劉 剛， 楊 妍， 胡婷婷， 鄧錢江， 張曉喻， 黎 霞

（四川師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610101）

高血脂癥是因體內(nèi)血脂代謝異常而引發(fā)的一種慢性疾病[1]，也是引起脂肪肝、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的主要原因之一[2]。臨床上常用于治療高血脂癥的藥物主要是他汀類藥物，長期服用該類藥物對(duì)人體有一定程度的毒副作用[3]。

青刺尖茶是薔薇科李亞科扁核木屬植物青刺尖Prinsepia utilisRoyIe的嫩莖葉，按照綠茶的工藝制成的代用茶[4]，該植物始載于《滇南本草》，具有多種功效[5]?，F(xiàn)代研究證明，青刺尖茶[6]與茯磚茶[7]均具有降低血脂的功效，茯磚茶的降血脂功效與其附生的優(yōu)勢(shì)菌—“金花菌”的發(fā)酵作用有密切的聯(lián)系。有研究表明，該菌產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等酶，在改善茶葉本身滋味[8]的同時(shí)，飲用此茶可以調(diào)節(jié)人體的脂質(zhì)代謝，維持血脂的平衡[9]。目前，“金花菌”發(fā)酵作用對(duì)青刺尖茶降血脂功效影響的研究，尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

將青刺尖茶經(jīng)過“金花菌”發(fā)酵后，制備為代用茶，不僅符合綠色健康理念，滿足當(dāng)今社會(huì)對(duì)食品多元化的要求，而且為青刺尖茶功能的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性昆明小鼠105只，體重18～22 g，合格證號(hào)SCXK（川）2013-24，成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司提供。

1.2 動(dòng)物飼料

普通飼料：成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司；高脂飼料[5]配方為：基礎(chǔ)飼料75%、蛋黃粉15%、豬油10%。

1.3 儀器與設(shè)備

TC6010L全自動(dòng)生化分析儀、TGL-20M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、Multlskan Mk3型酶標(biāo)儀、轉(zhuǎn)輪式切片機(jī) （徠卡-2016）、TSJ-Ⅱ型全自動(dòng)封閉式組織脫水機(jī)、BMJ-Ⅲ型包埋機(jī)、PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀、數(shù)碼三目攝像顯微鏡（BA400Digital）、圖像分析軟件Motic Images Advanced等。

1.4 實(shí)驗(yàn)試劑

青刺尖茶：產(chǎn)自四川鹽源縣左所鄉(xiāng)；茯磚茶：中茶湖南安化茶廠有限公司；血脂康粉：北京北大維信生物科技有限公司；Mouse Apo-A1 ELISA kit：貨號(hào) Rm1760XL；Mouse Apo-B ELISA kit： 貨 號(hào)Rm0743XL；Mouse LP-a ELISA kit： 貨 號(hào)Rm0742XL，規(guī)格96孔/盒，Abcam公司生產(chǎn)，北京永輝生物科技有限公司進(jìn)口分裝。

1.5 茶湯制備

取真空密封包裝的青刺尖茶500 g，置于1 500 mL三角瓶，按25%含水量加蒸餾水125 mL，在121℃下滅菌20 min。用平板法[10]從茯磚茶中分離純化獲得“金花菌”，取其濃度[11]為 1.0×107個(gè)/mL 的孢子懸液1.0 mL分別接入滅菌的青刺尖茶，放28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7d，然后將茶樣烘干，備用[12]。

稱取青刺尖茶樣75 g，以料液比1∶20加入1 500 mL蒸餾水[13]，90℃回流提取45 min，濾過液經(jīng)減壓濃縮并定容至500 mL，得質(zhì)量濃度0.15 g/mL的青刺尖茶樣茶湯。再按照灌胃劑量0.3 mL/20 g制備9.0、6.0、2.0 g/kg 的高、中、低劑量的發(fā)酵茶茶湯和9.0 g/kg干茶茶湯，備用。

1.6 小鼠高脂血癥模型的建立

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，105只小鼠稱質(zhì)量后隨機(jī)分成基礎(chǔ)飼料組和高脂飼料組，兩組間小鼠體重的差異不顯著。高脂飼料組的90只小鼠飼喂高脂飼料[14]，其余15只小鼠飼喂普通飼料。28 d后禁食不禁水 12 h，斷尾取血[15-16]，37℃恒溫水浴 1 h[17]，3 000 r/min離心15 min分離血清[18]，再測定血清中的膽固醇 TC、TG、HDL-C、LDL-C。

1.7 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

確定造模成功后，再將高脂血癥小鼠隨機(jī)分成6組：青刺尖“金花菌”發(fā)酵茶高劑量組（9.0 g/kg）、中劑量組（6.0 g/kg）、低劑量組（2.0 g/kg）、青刺尖干茶組（9.0 g/kg）、血脂康組（0.3 g/kg）與模型組，各組間無差異性。處理組連續(xù)給藥28 d，空白組和模型組給予等量的蒸餾水，每三天稱一次體重，調(diào)整劑量。末次給藥后禁食不禁水12 h，先稱質(zhì)量，再用戊巴比妥鈉麻醉，心臟取血，分離血清，測定方法同1.6。

1.8 測定方法

全自動(dòng)生化分析儀測定膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）；試劑盒測定載脂蛋白-AI（Apo-AI）、載脂蛋白-B（Apo-B）、脂蛋白 A（LP-a）。 取血后，剝離小鼠的肝臟，用生理鹽水洗去污血，再用濾紙吸干、稱質(zhì)量，計(jì)算肝臟指數(shù)[19]，肝臟指數(shù)=臟器質(zhì)量/小鼠質(zhì)量（g/g），然后，按病理檢驗(yàn)SOP程序進(jìn)行脫水、修剪、包埋、切片、HE染色、封片等，最后鏡檢。

1.9 統(tǒng)計(jì)與分析

用SPSS20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，組間比較用t檢驗(yàn)，多重比較用LSD法[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 高血脂模型小鼠的建立

小鼠經(jīng)3 d適應(yīng)性飼養(yǎng)，再用不同飼料處理28 d，普通飼料、高脂飼料對(duì)小鼠的影響見表1。

表1 飼料對(duì)小鼠血脂生化指標(biāo)和體重增長的影響Table 1 Effect of high-fat diet on blood lipid level in mice

從表1可看出：不同飼料處理28 d后，與普通飼料組比較，高脂飼料組小鼠的體重增長差異顯著（p＜0.05），同時(shí)，其 TC、TG、HDL-C、LDL-C 等生化指標(biāo)均升高，具有極顯著的差異性（p＜0.01），表明小鼠高血脂癥模型建立成功。

2.2 發(fā)酵茶對(duì)高血脂小鼠血脂的影響

在灌胃期間，各組小鼠均取食正常，毛潔白而具光澤，無排稀便現(xiàn)象。藥物灌胃28 d后，各組小鼠血脂生化指標(biāo)的影響見表2。

表2 發(fā)酵茶對(duì)高血脂癥小鼠血脂生化指標(biāo)的影響Table 2 Effects of Prinsepia utilis fermented tea on blood lipid level in mice

從表2可看出：與模型組比較，青刺尖“金花菌”發(fā)酵茶的低中高劑量組血清TC、TG、HDL-C、LDL-C濃度均降低，其中，低劑量組的TC與TG濃度均有顯著差異（p＜0.05），而中劑量組的TC與TG濃度的差異極顯著 （p＜0.01）；低中高劑量組的HDL-C濃度均極顯著差異 （p＜0.01）；低劑量組的LDL-C濃度差異達(dá)到顯著（p＜0.05），而中劑量組的LDL-C濃度差異達(dá)到極顯著（p＜0.01）。與青刺尖干茶組相比，青刺尖“金花菌”發(fā)酵茶的高劑量組血清TC、TG、LDL-C濃度均降低。與陽性組比較，青刺尖“金花菌”發(fā)酵茶3個(gè)劑量組的血清指標(biāo)差異性不顯著。

2.3 發(fā)酵茶對(duì)高血脂小鼠血清Apo-AI、Apo-B和LP-a的影響

經(jīng)過“金花菌”發(fā)酵，對(duì)高血脂小鼠血清Apo-AI、Apo-B和LP-a的影響見表3。

表3 發(fā)酵茶對(duì)高血脂小鼠血清Apo-AI、Apo-B及LP-a的影響Table 3 Effects of Prinsepia utilis fermented tea on Apo-AI、Apo-B and LP-a

由表3可知：與模型組比較，各劑量組血清的Apo-AI均高于模型組，中劑量組的差異達(dá)到極顯著（p＜0.01），高劑量組差異顯著（p＜0.05）；各劑量組Apo-B均低于模型組，中劑量組差異達(dá)到極顯著（p＜0.01），低、高劑量組差異顯著（p＜0.05）；各劑量組的Apo-B/Apo-AI比值均低于模型組，中劑量組差異顯著（p＜0.05）；各劑量組LP-a均低于模型組。

2.4 發(fā)酵茶對(duì)小鼠體重及肝臟指數(shù)的影響

連續(xù)灌胃28 d，對(duì)小鼠體重及肝臟指數(shù)的影響見表4。

表4 發(fā)酵茶對(duì)小鼠體重及肝臟指數(shù)的影響Table 4 Effects of Prinsepia utilis fermented tea on body weight and liver index in mice

由表4可知：與空白組比較，模型組體重有一定的增長，但差異不顯著，各劑量組體重的增長量均有降低，且均達(dá)到極顯著（p＜0.01）。與空白組比較，模型組的肝臟指數(shù)極顯著升高（p＜0.01），青刺尖金花菌發(fā)酵茶各劑量組的肝臟指數(shù)差異不顯著。與模型組比較，發(fā)酵茶處理組的體重增長量、肝臟指數(shù)兩項(xiàng)指標(biāo)均降低，體重增長量差異極顯著 （p＜0.01），低、中劑量組肝臟指數(shù)差異極顯著（p＜0.01），高劑量組差異顯著（p＜0.05）。而與陽性組和干茶組比較，各劑量組的肝臟指數(shù)差異均不顯著，而低劑量組的體重增長量低于陽性組和干茶組，且差異顯著（p＜0.05）。

2.5 發(fā)酵茶對(duì)小鼠肝臟組織的影響

青刺尖發(fā)酵茶對(duì)小鼠肝臟組織的影響，肝臟組織病理顯微結(jié)構(gòu)見圖1。

參照文獻(xiàn)[21]，由圖1可知，空白組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，未見增生及假小葉形成，小葉中央靜脈未見淤血，肝細(xì)胞未見變性及壞死，也未見肝細(xì)胞增生、纖維化，肝細(xì)胞內(nèi)及細(xì)小膽管內(nèi)無膽汁淤積；模型組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)欠清，肝細(xì)胞可見中度彌漫性水腫變性，可見脂肪變性；低、中劑量組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝索呈放射狀排列，可見散在脂肪小滴肝細(xì)胞及輕度水腫變性；高劑量組、干茶組及陽性組水腫程度較低、中劑量組輕，可判斷有極少散在脂肪小滴的肝細(xì)胞。

圖1 小鼠肝臟組織的病理顯微結(jié)構(gòu)(HE染色,x200)Fig.1 Microstructure of Pathology on the mice liver tissue(HE staining,x200)

3 結(jié)語

研究結(jié)果表明，經(jīng)“金花菌”發(fā)酵，青刺尖發(fā)酵茶處理組小鼠的體重增長量明顯低于空白組和模型組，呈一定的劑量效應(yīng)，其中，低、中劑量組控制體重增長的效果優(yōu)于高劑量組，低劑量組體重增長量低于陽性組和干茶組，且差異顯著（p＜0.05）；發(fā)酵茶各劑量組的肝臟指數(shù)明顯低于模型組，而與干茶組、陽性組和空白組比較均無顯著差異。與青刺尖干茶相比，青刺尖發(fā)酵茶可極顯著降低TC、TG（p＜0.01），而顯著降低 LDL-C（p＜0.05），同時(shí)，可控制HDL-C的過度增長。青刺尖茶經(jīng)此發(fā)酵，各處理組小鼠的血清LP-a、Apo-B/Apo-AI均低于模型組，其中，中劑量組差異顯著（p＜0.05）；而與干茶組、陽性組和空白組比較，各處理組均無顯著差異。

從小鼠的肝臟病理切片可知，青刺尖茶經(jīng)“金花菌”發(fā)酵后，其高劑量組的肝臟組織只有極少、散在的脂肪小滴，肝細(xì)胞病變程度較低，且與陽性組和干茶組比較，均無顯著差異，說明青刺尖發(fā)酵茶可能具有控制高血脂小鼠肝臟發(fā)生脂肪積累性病變的功能。因此，經(jīng)過“金花菌”發(fā)酵的青刺尖茶具有良好控制高血脂小鼠體重增長、降低血脂各項(xiàng)指標(biāo)、控制肝臟脂肪積聚的功效，且這些作用呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)。同時(shí)，金花菌屬于安全性的菌類，在黑茶中最為常見，以此菌發(fā)酵青刺尖具有很高的安全性。

青刺尖茶經(jīng)過發(fā)酵，其降脂效果更佳，控制體重增長更明顯，但要將其開發(fā)為新的功能性保健茶還需要對(duì)其風(fēng)味等感官和理化指標(biāo)進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化及科學(xué)客觀的評(píng)鑒。

參考文獻(xiàn)：

[1]MI K M，JIYUN A，HYUNYU L.Anti-obesity and hypolipidemic effects of chufa （Cyperus esculentusL.） in mice fed a high-fat diet[J].Food Sci Biotechnol，2012，21（2）：317-322.

[2]YANG.Bioactivity-guided fractionation of the triglyceride-lowering component and in vivo and in vitro evaluation of hypolipidemic effects of calyx seu fructus physalis[J].Lipids in Health and Disease，2012，11（1）：38.

[3]YANG Yongge，WANG Zhanqing，JIANG Nan，et al.Statins adverse reactions[J].Herald of Medicine，2011，30（6）：817-820.（in Chinese）

[4]WANG Yujie，ZHANG Yi，DU Juan，et al.Study on the anti-inflammatory active constituents ofPrinsepia utilis[J].West China Journal of Pharmaceutcal Sciences，2006，21（2）：152-154.（in Chinese）

[5]蘭茂.滇南本草（第2卷）[M].昆明：云南人民出版社，1975：426.

[6]YANG Yan，LIU Gang，ZHANG Xiaoyu，et al.Effect of Prinsepia utilis tea on blood lipids in hyperlipidemic mice[J].Science and Technology of Food Industry，2015，36（13）：361-367.（in Chinese）

[7]DING Ting，LV Jiali.Research development of“Jinhua” fungi in Fuzhuan tea[J].Science and Technology of Food Industry，2012，33（1）：419.（in Chinese）

[8]LIU Zuoyi.The research progress of"golden flower"bacteria[J].Journal of Guizhou Tea，1993，2：33-35.（in Chinese）

[9]DENG Fangming，GONG Shuli，YANG Weili.Study on bioactivity of extracellular polysaccharide of eurotium cristatum by high throughput screening[J].Food&Machinery，2007，23（6）：48-51.（in Chinese）

[10]FENG Lingran，WANG Qiang，LUO Wei，et al.Screening and identification of strains with tea polyphenols conversion activity in pu-erh tea samples[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2014，33（7）：763-764.（in Chinese）

[11]無錫輕工業(yè)學(xué)院.微生物學(xué)[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，1990：35-36.

[12]WEI Xiaohui.Effect of different inoculation dosage of eurotium cristatum on quality of green tea by solid-state fermentation[J].Guizhou Agricultural Sciences，2010，38（6）：82-83.（in Chinese）

[13]LIU Gang，F(xiàn)ANG Yu，YANG Yan，et al.Basic study on antimicrobial actions of Prinsepia utilis’ tea[J].Food Industry and Technology，2014，35（14）：114-117.（in Chinese）

[14]WEN Jing，ZHANG Jing，SANG Tingting，et al.The possibility of using hyperlipemia mice as model for evaluating the function of declining blood lipids food[J].Food Science，2006，27（11）：479-482.（in Chinese）

[15]XIA Ying，WU Dan，XIE Yunpeng.Simple technology of draw blood[J].China Science and Technology Information，2008，12（8）：204.（in Chinese）

[16]TIANShunliang，QIANXuehua.Devicesandskillsusedinbloodcollectionbycuttingratstails[J].Chinese Journal of Comparative Medicine，2006，16（7）：420-421.（in Chinese）

[17]LI Longnu，WANG Yanyan，YI Caina，et al.Effects of lipoic acid on lipid metabolism disorder and oxidative stress on mice feed high-fat diet[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2013，32（6）：610.（in Chinese）

[18]LV Chunmao，LU Changyin，MENG Xianjun，et al.Effect of flat-european hybrid hazelnut oil on hyperlipemia of rats induced by high diet[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2014，33（3）：332.（in Chinese）

[19]PAN Xuediao，WANG Huihao，HE Bing，et al.Effect of water extracts from on momordica charantia blood lipids in hyperlipidemic mice[J].Chinese Joumal of Experimental Traditional Medical Fomulae，2013，19（14）：266.（in Chinese）

[20]謝龍漢，尚濤，蔡明京.SPSS統(tǒng)計(jì)分析與數(shù)據(jù)挖掘（第二版）[M].北京：電子工業(yè)出版社，2014.

[21]蘇寧，姚全勝.新藥毒理實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組織病理學(xué)圖譜[M].南京：東南大學(xué)出版社，2005：75-90.