曹家明， 韋利軍*， 劉福松

（1.常州千紅生化制藥股份有限公司，江蘇 常州213022；2.中國藥科大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京210009）

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TNF related apoptosis-induced ligand，TRAIL）是 Wiley 等[1]于1995年發(fā)現(xiàn)并克隆的TNF家族成員，其廣泛表達于胸腺、肝臟、胎盤、外周血淋巴細胞等多種組織中[2]。TRAIL可選擇性地誘導(dǎo)乳腺癌、肝癌、肺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、淋巴癌以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤等腫瘤細胞凋亡，而對正常組織和細胞沒有明顯毒性效應(yīng)[3-4]。體內(nèi)實驗表明，TRAIL能引起移植入鼠和猿猴體內(nèi)的腫瘤消失或顯著地抑制腫瘤生長[5-6]。目前，TRAIL已成為特異性殺傷腫瘤細胞的研究熱點，有望成為潛在的抗腫瘤藥物。

整合素是一類細胞粘附受體家族蛋白，在骨肉瘤、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞表面有高水平的表達[7]。研究表明，該蛋白質(zhì)與腫瘤細胞生長、分化、轉(zhuǎn)移、凋亡密切相關(guān)[8]，而RGD肽（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）能夠與整合素專一性結(jié)合，活化凋亡前體蛋白，從而介導(dǎo)腫瘤血管內(nèi)皮細胞凋亡[8-9]。Arap等[10]將RGD同阿霉素結(jié)合，發(fā)現(xiàn)新的化合物對移植裸鼠體內(nèi)的人乳腺癌細胞作用增強，毒性降低。因此，將誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的TRAIL和對腫瘤細胞具有靶向性的RGD結(jié)合，可以將治療效應(yīng)的分子靶向腫瘤部位，將會具有更好的抗腫瘤活性和更低的毒副作用[8]。

響應(yīng)面法優(yōu)化能以較少的實驗次數(shù)對多個實驗因素及其相互影響進行考察和評價，從而快速有效地確定最優(yōu)條件[11]。目前響應(yīng)面法已廣泛用于培養(yǎng)基、酶催化和發(fā)酵過程的優(yōu)化[12-14]。作者采用響應(yīng)面分析法對影響RGD-TRAIL發(fā)酵的4個主要因素：接種體積分數(shù)、pH值、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時間進行了優(yōu)化，旨在提高RGD-TRAIL表達量，為放大生產(chǎn)提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

重組大腸桿菌RT，宿主菌E.coli BL21（DE3），載體pET28a，卡那霉素抗性：作者所在公司保存。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 種子培養(yǎng)基 （g/L） 蛋白胨 10；酵母粉 5；NaCl 10。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L） 蛋白胨 12；酵母粉 24；三水磷酸氫二鉀16.4；磷酸二氫鉀2.31；甘油5；體積分數(shù)0.1%的1 000×卡那霉素。

1.3 儀器與設(shè)備

BSC-1600IIA2型生物安全柜：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；ZQPZ-228型組合式振蕩培養(yǎng)箱：天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；MINI-PROTEAN Tetra Cell型電泳儀，Universal hoA560Ⅱ型凝膠成像系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司。

1.4 培養(yǎng)方法

1.4.1 種子培養(yǎng) 從抗性平板挑取重組大腸桿菌單克隆接入盛有5 mL LB培養(yǎng)基的試管中，37℃、200r/min培養(yǎng)12 h后得一級種子液。按0.1%的接種體積分數(shù)將一級種子液接入盛有含30 mL LB培養(yǎng)基的150 mL三角瓶中，37℃、200r/min培養(yǎng)12 h后得二級種子液。

1.4.2 菌種發(fā)酵 將二級種子液按一定的接種體積分數(shù)分別接入不同pH值的150 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、200r/min培養(yǎng)6 h后降溫到25℃，添加終濃度為0.8 mmol/L的IPTG進行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)一定時間后結(jié)束發(fā)酵。

1.4.3 RGD-TRAIL表達量檢測 取相當于 OD600=1的菌液1 mL，冰浴中超聲破碎，破碎液10 000 r/min離心3 min，所得上清液和4×SDS上樣緩沖液按體積比3∶1混合后沸煮5 min，然后進行SDS-PAGE（15 g/dL 的分離膠，上樣 10 μL），分離膠采用凝膠成像系統(tǒng)進行掃描，Qscan Demo軟件計算RGDTRAIL表達量。實驗過程中采用破壁離心上清液進行電泳檢測，離心過程已經(jīng)去除包涵體，因此，電泳檢測結(jié)果均為可溶性RGD-TRAIL。

1.5 試驗方法設(shè)計

1.5.1 單因素試驗 利用重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)RGD-TRAIL，對其發(fā)酵工藝中的接種體積分數(shù)（3%、6%、9%、12%、15%）， 發(fā)酵液初始 pH 值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5）和誘導(dǎo)時間（4、8、12、16、20 h）進行單因素考察，每個實驗重復(fù)3次。

1.5.2 響應(yīng)面優(yōu)化 通過單因素得到的結(jié)果，采用Box-Behnken實驗設(shè)計對其發(fā)酵工藝進行響應(yīng)面優(yōu)化，實驗重復(fù)3次。

1.5.3 數(shù)據(jù)分析方法 利用Origin 8.0進行數(shù)據(jù)處理，Design Export 8.0.5進行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 接種體積分數(shù)對RGD-TRAIL表達的影響接種體積分數(shù)大小直接影響發(fā)酵周期，接種體積分數(shù)較大時種子液中較多的胞外水解酶有利于營養(yǎng)物質(zhì)的利用，從而縮短發(fā)酵周期，提高RGD-TRAIL表達量，同時減少了雜菌生長的機會；接種體積分數(shù)過大時菌種生長過快，導(dǎo)致發(fā)酵液粘度增加，溶氧降低，菌體過早進入衰亡期，蛋白質(zhì)表達量下降[15]。按1.4.2的實驗方法，分別按3%、6%、9%、12%、15%的接種體積分數(shù)將種子液接種于pH 7.5的發(fā)酵培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)16 h結(jié)束發(fā)酵，考察不同接種體積分數(shù)對RGD-TRAIL表達的影響，結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，隨著接種體積分數(shù)的增大，RGD-TRAIL表達量逐漸增加，當接種體積分數(shù)為9%時，RGDTRAIL表達量最高，繼續(xù)增加接種體積分數(shù)，RGDTRAIL表達量出現(xiàn)緩慢下降。因此，選擇9%的接種體積分數(shù)最有利于RGD-TRAIL表達。

圖1 接種體積分數(shù)對RGD-TRAIL表達的影響Fig.1 Effects of inoculation volume on RGD-TRAIL expression

2.1.2 pH值對RGD-TRAIL表達的影響 pH值的變化會引起多種酶活性的改變，影響菌體對底物的吸收利用，從而影響菌體的生長和目的蛋白質(zhì)的合成[15]。按1.4.2試驗方法，接種體積分數(shù)采用9%，將種子液接種于 pH 值分別為 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的發(fā)酵培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)16 h結(jié)束發(fā)酵，考察不同pH值對RGD-TRAIL表達的影響，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，不同pH值的發(fā)酵培養(yǎng)基中均能表達 RGD-TRAIL，pH值 7.0～7.5時 RGD-TRAIL表達量較高，而pH值為7.0時RGD-TRAIL表達量最高，達到11.86%，因此，選擇pH 7.0作為發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳pH值。

2.1.3 誘導(dǎo)時間對RGD-TRAIL表達的影響 誘導(dǎo)時間的長短影響目的蛋白的表達量，從而對發(fā)酵產(chǎn)生重要影響。按1.4.2的實驗方法，接種體積分數(shù)采用9%，發(fā)酵培養(yǎng)基pH值調(diào)節(jié)為7.0，誘導(dǎo)20 h結(jié)束發(fā)酵，分別于誘導(dǎo) 4、8、12、16、20 h 時取樣，考察誘導(dǎo)時間對RGD-TRAIL表達的影響，結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，隨著誘導(dǎo)時間的增加，RGDTRAIL表達量迅速增加，誘導(dǎo)12 h時，RGD-TRAIL表達量達到最大值（12.33%）；隨后RGD-TRAIL表達量開始緩慢下降。因此，誘導(dǎo)時間選擇12 h最佳。

圖2 pH值對RGD-TRAIL發(fā)酵工藝的影響Fig.2 Effects of pH on RGD-TRAIL expression

圖3 誘導(dǎo)時間對RGD-TRAIL發(fā)酵工藝的影響Fig.3 Effects of induction time on RGD-TRAIL expression

2.2 可溶性RGD-TRAIL發(fā)酵中心組合試驗設(shè)計及響應(yīng)優(yōu)化分析

2.2.1 因素與水平的確定 通過誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)劑濃度對RGD-TRAIL表達量的影響研究[16]，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)溫度對RGD-TRAIL表達影響較大，25℃誘導(dǎo)時可RGD-TRAIL表達量最高。結(jié)合2.1中單因素試驗結(jié)果，采用Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計，以誘導(dǎo)溫度25℃、接種體積分數(shù)9%、pH 7.0，誘導(dǎo)時間12 h為中心點，以RGD-TRAIL表達量為響應(yīng)值，進行四因素三水平實驗設(shè)計，實驗方案見表1。

2.2.2 Box-Behnken實驗結(jié)果 實驗共27組實驗，實驗號1～24為析因試驗，實驗號25～27為中心點試驗，實驗結(jié)果見表2。

表1 各因素水平與取值Table 1 Factors and levels of variances

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 2 Design and values of Box-Behnken experiments

2.2.3 模型的建立及方差分析 應(yīng)用Design Export軟件對響應(yīng)值和各因素進行回歸擬合，得到重組大腸桿菌發(fā)酵表達RGD-TRAIL的二次回歸方程：

Y=-1569.30+24.60A+467.24B-6.63C-2.98D+1.75AB+0.28AC+0.23AD+0.50BC+0.25BD+0.24CD-2.87A2-36.64B2-0.23C2-0.08D2

以RGD-TRAIL表達量為響應(yīng)值，根據(jù)表2實驗結(jié)果，應(yīng)用Design Export軟件對模型進行回歸分析，結(jié)果見表3。

表3 實驗結(jié)果回歸分析Table 3 Regression analysis of experiment results

從表3可以看出，回歸模型p＜0.000 1，失擬項p＞0.05值不顯著，說明構(gòu)建的模型和真實值之間能夠較好地擬合。該模型決定系數(shù)R2=0.973 5，表明該模型可以解釋響應(yīng)面中97.35%的可變性。模型中自變量 B、C、D、CD、A2、B2的 P 值達到了極顯著的水平，說明pH、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時間及誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時間的交互作用對RGD-TRAIL發(fā)酵工藝的影響最為顯著，且各影響因素和影響值之間不是線性關(guān)系。

2.2.4 響應(yīng)面及等高線分析結(jié)果 對構(gòu)建的回歸模型進行響應(yīng)面分析，考察了各因素間交互作用與響應(yīng)值之間的響應(yīng)曲面圖，結(jié)果見圖4。從圖4可以看出：因素C與因素D的交互作用曲面最為陡峭，且等高線呈橢圓，表明誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時間交互作用對RGD-TRAIL發(fā)酵工藝影響比較顯著，這與表3中回歸分析結(jié)果是一致的。

對回歸方程進行偏導(dǎo)求解，得出重組大腸桿菌表達RGD-TRAIL最佳發(fā)酵條件為：接種體積分數(shù)7.88%，pH值7.02，誘導(dǎo)時間10.25 h，誘導(dǎo)溫度22℃，此時RGD-TRAIL表達量的預(yù)測值達到最大，為17.31%。

2.2.5 驗證實驗 為檢驗試驗的可靠性，采用上述最優(yōu)發(fā)酵條件進行了3次RGD-TRAIL發(fā)酵驗證試驗，得到RGD-TRAIL的表達量為17.27±0.76%，與模型預(yù)測值接近，證明該模型描述RGD-TRAIL發(fā)酵工藝是可行的。

圖4 各因素交互效應(yīng)對RGD-TRAIL表達量的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface curve of RGD-TRAIL affected by two-factor interactions

3 結(jié)語

目前，腫瘤已經(jīng)成為嚴重威脅人類健康的常見疾病。2014年世界衛(wèi)生組織癌癥報告稱，2012年全球新增癌癥病例1 400萬，預(yù)計到2035年全球?qū)⑿略? 200萬的癌癥病例。艾美仕（IMS）公司預(yù)測，2018年全球抗腫瘤藥物市場規(guī)模將達到1 000億美元。蛋白類抗腫瘤藥物由于具有高效低毒，避免放化療的副作用而成為了各大制藥公司近年來的研發(fā)熱點。

TRAIL特異性的誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡而對正常細胞無毒性的獨特優(yōu)勢，使其成為抗腫瘤藥物中潛在的“重磅炸彈”。目前基因泰克正在進行II期臨床試驗，上海恰爾生物技術(shù)有限公司已經(jīng)獲批進行III期臨床試驗，上海歌佰德生物技術(shù)有限公司已經(jīng)完成III期臨床研究，人福藥業(yè)也已獲批進行II、III期臨床試驗，然后由于缺乏腫瘤選擇性，大劑量的TRAIL可引起肝毒性、過敏性毒性等副作用。為了降低TRAIL的毒副作用，我公司同南京大學(xué)合作，針對腫瘤新手微血管上的 αvβ3/αvβ5整合素開發(fā)了具有靶向性的一類抗腫瘤新藥RGD-TRAIL。由于RGD肽的靶向作用，更多的重組蛋白和死亡受體結(jié)合，激活凋亡通路，使RGD-TRAIL具有更強的抗腫瘤活性和更低的毒副作用。體外實驗表明RGDTRAIL 對 COLO205（結(jié)腸癌）、A-673（骨癌）、NCIH358（非小細胞肺癌）等腫瘤細胞最為敏感，其IC50值皆小于0.05 μg/mL；體內(nèi)動物實驗表明，RGDTRAIL具有良好的抗腫瘤活性，等效劑量是TRAIL的五分之一。

大腸桿菌由于結(jié)構(gòu)簡單、遺傳背景清晰、生長周期短而廣泛用于重組蛋白的表達系統(tǒng)。外源基因在大腸桿菌中的表達不僅受載體、啟動子和目的基因的影響，而且和重組菌的培養(yǎng)條件息息相關(guān)。RGD-TRAIL表達過程中由于出現(xiàn)蛋白質(zhì)的非正確折疊而形成包涵體，因此，進行培養(yǎng)條件的優(yōu)化來提高RGD-TRAIL表達量（可溶性）有著重要意義。而響應(yīng)面分析法作為一種優(yōu)化方法，可以在更廣泛的范圍考慮因素的組合，優(yōu)化發(fā)酵條件，預(yù)測響應(yīng)值，使工程菌在最佳的發(fā)酵條件中生長繁殖，進而獲得較多的目的蛋白。

前期研究發(fā)現(xiàn)接種體積分數(shù)、pH值、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時間等培養(yǎng)條件對RGD-TRAIL的積累均產(chǎn)生重要影響。響應(yīng)面實驗結(jié)果回歸分析發(fā)現(xiàn)，pH值、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時間的P值均達到極顯著水平，這和預(yù)實驗的結(jié)果是一致的。pH值不僅可以影響工程菌對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，而且影響多種酶的活性。誘導(dǎo)溫度對目的蛋白的表達十分關(guān)鍵，誘導(dǎo)溫度較高時目的蛋白來不及正確折疊而形成大量包涵體，給后續(xù)分離帶來困難，而且會增加質(zhì)粒的不穩(wěn)定性；誘導(dǎo)溫度過低時抑制工程菌生長，導(dǎo)致RGD-TRAIL產(chǎn)量降低。誘導(dǎo)時間是影響目的蛋白產(chǎn)量的又一重要因素，誘導(dǎo)時間過短，RGD-TRAIL合成量少；誘導(dǎo)時間過長，營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡，有害物質(zhì)積累導(dǎo)致重組菌的負擔過重，造成目的蛋白降解?；貧w分析同時發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)溫度和時間之間存在相互影響，借助響應(yīng)面圖可以看出等高線呈現(xiàn)橢圓形，表明這兩個因素相互作用極其顯著，等高線中最小橢圓的中心點即使響應(yīng)面的最高點。通過對回歸方程的求解，得到RGD-TRAIL最佳酵工藝條件為：接種體積分數(shù)7.88%，pH值7.02，誘導(dǎo)時間10.25 h，誘導(dǎo)溫度22℃。在此最佳發(fā)酵條件下RGD-TRAIL的理論表達量為17.31%。在驗證實驗中RGD-TRAIL的表達量為17.27%，較優(yōu)化前提高了40.06%。本研究為RGD-TRAIL的生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

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