內(nèi)皮因子抗體)，北京博奧森生物公司；二抗，羊抗兔IgG 抗血清，北京博奧森生物公司；即用型SABC 免疫組化試劑盒，武漢博士德生物公司；DAB染色試劑盒，南京凱基生物公司；其他免疫組化試劑,福州邁新生物公司；定量PCR試劑盒，Invitrogen Life Technologies公司；SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒，武漢谷歌生物技術(shù)有限公司；蛋白抽提試劑盒，武漢谷歌生物技術(shù)有限公司；Bradford 蛋白濃度測(cè)定試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所生產(chǎn)；超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒BeyoECL Plus 碧云天生物技術(shù)研究所生產(chǎn)；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方 法

2.1 動(dòng)物分組:SD 大鼠隨機(jī)分為為缺血組(CI)h 和假手術(shù)組(Sham)。缺血組參照Zea Longa[5]線栓法建立大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)腦缺血再灌注模型，假手術(shù)組僅暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈，不予阻斷血流。缺血組隨機(jī)分為模型組、模型干預(yù)組(1 h后開始電針組、6 h后開始電針組、12 h后開始電針組、24 h后開始電針組、48 h后開始電針組)。

2.2 建立大鼠MCAO模型:健康成年雄性 SD 大鼠，體重250～ 280g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后參照Zea-Longa 線栓法[15]制作右側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞模型(MCAO model)。

2.3 大鼠MCAO 模型神經(jīng)功能缺損評(píng)分:大鼠MCAO模型制作成功后，按Zea-Longa[6]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行大鼠腦缺血再灌注神經(jīng)功能缺損評(píng)分，評(píng)分于大鼠腦缺血1.5 h再灌注1 h后進(jìn)行。該標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)大鼠神經(jīng)損傷癥狀進(jìn)行評(píng)分，標(biāo)準(zhǔn)如下：0分：無神經(jīng)損傷癥狀；1分：不能完全伸展對(duì)側(cè)(患側(cè))前爪；2分：向?qū)?cè)(患側(cè))轉(zhuǎn)圈；3分：向?qū)?cè)(患側(cè))傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失；5分：動(dòng)物死亡。其中評(píng)分為1～3分且無蛛網(wǎng)膜下腔出血的大鼠納入實(shí)驗(yàn)，0分、4分和5分剔除，并隨機(jī)補(bǔ)充。

2.4 選穴與治療方法:穴位定位參照李忠仁《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[7]，“百會(huì)”穴位于頭部，前發(fā)際正在直上5 寸，或兩耳尖連線中點(diǎn)處；“水溝穴”位于面部，當(dāng)人中溝的上13 與中13 交點(diǎn)處；“曲池”穴位于肘橫紋外側(cè)端，屈肘，尺澤與肱骨外上髁連線中點(diǎn)；“足三里”穴位于小腿前外側(cè)，當(dāng)犢鼻下3 寸，距脛骨前緣一橫指(中指)。治療方案：假手術(shù)組、模型組不予任何治療處理，其余治療組分別于缺血再灌注后1 h、6 h、12 h、24 h、48 h 開始行電針治療，均1d1次，每次持續(xù)30 min，連續(xù)5 d。用32#1 寸針灸針，直刺以上四個(gè)穴位，深度約7 mm，快速捻轉(zhuǎn)至針下沉澀感后，接韓式穴位神經(jīng)刺激儀(HANS-200，南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司)，等幅疏密波，頻率為2/100 Hz，電流強(qiáng)度2mA，以動(dòng)物肢體微顫為度。具體操作方法: 兩人配合操作，一人用手抓取SD 大鼠以固定，另一人做提插操作手法。模型組和假手術(shù)組的SD 大鼠與其他各個(gè)電針組在相應(yīng)時(shí)間段內(nèi)，施以同等條件抓取，但不實(shí)施任何針刺干預(yù)。

2.5 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)：所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在構(gòu)建MACO 模型成功治療5 d后再次行神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分，隨后快速斷頭取腦，行TTC 染色觀察腦梗死體積，取海馬及紋狀體組織分別行免疫組化染色檢測(cè)Bax、Bcl-2 的表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)PI3K1、AKT 基因含量和表達(dá)情況，具體實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。數(shù)值變量以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，分類變量以范圍和中位數(shù)(Range，Median)表示；數(shù)值變量方差齊性資料采用單因素方差分析(兩兩比較采用SNK 檢驗(yàn))，方差非齊性資料采用秩和檢驗(yàn)；分類變量進(jìn)行卡方檢驗(yàn)；均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 電針對(duì)MCAO 模型大鼠神經(jīng)功能缺損的影響 見表1。假手術(shù)組評(píng)分為0，未見腦缺血再灌注神經(jīng)功能損壞表現(xiàn)。MCAO模型組神經(jīng)功能評(píng)分明顯高于假手術(shù)組，說明局部腦組織缺血后造成了明顯的神經(jīng)功能障礙。腦缺血1.5 h 再灌注后6 h 和12 h組電針處理后，神經(jīng)功能評(píng)分明顯低于MCAO組(P<0.05)，提示電針治療能夠改善局灶性缺血再灌注損傷后的神經(jīng)功能。而1 h、24 h、48 h 電針治療組動(dòng)物神經(jīng)功能缺損評(píng)分與MCAO 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示過早或過晚進(jìn)行電針治療干預(yù)均不能改善局灶性腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)功能。

2 各組大鼠腦梗死體積比較 見表1。與MCAO 組相比，6 h、12 h 電針治療組右側(cè)腦梗死體積比明顯減小(P<0.05)，1 h、24 h、48 h 電針治療組右側(cè)腦梗死體積比改變差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 不同時(shí)間電針治療對(duì)大鼠MCAO 模型神經(jīng)功能缺損及腦梗死體積百分比的影響

注：與假手術(shù)組組相比，#P<0.05；與MCAO相比，*P<0.05

3 大鼠紋狀體區(qū)域Bax、Bcl-2 的蛋白表達(dá) 如圖1，圖2所示，大鼠紋狀體區(qū)域假手術(shù)組(Sham 組)bcl-2、bax 表達(dá)陰性，各組非缺血側(cè)未見明顯染色。如表2所示，與假手術(shù)組(Sham 組)比較，MCAO 組紋狀體組織Bax 的表達(dá)明顯升高(P<0.01)。與MCAO 組比較，6 h 電針治療組紋狀體組織Bax 表達(dá)顯著降低(P<0.01)，1 h 電針治療組、12 h 電針治療組、24 h 電針治療組、48 h 電針治療組紋狀體組織Bax 表達(dá)與MCAO 組比較明顯降低(P<0.05)。與假手術(shù)組(Sham 組)比較，MCAO 組紋狀體區(qū)域Bcl-2 表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與MCAO 組比較，6 h 電針治療組紋狀體區(qū)域Bcl-2 表達(dá)顯著降低(P<0.01)，1 h 電針治療組、12 h 電針治療組、24 h 電針治療組、48 h 電針治療組紋狀體區(qū)域Bcl-2 表達(dá)與MCAO 組比較明顯降低(P<0.05)。

表2 大鼠紋狀體區(qū)域Bax、Bcl-2的OD值

注：與假手術(shù)組組相比，#P<0.05；與MCAO相比，*P<0.05

4 針刺對(duì)MCAO 模型大鼠腦組織AKT-1、PI3K 的影響 見表3。

表3 不同介入時(shí)間電針治療對(duì)紋狀體AKT-1/PI3KmRNA 相對(duì)表達(dá)量的影響

注：與假手術(shù)組組相比，#P<0.05；與MCAO相比，*P<0.05

圖1 紋狀體區(qū)域Bax 的表達(dá)(免疫組化染色×400)

圖2 紋狀體區(qū)域Bcl-2 的表達(dá)(免疫組化染色×400)

MCAO 模型紋狀體組織AKT-1 mRNA表達(dá)與假手術(shù)組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與MCAO 組比較，6 h 電針治療組AKT-1mRNA 表達(dá)顯著增加(P<0.01)；1 h 電針治療組、12 h 電針治療組、24 h 電針治療組、48 h 電針治療組mRNA 表達(dá)明顯增加(P<0.05)(表3)。假手術(shù)組腦組織中少量PI3K mRNA 表達(dá)； MCAO 模型紋狀體組織PI3K mRNA 表達(dá)與假手術(shù)組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與MCAO 組比較，1 h 電針治療組、6 h電針治療組AKT-1 mRNA 表達(dá)明顯增加(P<0.05)；12 h 電針治療組、24 h 電針治療組、48 h 電針治療組mRNA 表達(dá)無明顯增加(P>0.05)。

討 論

目前作為將傳統(tǒng)的針灸治療與現(xiàn)代的電極刺激結(jié)合的產(chǎn)物，電針可通過肌肉組織和神經(jīng)組織的電刺激達(dá)到治療腦梗塞的目的以及提高腦梗塞患者的生活質(zhì)量[8]。在亞洲國家中，針灸已經(jīng)被廣泛應(yīng)用在神經(jīng)系統(tǒng)疾病當(dāng)中，而針灸因?yàn)槠涮厥獾寞熜б呀?jīng)越來越被西方國家所重視。盡管針灸在臨床應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)還待有效的數(shù)據(jù)進(jìn)一步來證明，但在過去的十年期間人們?cè)卺樉牡呐R床應(yīng)用中所積累的各種評(píng)價(jià)和現(xiàn)有的數(shù)據(jù)的表明：其在一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，如面神經(jīng)炎、脊髓損傷、三叉神經(jīng)痛的治療效果是顯著的。這些針灸治療的臨床研究可以通過PubMed和個(gè)人文件中檢索獲得，并通過美國預(yù)防服務(wù)工作組對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)總結(jié)[9]，而對(duì)于電針治療腦梗塞的臨床療效已經(jīng)得到了很多學(xué)者的認(rèn)可，電針刺激百會(huì)穴可以有效地降低腦卒中后的腦萎縮的發(fā)生率[10]。電針可以使大腦的局部血流增加[11]。而且大量臨床循證醫(yī)學(xué)支持急性期的治療優(yōu)于恢復(fù)期和后遺癥期[12]，但有些學(xué)者認(rèn)為并非越早給予治療就越好[13]。所以我們推測(cè)可能存在一個(gè)腦梗塞的最佳治療時(shí)間窗，而這個(gè)時(shí)間窗尚需我們進(jìn)一步探索。

Bcl-2蛋白家族主要參與細(xì)胞的內(nèi)源性凋亡途徑完成對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞淋巴瘤/白血病基因-2(Bcl-2)基因家族在神經(jīng)元死亡中起著重要的作用，主要通過調(diào)節(jié)線粒體外細(xì)胞膜的通透性，來參與神經(jīng)元的內(nèi)在細(xì)胞凋亡途徑[14]，Bcl-2基因家族主要由促進(jìn)細(xì)胞凋亡蛋白(包括BaK，Bax等)、抗細(xì)胞凋亡蛋白(包括Bcl-2，Bcl-xl和Bcl-w等)、和BH3-only蛋白(包括Bid、Bak、Puma等)組成。目前研究證實(shí)的抑制凋亡基因有Bcl-2、Bcl-xl等，而促進(jìn)凋亡基因的有Bax、Bak等。

磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)家族參與了細(xì)胞的凋亡以及存活等主要功能，其能通過活化產(chǎn)生的第二信使—3,4-二磷酸磷脂酰肌醇[PI(3,4)P2]和3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇[PI(3,4,5)P3]，進(jìn)而進(jìn)一步的活化。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，PI3K分為I、II及III型，其中I型可以通過結(jié)合酪氨酸激酶連接受體和G蛋白連接受體，進(jìn)而傳遞下游信號(hào)，在外部刺激的作用下，產(chǎn)生第二信使磷脂酰肌醇3,4,5三磷酸(PIP3)，PIP3與細(xì)胞內(nèi)的的信號(hào)蛋白Akt和PDK1結(jié)合，進(jìn)而使Akt被PDK1磷酸化而活化。正常情況下，PI3K/AKT信號(hào)通路在誘導(dǎo)凋亡的過程中，主要的功能是磷酸化下游蛋白而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞存活，這種作用大于誘導(dǎo)凋亡的作用，甚至可以通過某些途徑實(shí)現(xiàn)抑制凋亡誘導(dǎo)蛋白的作用[15]。

本文通過研究不同介入時(shí)間的電針治療對(duì)大鼠MCAO模型局灶性腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用，探索電針治療的最佳介入治療時(shí)間窗，以及探索其發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的可能機(jī)制。本研究結(jié)果提示電針可增強(qiáng)AKT-1和PI3K的表達(dá)，從而激活PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路信號(hào)通路，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。因此，本研究選擇了PI3K和AKT-1作為凋亡指標(biāo)，通過研究我們發(fā)現(xiàn)再灌注后6 h進(jìn)行電針治療對(duì)腦缺血再灌注損傷治療的效果比較好。結(jié)果提示電針可增強(qiáng)AKT-1和PI3K的表達(dá)，從而激活PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路信號(hào)通路，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。上述結(jié)果均進(jìn)一步證實(shí)大鼠MCAO模型局灶腦缺血再灌注后6 h是電針治療的較好時(shí)機(jī)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示，電針治療能夠很好的改善大鼠腦缺血再灌注損傷，缺血1.5h后再灌注后6h是電針介入治療的較好時(shí)機(jī)。電針治療可以增強(qiáng)Bcl-2、AKT-1和PI3K的表達(dá)，降低Bax的表達(dá)，來抑制細(xì)胞凋亡并激活PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路信號(hào)通路，而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

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