海小亮

摘 要：為了研究有機(jī)硒飼料對斷奶羔羊十二指腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)及血清GSH-Px活性的影響，選擇體重、生理狀態(tài)相近及健康的本地斷奶羔羊18只作為試驗動物，隨機(jī)分為2組，試驗羊均編號，每組9只，一組在基礎(chǔ)日糧中按體重添加0.3mg/kg有機(jī)硒，另一組添加0.3mg/kg無機(jī)硒。預(yù)飼期10天，正試期飼喂60d左右。飼喂試驗結(jié)束后將綿羊屠宰，取十二指腸接近幽門部位的組織樣，采用常規(guī)的石蠟切片HE染色方法制作切片，通過顯微測微尺的方法測定斷奶羔羊絨毛高度、隱窩深度；并采集飼喂試驗前后羊血，應(yīng)用谷胱甘肽過氧化物酶試劑盒測定羊血清谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性。結(jié)果表明，有機(jī)硒組斷奶羔羊的十二指腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度比值均為顯著高于無機(jī)硒組斷奶羔羊（P<0.05），有機(jī)硒組斷奶羔羊隱窩深度稍低于于無機(jī)硒組斷奶羔羊，但差異不顯著（p>0.05）。飼喂硒添加飼料后，有機(jī)硒組斷奶羔羊血清GSH-Px活性較無機(jī)硒組變化顯著（p<0.01）。結(jié)論：日糧中添加有機(jī)硒飼料可以促進(jìn)斷奶羔羊小腸的發(fā)育，可以提高斷奶羔羊血清抗氧化酶活性。

關(guān)鍵詞：有機(jī)硒；斷奶羔羊；絨毛高度；隱窩深度；GSH-Px活性

硒作為動物體的必需微量元素，被廣泛用于畜禽企業(yè)，主要也用來防止動物缺硒而產(chǎn)生的問題，以及對維持動物正常的生長發(fā)育和黏膜兔疫功能有重要的作用。同時，硒是一種抗氧化作用的元素，具有保護(hù)細(xì)胞膜的完整性的作用。硒作為動物體的必需微量元素，主要在動物的小腸位置吸收，有人研究過硒可以直接參與免疫功能，在黏膜免疫上有促進(jìn)的作用，也有研究者利用小鼠進(jìn)行胃腸外加硒試驗，說明了硒在動物營養(yǎng)上對小腸結(jié)構(gòu)有維護(hù)的功能。然而，硒在斷奶羔羊的腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)上會不會有明顯作用，目前缺乏相關(guān)的報道，不過有研究顯示有機(jī)硒的作用比無機(jī)硒對動物有利。本試驗通過給斷奶羔羊添加有機(jī)硒和無機(jī)硒，觀察斷奶羔羊十二指腸形態(tài)結(jié)構(gòu)和血液抗氧化酶活性是否有變化，為有機(jī)硒在斷奶羔羊飼料中的添加等提供理論依據(jù)。

一、 材料與方法

1.試驗材料

（1）試驗動物。體重、生理狀態(tài)相近及健康的本地斷奶羔羊18只，來源于同心縣德瑞牧業(yè)有限公司。

（2）飼喂飼料。

有機(jī)硒添加：基礎(chǔ)日糧中添加由寧夏農(nóng)科院配制成的酵母硒。

無機(jī)硒添加：在基礎(chǔ)日糧中添加亞硒酸鈉（Na2SeO3）。

（3） 主要試劑及儀器。乙醇、甲醛、二甲苯、石蠟、中性樹膠（產(chǎn)品批號：20160525；生產(chǎn)廠家：上海華申康復(fù)器材有限公司）、蘇木精（產(chǎn)品批號：20160915；生產(chǎn)廠家：上海中秦化學(xué)試劑有限公司）、伊紅（產(chǎn)品批號：20161015；生產(chǎn)廠家：天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司）、GSH-Px試劑盒（南京建成生物工程研究所）等。石蠟切片機(jī)（型號：QP-3268；廠家；武漢器械有限公司）或冰凍切片機(jī)、恒溫蠟箱（型號：DGG-9076AD；廠家：德州市昊誠實驗儀器有限公司）、熔蠟缸、電熱恒溫水浴鍋（型號：單孔DK-98-II；廠家：上海析域儀器設(shè)備有限公司）、顯微鏡（型號：RW-200116DIC；廠家：產(chǎn)于日本）、紫光分光光度計（上海）、離心機(jī)等。載玻片、蓋玻片等實驗室消耗品，刀、剪等解剖器械。

2.試驗方法

（1）試驗動物分組。將選好的18只斷奶羔羊，隨機(jī)分為2組，一組飼喂日糧中按體重添加0.3mg/kg酵母硒，另一組飼喂日糧中按體重添加0.3mg/kg亞硒酸鈉，試驗羊只均編號入舍，分槽飼養(yǎng)。

（2） 飼養(yǎng)管理。試驗羊只進(jìn)入圈舍前7天，用0.2%新潔爾滅溶液將舍內(nèi)地面、門窗、墻壁、水料槽進(jìn)行徹底消毒。預(yù)飼期前對試驗羊進(jìn)行驅(qū)蟲、健胃及防疫。用抗蠕敏進(jìn)行體內(nèi)驅(qū)蟲3天；之后口服大黃蘇打片進(jìn)行健胃，連服3天。試驗羊只每天分兩次飼喂（早6：30、晚17：30），自由飲水。預(yù)飼期10天，正試期2個月，觀察羊的活動、精神及健康狀況等，并從正試期起開始記錄每天給料量和采食量。

（3）樣品采集。

①血液樣品采集。在試驗第1d和60d在早晨，進(jìn)行靜脈采血，收集血液，分離血清，至于-20℃低溫冰箱里凍存?zhèn)溆谩?/p>

②組織樣品采集。飼喂結(jié)束后將斷奶羔羊行屠宰（屠宰前禁食12小時），屠宰后立即打開腹腔，迅速采集十二指腸接近幽門部組織樣品，放入10%中性福爾馬林固定液中固定。

（4） 石蠟切片制作及HE染色。利用組織學(xué)常規(guī)的石蠟切片HE染色的方法進(jìn)行操作。其制作過程主要包括：取材→固定→脫水→透明→浸蠟→包埋→切片→貼片→染色→透明→封片等。首先，對采取的組織樣進(jìn)行編號，并修整組織塊大小為1cm。將組織塊放入流水中沖洗12小時；再用由低到高濃度梯度酒精進(jìn)行脫水；在配制比例為1：1的無水乙醇與二甲苯進(jìn)行透明，再次經(jīng)過二甲苯透明組織樣，時間根據(jù)組織塊大小而定，總時間不宜超過2小時；然后，進(jìn)入浸蠟和包埋階段。根據(jù)石蠟的熔點（50～65℃），將蠟融化依次與二甲苯不同比例混合及純石蠟，將經(jīng)過透明的組織塊置于恒溫條件下，按以上配制的石蠟液進(jìn)行浸蠟，一般每次所需時間30分鐘左右。包埋中，先準(zhǔn)備好紙盒、包埋框或底模，將熔蠟倒入紙盒、包埋框或底模中，迅速用欲溫的鑷子夾取組織塊平放在紙盒、包埋框或底模底部，擺好位置，蓋好包埋盒，并使其迅速冷卻凝固。最后，進(jìn)行組織蠟塊的切片和貼片。調(diào)節(jié)好切片機(jī)后，連續(xù)切片、間隔取片，切去約為5um的厚度。將切取好的切片放在欲溫的水面上展平后，用載玻片傾斜入水面撈取切片，而后，放在36℃溫箱內(nèi)烘干12小時左右。

石蠟切片HE染色步驟：脫蠟→復(fù)水→蘇木精染色→分色→水洗藍(lán)化→蒸餾水短洗→一伊紅染色→脫水→脫色（分色）→透明→封片。

（5） 顯微鏡下觀察及數(shù)據(jù)測定。光鏡下，詳細(xì)觀察和比較十二指腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化情況，每張切片選取5個區(qū)域的腸絨毛高度、隱窩深度。絨毛高度是從絨毛頂端到腸腺窩的距離進(jìn)行測量，隱窩深度是從隱窩處至隱窩底層，接近黏膜下層的距離進(jìn)行測定，此過程利用的工具為顯微測微尺。

（6）斷奶羔羊血清GSH-Px活性的測定。使用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒，采用二硫代硝基苯甲酸法（DTNA法）。測定方法參考說明書。最后，計算出其活性值。

（7）數(shù)據(jù)分析。應(yīng)用Excel軟件記錄試驗數(shù)據(jù)，用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計和方差分析，得出的實驗數(shù)據(jù)結(jié)果用平均數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)差（ S）表示，P表示顯著性。

二、結(jié)果與分析

試驗過程中兩組羊只的精神、健康狀況、生產(chǎn)性能良好。

低倍鏡下，十二指腸壁由內(nèi)向外分別為黏膜層、黏膜下層、肌層和漿膜四層結(jié)構(gòu)組成。黏膜面上有許多皺襞以及許多指狀突起即腸絨毛，它是由黏膜上皮和固有膜向腸腔面突起形成。黏膜固有層由疏松的結(jié)締組織構(gòu)成，含有大量小腸腺（腸隱窩）。黏膜下層內(nèi)的腺體稱為十二指腸腸腺。

高倍鏡下觀察腸絨毛，絨毛表明被覆有單層柱狀上皮。上皮細(xì)胞主要吸收細(xì)胞（柱狀細(xì)胞）和少量的杯狀細(xì)胞組成。吸收細(xì)胞外表面有紅色的刷狀緣。在絨毛中央，富含網(wǎng)狀纖維的結(jié)締組織固有層，一部分突進(jìn)絨毛的軸心，另一部分位于腸腺之間。

三、討論

1.關(guān)于樣品采集位置的決定

硒是一種非金屬量性元素，由Berzelius首次發(fā)現(xiàn)并命名，自從1957年Schware等人首次發(fā)現(xiàn)硒對動物其到有益的作用，并且證明人和動物體內(nèi)必需的微量元素。吳金學(xué)（2016）在談?wù)撐⒘吭匚c羊營養(yǎng)的關(guān)系中提到，動物對硒的吸收都在十二指腸中進(jìn)行，羊的瘤胃或真胃不進(jìn)行硒的吸收，吸收的硒，大部分進(jìn)入血液，隨血液循環(huán)到各組織，主要集中于腎、肝、胰和脾。故此，本實驗采集斷奶羔羊十二指腸組織進(jìn)行實驗研究。

2.關(guān)于硒對十二指腸結(jié)構(gòu)的影響

小腸的正常結(jié)構(gòu)的完整與功能的健全能夠充分消化和吸收營養(yǎng)物質(zhì)，特別是小腸的腸絨毛高度、隱窩深度、黏膜厚度及絨毛表面積是衡量小腸消化吸收功能的重要指標(biāo)[5，6]。李芳等（1996）指出硒可以促進(jìn)結(jié)腸黏膜損傷的恢復(fù)。林玉才（2010）通過研究得出硒缺乏能不同程度上降低雛雞腸道黏膜厚度、肌層厚度、絨毛長度和寬度、隱窩深度，而十二指腸降低明顯。路則慶（2014）結(jié)果指出斷奶仔豬日糧中添加Z0206富硒多糖可以改善腸道結(jié)構(gòu)、顯著提高了十二指腸絨毛高度和隱窩深度比值，十二指腸絨毛高度有所增加。相關(guān)研究表明[10，11]，腸道黏膜結(jié)構(gòu)的完整，能夠增強動物的消化吸收功能，對于絨毛高度與隱窩深度比值的下降，其黏膜受損，影響腸道消化吸收功能，對動物的生長發(fā)育不利。本實驗中，添加有機(jī)硒組的斷奶羔羊十二指腸絨毛形態(tài)結(jié)構(gòu)較無機(jī)硒組斷奶羔羊有明顯區(qū)別，其絨毛高度、結(jié)構(gòu)完整及排列整齊上均處于較好的結(jié)果。試驗不足之處是，沒有從硒水平角度進(jìn)行研究，不能說明硒含量與羊腸道之間的關(guān)系，但也有試驗指出，動物攝入硒過量引發(fā)硒中毒，這里有關(guān)斷奶羔羊在該日糧添加下有機(jī)硒的最適添加量還有待進(jìn)一步研究。

四、 結(jié)語

斷奶羔羊日糧添加有機(jī)硒，可顯著促進(jìn)小腸絨毛、隱窩等結(jié)構(gòu)的發(fā)育，提高斷奶羔羊的消化吸收機(jī)能，而且有機(jī)硒對斷奶羔羊血清谷胱甘肽過氧化物酶活性的增強效果比無機(jī)硒的明顯。有機(jī)硒可以作為羊生產(chǎn)中的首選添加劑，對預(yù)防缺硒病是很有必要的，對動物自身健康的發(fā)展和硒在畜牧養(yǎng)殖業(yè)上的應(yīng)用起到更有價值的作用。

參考文獻(xiàn)：

[1] 段得賢 . 家畜內(nèi)科學(xué) . 化京：農(nóng)業(yè)出版社，1981：327.

[2] 梁禮成，李慶懷，余久沂，等.硒時肉雞免疫功能的增強作用.北京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1993；19（2）；99-103.