趙亞麗,王 聰

河南省職工醫(yī)院婦產(chǎn)科(鄭州 450000)

宮頸癌為女性生殖器官的三大癌癥之一，也是婦科上一種十分常見的惡性腫瘤。宮頸部發(fā)生上皮內(nèi)瘤變后逐漸進展而侵襲至上皮的下基膜間質(zhì)最終形成宮頸癌[1-2]。宮頸的轉(zhuǎn)化區(qū)域上皮化生活動度過高，并且受到癌細胞激活因素的刺激亦可形成本病[3]。宮頸癌的發(fā)生多與患者的早婚、分娩次數(shù)、性生活習慣、高危型的HPV病毒感染等因素相關(guān)。本病及早期少數(shù)患者可見有陰道內(nèi)接觸性出血、陰道分泌物異常等表現(xiàn)，但多數(shù)患者并無明顯的臨床表現(xiàn)，至晚期時方發(fā)生陰道不規(guī)則出血及因癌組織浸潤其他組織器官而發(fā)生的繼發(fā)癥狀。近些年來，我國宮頸癌的發(fā)生率呈現(xiàn)出上升趨勢，發(fā)病年齡表現(xiàn)出年輕化的趨勢[4-6]?？鄥⒌闹饕行С煞挚鄥A具有降低腫瘤細胞凋亡抑制因子表達，升高腫瘤細胞凋亡因子表達的明確作用，能夠促使癌細胞的凋亡，抑制惡性腫瘤細胞的增殖與生長。為了明確以苦參為主的自擬中藥方劑苦參消癥湯對于宮頸癌的治療作用，本院開展本次動物模型研究，以為本院自擬苦參消癥湯的臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)參考。

材料與方法

1 實驗材料 自中國科學院上海動物中心購進Wistar雌性大鼠60只，年齡6周，體重為141～159 g。自中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)研究所購進人宮頸癌Hela細胞株；自Cell Signalling Technology公司購進兔抗人Caspase-3抗體、兔抗人Caspase-7、兔抗人Survivin抗體，DAB顯色劑；自同仁堂中藥飲片公司購進自擬苦參消癥湯藥物，方劑組成為：苦參、生黃芪各30 g，赤芍24 g，七葉一枝花、白花蛇舌草、蒲公英、紫花地丁、野菊花、山萸肉各15 g，豬苓12 g，乳香、沒藥、澤瀉、炙甘草各10 g。

2 宮頸癌動物模型建立 于無菌條件下，將人宮頸癌Hela細胞株放入培養(yǎng)皿中，于培養(yǎng)皿中加入由10%胎牛血清與2%谷氨酰胺配制的RPMI-1640培養(yǎng)液當中；置于37 ℃、5%體積分數(shù)的CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h，以體積分數(shù)10%的小牛血清、0.25%的胰酶消化細胞培養(yǎng)基終止；按1200r/min速度離心10 min，后洗滌，將細胞計數(shù)調(diào)整為107/ml，取得人宮頸癌Hela細胞的懸液0.5 ml，于大鼠的腋窩處皮下注射；常規(guī)飼養(yǎng)7 d后，可見腫瘤結(jié)節(jié)為宮頸癌動物模型造模成功。

3 分組與治療方法 購買的60只大鼠隨機選取10只納入空白組，其余50只大鼠建立宮頸癌模型；建模成功的共計47只，死亡1只，自建模成功的46只大鼠中選取30只隨機均分后，分別納入模型組、陽性對照組以及觀察組，每組均為10只?？瞻捉M持續(xù)常規(guī)喂養(yǎng)，自由食水；模型組造模后不予任何治療與空白組相同方法喂養(yǎng)；觀察組給予自擬苦參消癥湯治療，將上述苦參消癥湯方劑以500 ml水煎至200 ml，給藥劑量按人鼠比20∶1，40 ml/d灌胃；陽性對照組給予安慰劑純凈水，劑量與觀察組相同灌胃；各組均維持8周。

4 觀察方法 治療8周后處死各組大鼠，觀察除空白組以外各組大鼠宮頸癌病灶的大小。測定空白組皮下組織及建模各組癌組織中的Caspase-3、Caspase-7、Survivin表達水平，宮頸癌動物模型各組均取癌組織50 mg，空白組取腋窩皮下組織50 mg；將取得的組織以PBS緩沖液充分洗滌，之后進行研磨及離心收集，以冰冷 PBS液洗滌細胞3次，滴加裂解緩沖液，充分混勻，于4 ℃的水中水浴30 min后，按1200r/min的速度離心10 min，取得胞質(zhì)蛋白上清液。以BCA法測定胞質(zhì)蛋白含量。將上述胞質(zhì)蛋白液定溶為30～40 μg，以SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜。使用PBST洗膜5 min，以PBST溶解并封閉PVDF膜2 h。滴加1∶1000比例稀釋后的兔抗人Caspase-3抗體、兔抗人Caspase-7抗體、兔抗人 Survivin抗體，于4 ℃環(huán)境中靜置12 h。以PBST洗滌10 min/次，共3次；加入二抗，置于溫室中孵育2 h，再以PBST洗滌10 min/次，共3次。PVDF膜以ECL顯色，于暗室中行PVDF的X線曝光，以凝膠成像系統(tǒng)分析讀取結(jié)果。分析癌癥病灶體積與Caspase-3、Caspase-7、Survivin表達水平間的相關(guān)性。

5 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件分析本次研究數(shù)據(jù)，各組間數(shù)據(jù)差異性以單因素ANOVA分析，進一步兩兩對比采用LSD-L分析，相關(guān)性分析采取Pearson相關(guān)性分析；校驗水平均為α=0.05，差異有統(tǒng)計學意義標準均為P<0.05；具有統(tǒng)計學相關(guān)性標準為|r|>0.3，低度相關(guān)性為0.3≤|r|<0.5，中度相關(guān)性為0.5≤|r|<0.8，高度相關(guān)性為|r|≥0.8。

結(jié) 果

1 宮頸癌病灶體積 見表1。各組間宮頸癌病灶體積對比具有差異性(P<0.05)；進一步兩兩對比模型組與陽性對照組宮頸癌病灶體積無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；觀察組與模型組、陽性對照組間對比均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

表1 四組癌病灶體積對比

注：與模型組對比，☆P<0.05;與陽性對照組對比,★P<0.05

2 Caspase-3、Caspase-7、Survivin表達水平 見表2。各組間癌組織中Caspase-3、Caspase-7、Survivin表達水平具有差異性(P<0.05)；進一步兩兩分析，空白組與各組間均具有差異性、觀察組與各組間均具有差異性(P<0.05)，模型組與陽性對照組間無差異性(P>0.05)。

表2 各組

注：與空白組對比,◆P<0.05;與模型組對比,☆P<0.05;與陽性對照組對比,★P<0.05

3 相關(guān)性分析 見表3。宮頸癌腫瘤病灶體積與Caspase-3、Caspase-7間均具有高度負相關(guān)性，與Survivin間均具有高度正相關(guān)性(|r|>0.8，P<0.05)。

表3 癌腫體積與Caspase-3、Caspase-7、Survivin相關(guān)性分析統(tǒng)計值

討 論

宮頸癌是威脅女性身體與生命安全的一項常見惡性腫瘤，宮頸癌是由宮頸的上皮內(nèi)瘤變發(fā)展形成的生殖系統(tǒng)癌性病變[7-9]。本病早期行手術(shù)治療可獲得理想的療效，但仍可對患者預(yù)后生活造成一定程度的影響。病情發(fā)展至晚期時則喪失手術(shù)治療時機。隨著新輔助化療的推廣為中晚期宮頸癌患者提供新的治療手段，化療藥物直接作用于瘤體可取得較好療效[10-11]。宮頸癌的形成與演進與腫瘤細胞的異常增殖、凋亡減少具有直接關(guān)系。凋亡細胞主要作用是誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，促使新細胞形成取代凋亡的細胞，使細胞的凋亡與增殖維持在相對平衡狀態(tài)下。如凋亡細胞有所減少，和(或)凋亡抑制因子的表達異常，則使這種相對平衡的關(guān)系被破壞，導(dǎo)致腫瘤出現(xiàn)大量無限制異常增殖與生長，隨著時間的延長腫瘤病灶逐漸擴大，并向外、向縱深浸潤，累及周圍組織或器官，侵襲至淋巴組織后逐漸向遠端擴散。由這一發(fā)展過程可知，下調(diào)癌腫組織當中凋亡抑制因子的水平并升高促進凋亡因子的水平，是恢復(fù)凋亡、增殖平衡機制的最直接手段。

Survivin是目前已知最強效的抑制凋亡因子?？梢种颇[瘤細胞的凋亡，激活因子酶原的活性而發(fā)揮抑制癌腫細胞凋亡的作用。健康人體中Survivin幾乎不表達，但在惡性腫瘤組織中可見異常高表達。在宮頸上皮內(nèi)瘤變組織中Survivin可見中度表達，而宮頸癌組織當中Survivin則出現(xiàn)顯著高表達。因此Survivin可作為宮頸癌及其他惡性腫瘤診斷及評估的重要指標。Caspase-3與Caspase-7均為促進細胞凋亡因子Caspase系列的組成部分，能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡[12-14]。人體中的多數(shù)細胞凋亡過程均依賴于凋亡因子的誘導(dǎo)，凋亡促進因子的表達被抑制時，其活性減低抑制作用下降，導(dǎo)致腫瘤細胞的凋亡大幅下降，增殖與凋亡間的平衡機制紊亂，致使癌腫形成。Survivin下降，Caspase-3與Caspase-7上升時，可使惡性腫瘤細胞的異常過度增殖被完全或部分阻斷，從而使癌腫瘤病灶停止或延緩生長，因此具有控制甚至是縮小癌腫體積的作用。

中醫(yī)理論認為腫瘤屬于“癥瘕痞塊”，宮頸癌屬于“帶下”病范疇。中醫(yī)認為本病的治療應(yīng)以清熱解毒、消瘕化癥、軟堅散瘀為原則?？鄥⑹侵嗅t(yī)治療宮頸癌的常用藥物，近些年來苦參提取物亦多應(yīng)用于宮頸癌化療輔助治療當中[15]。本院根據(jù)中醫(yī)治療原則結(jié)果臨床治療經(jīng)驗擬定出苦參消癥湯治療本病。方中苦參含有的苦參總堿有顯著的升高白細胞作用，苦參對多種細菌有較強的抑制作用，苦參具有抗腫瘤作用。生黃芪可補益衛(wèi)氣、固表止汗，具有利水消腫、托瘡生肌的功效；七葉一枝花有抗癌敗毒，治療癰疽、無名腫毒之功效且療效顯著。白花蛇舌草性寒而味甘，清涼而解熱，任何癌腫均可選其入藥治療。赤芍藥性微寒、味苦，歸肝經(jīng)；有活血祛瘀、清除敗血、溶解血栓、清熱涼血之功效。蒲公英具有消癰散結(jié)、清熱解毒、涼血消炎之功效、可治療惡瘡、癰腫疔毒等癥。地丁主要功效為清熱涼血、瀉熱解毒，其主要特點是不傷脾胃。野菊花性微寒、味苦、辛，歸肝、肺經(jīng)；具有清熱解毒之效，可用于疔毒、癰腫。澤瀉泄熱濁、滲濕、利腐水，可治療水腫脹滿、小便不利。豬苓性平淡、味甘，功效為利水滲濕，主治由濕氣下注、郁遏下焦、膀胱氣化失司引起的肌膚浮腫、排尿困難。乳香、沒藥具有理氣活血,止痛去痛,殺毒追毒功效，主治氣血痹阻、癰腫瘡毒、瘀血刺痛。山萸肉藥性微溫、味澀，歸肝、腎經(jīng)；其功效為補肝益腎、澀精止帶、固脫止崩、止渴生津、收斂止汗，另外山萸肉有抗菌抑菌功效，通過其扶正氣作用來補益機體的諸多不足。炙甘草培補中氣、調(diào)和諸藥；現(xiàn)代藥理學認為甘草有類激素作用和抗應(yīng)激作用。

本次研究結(jié)果表明，觀察組癌腫體積小于模型組與陽性對照組，證明了苦參消癥湯具有抑制和(或)縮小癌種體積的明確作用。觀察組Caspase-3、Caspase-7低于空白組，但高于模型組與陽性對照組；觀察組Survivin高于空白組，但低于模型組與陽性對照組；而模型組與陽性對照組間并無差異。說明安慰劑對于宮頸癌組織中Caspase-3、Caspase-7、Survivin并無干預(yù)作用，但苦參消癥湯則可明確升高Caspase-3、Caspase-7表達，降低Survivin，對于恢復(fù)細胞增殖、凋亡的平衡具有明確作用。但8周灌胃后，觀察組Caspase-3、Caspase-7、Survivin與空白組仍有差異，提示本方在8周內(nèi)無法達到完全治愈宮頸癌的治療效果。同時通過相關(guān)性可知，Caspase-3、Caspase-7、Survivin與宮頸癌腫瘤體積具有明確的相關(guān)性，隨著癌腫體積的增大Caspase-3、Caspase-7在癌腫組織中的表達水平明顯下降，而Survivin的表達水平顯著上升。

綜上所述，本院自擬苦參消癥湯對于宮頸癌大鼠模型具有明確縮小或抑制癌腫生長的作用，能夠明確的下調(diào)Survivin在癌組織中的表達，上調(diào)Caspase-3、Caspase-7的表達，促進細胞增殖與凋亡機制的恢復(fù)，對于宮頸癌具有明確治療作用，但短期內(nèi)無法達到臨床治愈的療效。

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