吳月紅， 袁海彬， 洪 楓， 陳 琳*

（1. 東華大學(xué) 生態(tài)紡織教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201620；2. 東華大學(xué) 化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620）

印染廢水嚴(yán)重污染水體環(huán)境[1-2]。蒽醌染料是一種廣泛使用的染料，但其結(jié)構(gòu)很穩(wěn)定，不易脫色[3]。目前常用的脫色方法有物理法、化學(xué)法和生物法等[4]，生物酶法由于綠色環(huán)保的特點(diǎn)備受關(guān)注[5]。漆酶（Laccase;EC 1.10.3.2.）是一種含銅的多酚氧化還原酶[6]，該酶對(duì)染料脫色的研究較多[7-8]。在反應(yīng)過(guò)程中，漆酶以氧氣作為第二底物被還原成水[9-11]。在細(xì)菌纖維素（Bacterial Cellulose, BC）固定化漆酶方面的相關(guān)研究較多：袁海彬等[12]采用不同菌株來(lái)源的BC固定化漆酶并比較了固定化酶的催化效率；Zou等[13]使用BC微球?yàn)檩d體固定化漆酶，Chen等[14]用BC模塊固定化真菌漆酶并對(duì)該固定化酶進(jìn)行了表征；固定的漆酶可用于處理染料廢水[15-16]。BC是一種生物合成的纖維素高聚物，具有可生物降解、多孔和比表面積大等特性[17]，是一種理想的固定化載體。

本文以 BC膜固定化漆酶，并進(jìn)行填柱組裝生物反應(yīng)器，研究該固定化酶及生物反應(yīng)器對(duì)蒽醌染料——活性艷藍(lán)KN-R的降解脫色效果。與之前的報(bào)道相比，本研究是首次采用以BC膜固定化的漆酶填充組裝生物反應(yīng)器，并對(duì)活性艷藍(lán)KN-R進(jìn)行脫色。在物理吸附和生物酶降解共同作用下，大大增加了脫色效果。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與試劑

漆酶購(gòu)自山東蘇柯漢生物工程股份有限公司，由白腐真菌發(fā)酵而來(lái)，酶活655.6 U/g；2,2?-連氮-雙（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）（簡(jiǎn)稱 ABTS）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；活性艷藍(lán) KN-R染料購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，配制200 mg/L活性艷藍(lán)KN-R儲(chǔ)備液待用。其它所用試劑均為分析純。

BC膜由實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵制備而來(lái)：將斜面保藏的木醋桿菌（Komagataeibacter xylinus ATCC 23770）用接種環(huán)接入種子培養(yǎng)基中，在30℃和160 r/min的搖床中活化培養(yǎng)20 h，然后按5%（V/V）的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，最后放入30℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵培養(yǎng)12 d，木醋桿菌將在氣液界面分泌纖維素形成細(xì)菌纖維素膜。實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基組成為：葡萄糖25 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母粉3 g/L，培養(yǎng)基配好后用檸檬酸將pH值調(diào)至5.0，在115℃高壓滅菌鍋下滅菌30 min。

將獲得的細(xì)菌纖維素膜用0.5%（w/V）的氫氧化鈉水溶液在80℃下浸泡2 h，分別連續(xù)處理3次以上，再用去離子水浸泡2 d以上，純化后的膜放入4℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。稱取1 g漆酶（酶活為655.6 U/g）溶于10 mL NaAC-HAC（0.2 mol/L，pH5.0）水溶液中配置漆酶溶液，放入4℃冰箱待用。

1.2 漆酶的固定化及酶活測(cè)定

將細(xì)菌纖維素膜剪成大小均勻的塊狀（1 cm×1 cm）在冷凍干燥機(jī)中凍干，凍干后的膜塊浸沒(méi)于漆酶溶液中，在恒溫振蕩水浴鍋中，于室溫和100 r/min速率下吸附2 h以上，酶分子通過(guò)物理吸附負(fù)載到細(xì)菌纖維素膜上，完成固定化，取出后用NaAc-HAc緩沖溶液漂洗3次，于4℃冰箱中保存。

游離酶活力的測(cè)定：ABTS為反應(yīng)底物[18]，反應(yīng)體系總體積為3 mL，包含1 mL NaAc-HAc緩沖溶液（0.2 mol/L，pH5.0），1 mL ABTS（1 mM，εABTS＝36 000 M-1cm-1），和1 mL適量稀釋漆酶水溶液，在紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)中于420 nm處測(cè)其3 min內(nèi)吸光值的變化，計(jì)算斜率k值，求其酶活。固定化酶酶活測(cè)定體系包含1 mL NaAc-HAc緩沖溶液（0.2 mol/L，pH5.0），1 mL ABTS（1 mM）和適量質(zhì)量固定化酶。一個(gè)酶活單位定義為每分鐘內(nèi)生成1 μmol ABTS游離基所需的酶量。游離酶及固定化酶的計(jì)算公式如下式（1）所示。

其中：V總為反應(yīng)體系的總體積，V酶為反應(yīng)酶液的體積，Δt＝3 min，ΔA＝3 min內(nèi)吸光值的變化量，ε＝3.6×104M-1cm-1。

其中：V總為反應(yīng)體系的總體積，m載體為固定化酶載體的質(zhì)量，Δt＝3 min，ΔA＝3 min內(nèi)吸光值的變化量，ε＝3.6×104M-1cm-1。

1.3 固定化漆酶對(duì)活性艷藍(lán)KN-R溶液的脫色

將5.0 g固定化酶濕膜塊填充到層析柱中（1.6×40 cm），塞緊，每次填充的高度保持一致，在柱中緩慢加入15 mL濃度為50 mg/L的活性艷藍(lán)KN-R染料水溶液，脫色后的溶液將從層析柱底部流出。在597 nm處測(cè)得染料溶液脫色之前的吸光度為A0，脫色之后的吸光度為A1，根據(jù)公式（3）算出脫色率：

1.4 活性艷藍(lán)KN-R脫色前后的紫外可見(jiàn)吸收光譜

用固定化酶對(duì)活性艷藍(lán)KN-R溶液進(jìn)行脫色，將脫色前后的溶液在紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)中進(jìn)行200～700 nm全波長(zhǎng)掃描，觀察溶液脫色前后的吸收峰變化。

1.5 固定化漆酶對(duì)活性艷藍(lán)KN-R的降解動(dòng)力學(xué)

將濕重為1.5 g的固定化酶加入15 mL濃度為50 mg/L的活性艷藍(lán)KN-R溶液中進(jìn)行脫色，分別測(cè)定10、30、60、120、180、360、720和1440 min時(shí)溶液的吸光度，根據(jù)活性艷藍(lán)KN-R的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出不同時(shí)間段脫色后溶液的濃度，然后分別進(jìn)行一級(jí)和二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程模擬。

1.6 BC 膜對(duì)活性艷藍(lán)KN-R的吸附等溫線

配制濃度為10、20、50、100、150和200 mg/L的活性艷藍(lán)KN-R溶液，取濕重為5 g的細(xì)菌纖維素膜塊分別加入到15 mL各個(gè)濃度的活性艷藍(lán)KN-R溶液中，室溫下進(jìn)行脫色，測(cè)定活性艷藍(lán)KN-R脫色后的溶液的吸光度，根據(jù)活性艷藍(lán)KN-R溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出脫色后的溶液的濃度，然后分別進(jìn)行Langmuir吸附等溫線和Freundlich吸附等溫線模擬。

1.7 不同因素對(duì)活性艷藍(lán)KN-R脫色率的影響

將濕重為5.0 g的BC膜吸附不同酶活濃度的游離酶，制備固定化酶后，將總酶活為0、14.2、28.3、56.8、84.9、113.2和141.6 U的固定化酶分別放入15 mL活性艷藍(lán)KN-R溶液中，反應(yīng)總體系均為25 mL，探究不同的固定化酶的活力對(duì)脫色率的影響。加入與固定化酶酶活相同的游離酶對(duì)活性艷藍(lán) KN-R脫色，比較固定化酶與游離酶在降解率和反應(yīng)速率上的差異。

將濕重分別為0.5、1.0、2.5、5.0、7.5和10 g的固定化酶膜塊填充到層析柱中，探究不同的層析柱填充量對(duì)脫色率的影響。

配制濃度為10、20、50、100、150和200 mg/L的活性艷藍(lán)KN-R染料溶液，探究不同的染料濃度對(duì)脫色率的影響。

調(diào)節(jié)活性艷藍(lán)KN-R溶液的pH分別為3、5、7、9和11，探究不同的pH對(duì)脫色率的影響。

將濕重為5.0 g的固定化酶對(duì)活性艷藍(lán)KN-R溶液重復(fù)脫色5次，探究固定化酶的重復(fù)使用性。

2 結(jié)果與討論

2.1 活性艷藍(lán)KN-R脫色前后的紫外可見(jiàn)吸收光譜

圖1為活性艷藍(lán)KN-R脫色前后的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖。

從圖 1可以看出，部分脫色的活性艷藍(lán)KN-R溶液在可見(jiàn)和紫外光區(qū)的吸收峰都減小，完全脫色的活性艷藍(lán)KN-R溶液的吸收峰則幾乎完全消失，說(shuō)明染料的發(fā)色基團(tuán)被破壞，活性艷藍(lán)KN-R發(fā)生了降解而脫色。

2.2 固定化漆酶對(duì)活性艷藍(lán)KN-R的降解動(dòng)力學(xué)

圖1 活性艷藍(lán)KN-R脫色前后的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖

為了更好地了解固定化漆酶對(duì)活性艷藍(lán) KN-R的降解過(guò)程，對(duì)降解過(guò)程分別進(jìn)行一級(jí)和二級(jí)動(dòng)力學(xué)表征，兩種動(dòng)力學(xué)方程如下式（1）和式（2）[19]：

由圖2可以看出，二級(jí)動(dòng)力學(xué)的線性更好，固定化酶對(duì)活性艷藍(lán)KN-R的降解更符合二級(jí)動(dòng)力學(xué)模擬。

圖2 動(dòng)力學(xué)模擬（a）一級(jí)動(dòng)力學(xué)模擬、（b）二級(jí)動(dòng)力學(xué)模擬

2.3 BC 膜對(duì)活性艷藍(lán)KN-R的吸附等溫線

細(xì)菌纖維素膜載體對(duì)染料有一定的吸附，對(duì)吸附過(guò)程分別進(jìn)行Langmuir和Freundlich吸附等溫線模擬，兩種吸附等溫線方程如下式（3）和式（4）[20]：

式中：Ce為吸附平衡濃度（mg/L），qe為細(xì)菌纖維素膜對(duì)活性艷藍(lán) KN-R的吸附量（mg/g），qm為最大吸附量（mg/g），KL、KF、n為吸附速率常數(shù)。從圖 3可以看出，載體細(xì)菌纖維素膜對(duì)活性艷藍(lán) KN-R的吸附更符合Freundlich吸附等溫線，說(shuō)明細(xì)菌纖維素膜對(duì)活性艷藍(lán)KN-R的吸附不屬于單分子層吸附。

圖3 吸附等溫線模擬（a）Langmuir 吸附、（b）Freundlich吸附

2.4 不同因素對(duì)活性艷藍(lán)KN-R溶液脫色率的影響

2.4.1 酶活對(duì)活性艷藍(lán)KN-R染料脫色率的影響

從圖 4可以看出，當(dāng)未加酶時(shí)，溶液的脫色率為23.4%，即沒(méi)有固定化酶時(shí)細(xì)菌纖維素膜對(duì)活性艷藍(lán)KN-R的吸附量，表明細(xì)菌纖維素膜本身對(duì)活性艷藍(lán)KN-R染料有一定的吸附率。一定范圍內(nèi)隨著同樣質(zhì)量BC載體上漆酶量的增加，固定化酶活增大，艷藍(lán)脫色率增加，隨著游離酶的酶活增加，艷藍(lán)脫色率同樣增加。當(dāng)加入的同樣質(zhì)量BC固定化酶的活力為84.9 U時(shí)，此時(shí)反應(yīng)體系酶活為3.4 U/mL，脫色率最大為73.5%，而同等酶活的游離酶脫色率為20.5%，計(jì)算得出，固定化酶比游離酶的降解率提高了2倍，反應(yīng)速率提高了3倍，染料可能會(huì)破壞酶分子，BC膜載體為漆酶提供了相對(duì)穩(wěn)定的環(huán)境，因此固定化酶的效率比游離酶高。繼續(xù)增加固定化酶酶活，脫色率會(huì)有所下降，這可能是由于當(dāng)單位質(zhì)量的BC膜上增加酶量時(shí)，漆酶對(duì)活性艷藍(lán)KN-R的降解效率會(huì)增加，但是過(guò)量的酶占據(jù)了BC膜上的吸附位點(diǎn)，減小了BC膜對(duì)染料分子的吸附，最終導(dǎo)致脫色率有所下降。

圖4 酶活對(duì)脫色率的影響

2.4.2 層析柱填充的固定化酶量對(duì)脫色率的影響

圖5a中是總的脫色率和BC膜對(duì)艷藍(lán)的吸附，圖5b中脫色率為扣除BC膜吸附后的值。加入的固定化酶填充量在0.5～10 g范圍內(nèi)，隨著層析柱中填充的固定化酶增多，脫色率增大。在加入濕重為0.5 g的固定化酶時(shí)，活性艷藍(lán)KN-R總的脫色率為39.9%，此時(shí)BC膜對(duì)染料的吸附量較少為5.5%，增加層析柱中固定化酶的填充量，脫色率迅速增加，當(dāng)固定化酶的量增加到5.0 g時(shí)，BC膜對(duì)染料的吸附量為23.9%，總的脫色率可以達(dá)到 87.5%。繼續(xù)增加固定化酶的填充量，BC膜的吸附增加很多，一定時(shí)間內(nèi)酶的降解率增加緩慢，因此扣除BC膜的吸附后，圖5b中顯示固定化酶的降解率下降，但是被BC膜吸附的染料最終也會(huì)被膜上的酶降解。綜合考慮BC膜的吸附和酶的降解，比較理想的固定化酶填充量為5.0 g。

圖5 固定化酶量對(duì)脫色率的影響（a）固定化酶質(zhì)量、（b）固定化酶酶活

2.4.3 染料濃度對(duì)活性艷藍(lán)KN-R染料脫色的影響

從圖6可以看出，當(dāng)活性艷藍(lán)KN-R染料的濃度小于50 mg/L時(shí)，增加染料的濃度，催化反應(yīng)速度增大，脫色率上升，當(dāng)染料濃度達(dá)到50 mg/L時(shí)脫色率最大，為81.1%，當(dāng)濃度超過(guò)50 mg/L時(shí)，脫色率有所降低。適當(dāng)增加染料濃度，脫色率會(huì)升高，說(shuō)明酶未被染料分子所飽和，但染料濃度達(dá)到50 mg/L時(shí)，一定時(shí)間內(nèi)酶的活性中心完全被底物占據(jù)，此時(shí)繼續(xù)增加染料濃度也不會(huì)增加酶與染料的中間產(chǎn)物，而B(niǎo)C膜對(duì)染料的吸附率也是有限的，所以當(dāng)?shù)孜餄舛忍髸r(shí)脫色率會(huì)降低。

圖6 染料濃度對(duì)脫色率的影響

圖7 pH對(duì)脫色率的影響

2.4.4 pH 對(duì)活性艷藍(lán)染料KN-R染料脫色的影響

從圖7可以看出，當(dāng)pH為3～5時(shí)，隨著pH的增加，脫色率增大，pH為5時(shí)活性艷藍(lán)KN-R的脫色率最高為95.2%，pH值大于7后，脫色率快速下降，當(dāng)pH增大到11時(shí)，脫色率僅為34.3%，說(shuō)明偏酸性條件適合漆酶對(duì)活性艷藍(lán) KN-R染料的脫色，而堿性條件下的脫色效果非常差，這與之前的報(bào)道基本一致[21]，但是有報(bào)道說(shuō)漆酶對(duì)不同的染料脫色的最佳pH是不同的[22]。

2.4.5 固定化酶對(duì)活性艷藍(lán)KN-R脫色的重復(fù)使用次數(shù)

從圖8可以看出，隨著重復(fù)脫色的次數(shù)增多，脫色率下降，在重復(fù)脫色3次后，脫色率降為原來(lái)的一半左右，在重復(fù)脫色5次以后，活性艷藍(lán)KN-R的脫色率僅為12.2%。隨著重復(fù)脫色的次數(shù)增加，載體膜上越來(lái)越多的染料以及染料分解后的產(chǎn)物，阻礙了固定化膜對(duì)活性艷藍(lán)KN-R的吸附，膜上固定化酶的酶活也逐漸失活減小，脫色變得越來(lái)越困難，脫色率降低。

圖8 固定化酶的重復(fù)使用次數(shù)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)主要研究了細(xì)菌纖維素膜固定化漆酶對(duì)活性艷藍(lán)KN-R的脫色過(guò)程，主要結(jié)論如下：

1）BC膜為載體固定化漆酶對(duì)活性艷藍(lán)KN-R有良好的脫色效果，與游離酶相比降解率提高了2倍，反應(yīng)速率提高了3倍；固定化酶對(duì)活性艷藍(lán)KN-R的降解符合二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程；BC膜對(duì)活性艷藍(lán)KN-R的吸附符合Freundlich吸附等溫線；脫色后的活性艷藍(lán)KN-R溶液的紫外可見(jiàn)吸收光譜的吸收峰幾乎完全消失，說(shuō)明染料發(fā)生降解而脫色。

2）固定化酶對(duì)活性艷藍(lán)KN-R的脫色在偏酸性條件下較好，pH為5時(shí)，脫色率為95.2%；染料濃度為50 mg/L時(shí)脫色效果較好；反應(yīng)體系中加入84.9 U的固定化酶時(shí)，此時(shí)反應(yīng)體系酶活為3.4 U/mL，脫色率最高為73.5%；隨著固定化酶重復(fù)脫色次數(shù)的增加，脫色率會(huì)逐漸降低。

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