李 想 李伯琦 于 璐 劉奕杉 周曉慧 迪麗努爾·阿吉

隨著口腔醫(yī)學(xué)的發(fā)展，關(guān)于口腔功能與腦功能的研究已成為該領(lǐng)域的研究熱點之一[1，2]。大量研究結(jié)果證實，大鼠的情感、行為、學(xué)習記憶和空間辨別等高級神經(jīng)活動主要由海馬CA1區(qū)參與完成[3]。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（Brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是體內(nèi)含量最多的神經(jīng)營養(yǎng)因子，酪氨酸激酶 B受體（tyrosine kinases B receptor，TrkB）是BDNF的特異性受體，BDNF在靶細胞膜上與TrkB受體結(jié)合，形成配體-受體復(fù)合物，從而參與學(xué)習記憶功能[4]。研究顯示，大鼠海馬中BDNF的表達減少是由于成年小鼠的磨牙缺失或者進軟食導(dǎo)致的[5]。但磨牙缺失對幼年大鼠海馬CA1區(qū)BDNF與其受體TrkB的影響仍缺乏足夠的理論依據(jù)。本研究通過建立磨牙缺失的幼年大鼠模型，觀察大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)及BDNF、TrkB表達變化，初步研究關(guān)于磨牙缺失對幼年大鼠學(xué)習記憶能力影響的神經(jīng)生化基礎(chǔ)，并擬求為后期研究奠定理論基礎(chǔ)。

資料和方法

1.實驗動物及分組：SPF級健康雄性SD大鼠（4～5周齡）50只，體重50～70g，由新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗動物中心提供，動物倫理審查批號（IACUC20150709-05），所有動物在清潔、安靜的環(huán)境下籠內(nèi)飼養(yǎng)，自由進食水。

SD大鼠進入實驗室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按隨機數(shù)字表法分成A、B、C、D、E五組，每組10只。A組：正常對照組；B組：3顆磨牙拔除組；C組：6顆磨牙拔除組；D組：9顆磨牙拔除組；E組：12顆磨牙拔除組。

2.主要試劑和儀器：實驗過程中的主要試劑如下：一抗：腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子多克隆抗體、酪氨酸激酶B受體多克隆抗體（武漢三鷹）；二抗：山羊抗兔IgG；DAB顯色試劑盒；抗體稀釋液（北京中杉金橋生物科技有限公司）；光學(xué)顯微鏡、顯微采片機、石蠟切片機、生物組織自動包埋機（德國萊卡公司）；注射水合氯醛（新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗室提供）。

3.模型的建立：所有實驗動物用水合氯醛（3.5mg/kg）腹腔注射麻醉。A組不進行牙齒拔除術(shù)，B組拔除左側(cè)下頜3顆磨牙，C組拔除左側(cè)上下頜6顆磨牙，D組拔除左側(cè)上下頜及對側(cè)下頜共9顆磨牙，E組拔除雙側(cè)12顆磨牙。

實驗組大鼠用小號止血鉗進行磨牙拔除術(shù)，術(shù)中盡量完整拔除牙齒，若牙冠折斷，則去除齦上可見的牙體組織，消除后牙咬合接觸，常規(guī)壓迫止血，處理術(shù)后常規(guī)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

4.標本制備：5組大鼠在干預(yù)后8周后，麻醉條件下快速斷頭，剝離腦組織，在冰冷的金屬平臺上迅速分離出海馬組織。將海馬組織標本置于4%多聚甲醛磷酸緩沖液（0.1mol/l，pH＝7.4）中固定24小時后，常規(guī)石蠟包埋。定位海馬典型位置，參照《大鼠腦立體定位圖譜》進行連續(xù)冠狀切片，厚5μm。

5.檢測指標和方法：①HE染色觀察大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞的改變：從各組大鼠中隨機抽取8只大鼠的海馬組織切片，每只取5張連續(xù)切片進行HE染色，在顯微鏡下觀察海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)細胞形態(tài)及細胞排列。②免疫組化法檢測海馬CA1區(qū)BDNF、TrkB蛋白的表達：從每組大鼠中隨機抽取8只海馬組織切片，采用親和素—生物素—過氧化物酶復(fù)合物法（ABC法）檢測BDNF、TrkB蛋白的表達。每只大鼠5張切片進行高壓修復(fù)抗原，3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶，兔抗鼠BDNF（1:200）、兔抗鼠TrkB（1:300）4℃孵育過夜，二抗37℃孵育45min，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色 3min，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，透明及中性樹膠封片。③圖像采集及分析：光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞并攝像。每個樣本取3張切片，每張切片各選擇5個高倍視野（×400），應(yīng)用Image-pro-plus6.0圖像分析系統(tǒng)測定每個視野免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物的積分光密度值，以平均光密度值作為大鼠海馬CA1區(qū)蛋白陽性細胞表達的最終數(shù)值。

6.統(tǒng)計學(xué)處理：應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差（±S）做統(tǒng)計描述。多組間比較應(yīng)用單因素方差分析，且認為P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.HE染色觀察大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞的改變：HE染色結(jié)果顯示：A組神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)清楚，細胞膜完整，核大而圓，染色均勻，呈藍紫色，細胞排列5～8層分布，構(gòu)成顯著的帶狀，未見神經(jīng)元變性，水腫及壞死，細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常。而實驗組中發(fā)現(xiàn)，B組的海馬CA1區(qū)細胞組織形態(tài)與A組相比較發(fā)現(xiàn)無明顯改變；C組的海馬CA1區(qū)組織中發(fā)現(xiàn)開始出現(xiàn)細胞膜不完整，部分細胞出現(xiàn)空泡狀，細胞核固縮，細胞層數(shù)的減少和細胞排列的紊亂；而D、E組的海馬組織CA1區(qū)則發(fā)現(xiàn)細胞核碎裂，細胞層數(shù)減少以及細胞排列稀疏、紊亂加?。▓D1）。

2.免疫組化法檢測海馬CA1區(qū)BDNF、TrkB蛋白的表達：免疫組化染色結(jié)果：陽性細胞為細胞膜及胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，積分光密度值與免疫陽性細胞產(chǎn)物含量成正比。A、B、C、D、E五組在8周時，隨著磨牙缺失數(shù)目的增加，大鼠海馬CA1區(qū)的BDNF、TRKB的表達量呈現(xiàn)降低趨勢（圖4）。A組BDNF、TrkB蛋白表達量最高（370.0±14.56，367.8±13.99）。與A組相比，B組的BDNF、TrkB蛋白的表達量稍降低，表現(xiàn)為免疫陽性產(chǎn)物的積分光密度值降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。而C、D、E組的BDNF及TrkB蛋白的表達量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖2、3、表1、2）。

圖1 大鼠海馬CA1區(qū)組織結(jié)構(gòu)的變化（HE染色×400）

表1 不同處理組大鼠海馬CA1區(qū)BDNF、TrkB 陽性細胞 IOD值（±S）

表1 不同處理組大鼠海馬CA1區(qū)BDNF、TrkB 陽性細胞 IOD值（±S）

組別 n 陽性細胞I O D值B D N F T r k B A組B組C組D組E組F P 8 8 8 8 8--3 7 0.0±1 4.5 6 3 6 2.0±1 2.6 3 3 3 4.9±1 9.6 8 2 5 0.5±1 8.3 2 2 4 1.8±1 1.8 0 1 5 3.1 1 7＜0.0 0 1 3 6 7.8±1 3.9 9 3 5 9.4±1 5.5 9 3 3 1.9±1 4.5 7 2 5 2.9±1 1.5 5 2 5 0.7±1 2.4 5 1 6 2.6 7 3＜0.0 0 1

圖2 各組大鼠海馬CA1區(qū)BDNF蛋白表達的情況（免疫組織化學(xué)染色 ×400）

圖3 各組大鼠海馬CA1區(qū)TrkB蛋白表達的情況（免疫組織化學(xué)染色 ×400）

圖4 不同處理組大鼠海馬CA1區(qū)BDNF及TrkB蛋白表達情況

表2 不同處理組幼年大鼠海馬CA1區(qū)BDNF、TrkB表達水平的比較

討 論

本課題組[6]在前期已經(jīng)建立不同磨牙缺失的幼年大鼠模型，并通過行為學(xué)實驗證實，隨著磨牙缺失數(shù)目變化，大鼠出現(xiàn)不同程度的認知功能障礙。大鼠的海馬區(qū)是高級神經(jīng)活動的重要部位，神經(jīng)元是構(gòu)成神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的基本單位。神經(jīng)元的缺失與認知功能的衰退密切相關(guān)，其大量缺失會導(dǎo)致空間記憶能力的減弱[7，8]。流行病學(xué)調(diào)查顯示牙齒缺失是阿爾茨海默病的危險因素之一[9]。磨牙缺失后口腔咀嚼效率降低甚至喪失，直接影響大腦的血流量和供氧水平，且減弱了大腦前葉區(qū)皮質(zhì)的活躍程度，最終導(dǎo)致海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的變化，從而對大腦學(xué)習、記憶產(chǎn)生不良影響。與此同時，研究表明BDNF及其受體TrkB在學(xué)習和記憶中扮演著關(guān)鍵角色。首先，應(yīng)激可誘導(dǎo)大腦中樞BDNF及其受體TrkB蛋白水平表達明顯下降，進而可引起與焦慮等密切相關(guān)的大腦邊緣系統(tǒng)結(jié)構(gòu)（如海馬、前額葉皮質(zhì)）萎縮，最終導(dǎo)致抑郁的發(fā)生[10，11]；其次，在認知功能障礙性疾病中，BDNF及其受體TrkB合成和分泌過程及其功能都受到明顯影響[12]。在此基礎(chǔ)上，本實驗深入研究磨牙缺失對幼年大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元及BDNF、TrkB蛋白表達的影響。

本實驗中利用HE染色法觀察對比海馬神經(jīng)細胞組織形態(tài)。在6、9、12顆磨牙缺失組（C組、D組、E組）中大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞皆出現(xiàn)嚴重的病理性改變，而3顆磨牙缺失組（B組）并未發(fā)生明顯改變，將C組、D組、E組實驗結(jié)果與正常對照組（A組）對比后，得出結(jié)論較多數(shù)目的磨牙缺失會造成大鼠海馬神經(jīng)元損傷，此結(jié)論與其他學(xué)者[7，8]的研究結(jié)果一致。觀察實驗結(jié)果可知，海馬對磨牙缺失較敏感。在磨牙缺失因素的作用下，一方面海馬神經(jīng)元數(shù)量減少、形態(tài)異?；蚬δ苁д{(diào)，種種變化直接影響中樞神經(jīng)遞質(zhì)的合成、釋放和信息的傳遞，從而影響神經(jīng)系統(tǒng)功能；另一方面磨牙缺失致使發(fā)育期的大鼠海馬神經(jīng)組織細胞發(fā)生凋亡，神經(jīng)細胞的凋亡或壞死會導(dǎo)致海馬神經(jīng)元大量丟失。據(jù)此分析，海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的變化將會造成大鼠空間學(xué)習記憶功能的損害[13，14]。實驗過程同時采用免疫組化法觀察BDNF及其受體TrkB蛋白的表達量。實驗得出數(shù)據(jù)：正常對照組（A組）的表達量最高，隨著磨牙缺失數(shù)量的增加，BDNF及其受體TrkB蛋白的表達量逐漸減少，而在6、9、12顆磨牙缺失組（C組、D組、E組）中，其表達量的減少尤為顯著（P＜0.01），這與其他學(xué)者的描述[5，15]基本一致。由此可見，磨牙缺失會引起大鼠的咀嚼功能減弱甚至消失，同時對大鼠海馬的咀嚼刺激減弱，引起海馬神經(jīng)元萎縮凋亡，導(dǎo)致BDNF及其受體TrkB合成分泌減少。這兩種因子的缺乏或功能異常是導(dǎo)致焦慮、學(xué)習記憶功能障礙等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的原因之一，研究顯示改變小鼠磨牙區(qū)長期咀嚼的刺激會增加小鼠焦慮情緒[16]。大鼠海馬神經(jīng)組織形態(tài)學(xué)上的此種損傷及BDNF、TrkB蛋白表達的變化，與磨牙缺失后大鼠海馬區(qū)神經(jīng)組織細胞發(fā)生凋亡以及大鼠行為學(xué)的變化是一致的[6，14]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)較多數(shù)目的磨牙缺失會對幼年大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷及BDNF、TrkB蛋白的表達會產(chǎn)生明顯的影響，同時也證實了磨牙缺失對腦部物質(zhì)代謝的影響。這些神經(jīng)元及BDNF、TrkB蛋白表達的異?？赡苷T導(dǎo)與學(xué)習記憶功能障礙相關(guān)的多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病。筆者通過磨牙缺失對幼年大鼠海馬組織影響的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，磨牙缺失對于情緒和學(xué)習記憶能力的影響是顯著的。加強磨牙缺失的預(yù)防和修復(fù)對于人類的焦慮、阿爾茲海默癥等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的影響尚未可知，仍需后續(xù)研究。

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