盧延旭 王飛虎 王 鵬 解 勛 王軍威

（1 中國(guó)刑事警察學(xué)院法醫(yī)學(xué)系 遼寧 沈陽(yáng) 110035；2 樺甸市公安司法鑒定中心 吉林 吉林 132400）

1 引言

頭孢類抗生素是目前臨床上應(yīng)用最廣泛的抗生素類藥物之一，有關(guān)該類藥物嚴(yán)重不良反應(yīng)的報(bào)告數(shù)量也連續(xù)兩年排名首位[1]，其中最嚴(yán)重的不良反應(yīng)是過(guò)敏性休克[2]。已有研究資料表明：頭孢類藥物的降解產(chǎn)物R1側(cè)鏈為過(guò)敏反應(yīng)的半抗原，其與蛋白結(jié)合形成完全抗原，引起嚴(yán)重的過(guò)敏性休克。據(jù)此，本研究成功建立了豚鼠頭孢類藥物過(guò)敏死亡模型，同時(shí)選取了I型變態(tài)反應(yīng)中比較特異的類糜蛋白酶、類胰蛋白酶和TNF-α三項(xiàng)免疫學(xué)學(xué)指標(biāo)，采用ELISA法和免疫組織化學(xué)的方法，考察了該3項(xiàng)指標(biāo)在過(guò)敏死亡豚鼠死后0～72h內(nèi)血清和組織中的水平或表達(dá)，為頭孢類藥物過(guò)敏死亡的法醫(yī)學(xué)鑒定提供參考性診斷指標(biāo)。

2 材料與方法

2.1 試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)試劑：注射用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉（哈藥集團(tuán)制藥總廠，產(chǎn)品批號(hào)：A1502202-2）；牛血清白蛋白；PBS緩沖液；類胰蛋白酶、類糜蛋白酶、TNF-α ELISA試劑盒（上海朗頓生物技術(shù)有限公司）；類糜蛋白酶一抗、SP試劑盒（博奧森生物技術(shù)有限公司）。

實(shí)驗(yàn)儀器：BIO-RAD MODEL 550酶標(biāo)儀；LeicaAperioAT2高通量快速玻片掃描儀。

2.2 方法

2.2.1 豚鼠過(guò)敏死亡模型的建立

分組：健康清潔級(jí)遠(yuǎn)交系雄性豚鼠120只，體重在150～200g（由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供）。將上述120只健康豚鼠，隨機(jī)分為2組，磷酸鹽緩沖液（PBS）對(duì)照組40只、頭孢菌素過(guò)敏死亡（實(shí)驗(yàn)）組80只。每組按時(shí)間點(diǎn)分4小組：死后即刻（0h）組、死后24h組、死后48h組和死后72h組，其中對(duì)照組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)10只，實(shí)驗(yàn)組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)20只。

過(guò)敏原的制備：稱取牛血清白蛋白（BSA）1.2g溶于60mL 0.1M磷酸鹽緩沖液（PBS）中，再加入頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉2.4g，之后用1mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至10～11，于37℃水浴鍋內(nèi)放置120min，得到過(guò)敏原溶液。調(diào)節(jié)該溶液pH至7.5，于4℃冰箱冷藏備用。

給藥：取上述過(guò)敏原溶液10mL，用PBS稀釋5倍，作為致敏和激發(fā)溶液。于d1、d3、d5分別給每只實(shí)驗(yàn)組豚鼠腹腔注射0.5mL該溶液致敏，同步給每只對(duì)照組豚鼠腹腔注射等量的0.1M PBS溶液。d20給實(shí)驗(yàn)組豚鼠心臟注射上述過(guò)敏原溶液0.2mL/只，激發(fā)豚鼠過(guò)敏性休克，觀察癥狀并記錄死亡時(shí)間。同步給PBS對(duì)照組豚鼠心臟注射同容量的0.1M PBS溶液。頸動(dòng)脈放血處死對(duì)照組豚鼠。死亡即刻組即0h組豚鼠死后立刻取血取組織，其他時(shí)間組豚鼠尸體4℃冷藏保存，并在各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取血取組織。

2.2.2 組織病理學(xué)觀察與免疫學(xué)檢測(cè)

HE染色：按死后各時(shí)間點(diǎn)提取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組豚鼠的心、肝、脾、肺、氣管、腎等組織，4%甲醛固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，常規(guī)HE染色，供組織病理學(xué)觀察。

免疫組織化學(xué)（SP法）：采用SP試劑盒法，檢測(cè)兩組豚鼠死后第72h心、肝、肺、腎等多器官組織中類糜蛋白酶的表達(dá)。

ELISA采用ELISA試劑盒法，分別檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組豚鼠死后0～72h血清和肺、氣管組織勻漿上清液中類糜蛋白酶、類胰蛋白酶、TNF-α的含量。

2.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 22.0軟件處理，采用t檢驗(yàn)分析。

3 結(jié)果

3.1 死前癥狀與HE染色組織病理學(xué)切片

80只健康豚鼠在心臟注射給藥激發(fā)后，均出現(xiàn)豎毛、自發(fā)活動(dòng)減少、行走不穩(wěn)、對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍等癥狀，繼而呼吸困難、口鼻發(fā)紺、抽搐，二便失禁，最后死亡。有73只豚鼠在給藥激發(fā)后10min內(nèi)死亡，30min內(nèi)實(shí)驗(yàn)組豚鼠全部死亡，死亡率100%。正常對(duì)照組40只豚鼠在觀察期內(nèi)均未出現(xiàn)異常癥狀。

解剖死亡豚鼠見多數(shù)豚鼠喉頭水腫、肺臟淤血腫脹、氣管內(nèi)有粘液分泌。鏡下見氣管、支氣管擴(kuò)張淤血，心、肝、肺、腎等多器官淤血水腫（圖1a、圖2a、圖3a、圖4a），其中在肺臟中可見大量炎性細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)（圖3a）。對(duì)照組豚鼠均未見明顯病理改變（圖1b、圖2b、圖3b、圖4b）。

圖1 頭孢菌素過(guò)敏死亡豚鼠心肌細(xì)胞改變

圖2 頭孢菌素過(guò)敏死亡豚鼠肝組織改變

圖3 頭孢菌素過(guò)敏死亡豚鼠肺組織改變

圖4 頭孢菌素過(guò)敏死亡豚鼠腎組織改變

3.2 免疫組化檢測(cè)結(jié)果

與對(duì)照組相比，肥大細(xì)胞類糜蛋白酶在過(guò)敏死亡豚鼠肺和氣管中大量表達(dá)。其陽(yáng)性表現(xiàn)為肥大細(xì)胞胞漿及周邊小范圍內(nèi)特異性棕黃色染色，主要分布于肺泡間質(zhì)及肺小血管周圍（圖5a），以及氣管粘膜下層疏松結(jié)締組織中（圖6a），而在對(duì)照組中未見類糜蛋白酶陽(yáng)性表達(dá)（圖5b、圖6b）。在兩組豚鼠心臟、肝、腎、脾等組織中均未檢出類糜蛋白酶陽(yáng)性表達(dá)。

圖5 頭孢菌素過(guò)敏死亡豚鼠肺組織中類糜蛋白酶陽(yáng)性表達(dá)

圖6 頭孢菌素過(guò)敏死亡豚鼠肺氣管中類糜蛋白酶陽(yáng)性表達(dá)

3.3 ELISA檢測(cè)結(jié)果

3.3.1 血清

與對(duì)照組相比較，實(shí)驗(yàn)組豚鼠死后即刻血清中類糜蛋白酶、類胰蛋白酶和TNF-α水平均顯著升高。72h內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組豚鼠血清中類糜蛋白酶含量變化不大（見表1）；類胰蛋白酶在豚鼠死后48h內(nèi)血清中的含量基本不變，在72h組過(guò)敏死亡豚鼠血清中，類胰蛋白酶含量有所下降，但與對(duì)照組相比仍有顯著差異（見表2）；TNF-α在過(guò)敏死亡豚鼠血清中的含量呈下降趨勢(shì)，72h已降至正常水平（見表3）。

表1 頭孢菌素過(guò)敏死亡組血清中類糜蛋白酶的含量變化（實(shí)驗(yàn)組n=20，對(duì)照組n=10,±s,ng/L）

表1 頭孢菌素過(guò)敏死亡組血清中類糜蛋白酶的含量變化（實(shí)驗(yàn)組n=20，對(duì)照組n=10,±s,ng/L）

注：?為與對(duì)照組相比，P＜0.05。

組別 0h 24h 48h 72h實(shí)驗(yàn)組 993±100* 875±183* 1029±195* 935±140*對(duì)照組 182±69 192±78 190±72 174±69

表2 頭孢菌素過(guò)敏死亡組血清中類胰蛋白酶的含量變化（實(shí)驗(yàn)組n=20，對(duì)照組n=10,±s,ng/L）

表2 頭孢菌素過(guò)敏死亡組血清中類胰蛋白酶的含量變化（實(shí)驗(yàn)組n=20，對(duì)照組n=10,±s,ng/L）

注：?為與對(duì)照組相比，P＜0.05。

組別 0h 24h 48h 72h實(shí)驗(yàn)組 1911±317* 2057±243* 2088±285* 1594±283*對(duì)照組 614±170 649±145 628±114 549±93

表3 頭孢菌素過(guò)敏死亡組血清中TNF-α的含量變化（實(shí)驗(yàn)組n=20，對(duì)照組n=10,±s,ng/L）

表3 頭孢菌素過(guò)敏死亡組血清中TNF-α的含量變化（實(shí)驗(yàn)組n=20，對(duì)照組n=10,±s,ng/L）

注：?為與對(duì)照組相比，P＜0.05；△為與對(duì)照組相比，P＞0.05。

組別 0h 24h 48h 72h實(shí)驗(yàn)組 179.952±51.476*130.642±36.635*78.479±29.872* 28.938±9.870△對(duì)照組 21.920±11.975 28.673±8.741 26.032±9.817 31.596±10.970

3.3.2 氣管

與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組豚鼠死后即刻氣管中類糜蛋白酶、類胰蛋白酶和TNF-α含量均顯著升高。類糜蛋白酶和類胰蛋白酶在過(guò)敏死亡豚鼠氣管中72h內(nèi)的含量基本不變（見表4、表5）；TNF-α含量呈下降趨勢(shì)，但在72h時(shí)仍顯著高于對(duì)照組水平（見表6）。

表4 頭孢菌素過(guò)敏死亡組氣管中類糜蛋白酶的含量變化（實(shí)驗(yàn)組n=20，對(duì)照組n=10,±s,ng/L）

表4 頭孢菌素過(guò)敏死亡組氣管中類糜蛋白酶的含量變化（實(shí)驗(yàn)組n=20，對(duì)照組n=10,±s,ng/L）

注：?為與對(duì)照組相比，P＜0.05。

組別 0h 24h 48h 72h實(shí)驗(yàn)組 616±138* 624±135* 592±118* 584±156*對(duì)照組 133±56 127±46 135±50 144±42

表5 頭孢菌素過(guò)敏死亡組氣管中類胰蛋白酶的含量變化（實(shí)驗(yàn)組n=20，對(duì)照組n=10,±s,ng/L）

表5 頭孢菌素過(guò)敏死亡組氣管中類胰蛋白酶的含量變化（實(shí)驗(yàn)組n=20，對(duì)照組n=10,±s,ng/L）

注：?為與對(duì)照組相比，P＜0.05

組別 0h 24h 48h 72h實(shí)驗(yàn)組 1627±297* 1556±318* 1504±298* 1434±301*對(duì)照組 472±146 402±122 437±123 417±112

表6 頭孢菌素過(guò)敏死亡組氣管中TNF-α的含量變化（實(shí)驗(yàn)組n=20，對(duì)照組n=10,±s,ng/L）

表6 頭孢菌素過(guò)敏死亡組氣管中TNF-α的含量變化（實(shí)驗(yàn)組n=20，對(duì)照組n=10,±s,ng/L）

注：?為與對(duì)照組相比，P＜0.05

組別 0h 24h 48h 72h實(shí)驗(yàn)組 162.370±46.834*131.116±33.335*99.573±28.958* 63.846±21.592*對(duì)照組 23.204±7.035 22.647±9.535 21.975±9.372 23.058±10.340

3.3.3 肺

與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組豚鼠死后即刻肺組織中類糜蛋白酶、類胰蛋白酶和TNF-α含量明顯升高。其中類糜蛋白酶在過(guò)敏死亡豚鼠肺組織中72h內(nèi)的含量基本不變（見表7）；類胰蛋白酶含量在48h內(nèi)保持穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)組72h組肺組織中類胰蛋白酶含量略有下降，但和對(duì)照組水平相比仍有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（見表8）；TNF-α含量呈下降趨勢(shì)，但在72h時(shí)仍顯著高于對(duì)照組水平（見表9）。

表7 頭孢菌素過(guò)敏死亡組肺組織中類糜蛋白酶的含量變化（實(shí)驗(yàn)組n=20，對(duì)照組n=10,±s,ng/L）

表7 頭孢菌素過(guò)敏死亡組肺組織中類糜蛋白酶的含量變化（實(shí)驗(yàn)組n=20，對(duì)照組n=10,±s,ng/L）

注：?為與對(duì)照組相比，P＜0.05。

組別 0h 24h 48h 72h實(shí)驗(yàn)組 699±222* 744±189* 673±275* 669±211*對(duì)照組 139±49 142±56 121±52 124±43

表8 頭孢菌素過(guò)敏死亡組肺組織中類胰蛋白酶的含量變化（實(shí)驗(yàn)組n=20，對(duì)照組n=10,±s,ng/L）

表8 頭孢菌素過(guò)敏死亡組肺組織中類胰蛋白酶的含量變化（實(shí)驗(yàn)組n=20，對(duì)照組n=10,±s,ng/L）

注：?為與對(duì)照組相比，P＜0.05。

組別 0h 24h 48h 72h實(shí)驗(yàn)組 1730±259* 1688±282* 1647±230* 1514±277*對(duì)照組 639±185 627±172 649±225 587±176

表9 頭孢菌素過(guò)敏死亡組肺組織中TNF-α的含量變化（實(shí)驗(yàn)組n=20，對(duì)照組n=10,±s,ng/L）

表9 頭孢菌素過(guò)敏死亡組肺組織中TNF-α的含量變化（實(shí)驗(yàn)組n=20，對(duì)照組n=10,±s,ng/L）

注：?為與對(duì)照組相比，P＜0.05。

組別 0h 24h 48h 72h實(shí)驗(yàn)組 168.582±48.943*127.180±34.532*92.482±36.796* 51.428±18.039*對(duì)照組 24.530±10.873 23.409±10.247 22.977±11.817 26.056±12.643

4 討論

本研究成功建立了豚鼠頭孢類藥物過(guò)敏死亡模型，并采用ELISA法和免疫組織化學(xué)法，考察了類胰蛋白酶、類糜蛋白酶和TNF-α等三項(xiàng)指標(biāo)在過(guò)敏死亡豚鼠死后0～72h內(nèi)血清、肺和氣管中的含量或表達(dá)。因頭孢類藥物的過(guò)敏機(jī)制與Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)中肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞的活化和脫顆粒有關(guān)，上述指標(biāo)屬于肥大細(xì)胞脫顆粒的產(chǎn)物。在以往的研究中[3-5]，均側(cè)重于檢測(cè)類胰蛋白酶、類糜蛋白酶等指標(biāo)在血清中的含量，很少有學(xué)者研究這些指標(biāo)在機(jī)體過(guò)敏死后組織中的表達(dá)或含量變化情況。TNF-α也是肥大細(xì)胞脫顆粒所釋放的炎性介質(zhì)之一，同時(shí)它又是重要的炎癥瀑布反應(yīng)的源頭，參與了頭孢類藥物過(guò)敏死亡的過(guò)程。

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，類胰蛋白酶和類糜蛋白酶在實(shí)驗(yàn)組血清、肺、氣管中含量明顯升高（P＜0.05），且在豚鼠死后72h內(nèi)，類糜蛋白酶含量基本保持不變，血清中類胰蛋白酶含量在72h組有所下降，但較對(duì)照組仍有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。該結(jié)果說(shuō)明這兩項(xiàng)指標(biāo)在尸體中不易被分解，具有較高的穩(wěn)定性。TNF-α在過(guò)敏死亡豚鼠血清、肺和氣管中的起始含量較對(duì)照組明顯增高，但呈下降趨勢(shì)。在豚鼠死后72h，血清中TNF-α含量降至對(duì)照組水平（P＞0.05），而肺和氣管中TNF-α含量與對(duì)照組相比仍有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。說(shuō)明肺和氣管中TNF-α不易被分解，同時(shí)也提示在實(shí)際檢案中，血清中TNF-α含量應(yīng)盡早檢測(cè)。由于每項(xiàng)生物化學(xué)指標(biāo)的含量變化都受到幾種因素的影響，所以，建議綜合運(yùn)用上述指標(biāo)，確保人頭孢菌素類藥物過(guò)敏死亡案件的鑒定結(jié)果正確無(wú)誤。

類糜蛋白酶的免疫組織學(xué)觀察結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，過(guò)敏死后72h的豚鼠肺和氣管中表達(dá)明顯增多，而在心、肝、脾、腎等組織中未檢見陽(yáng)性表達(dá)，說(shuō)明頭孢類藥物引起過(guò)敏性休克時(shí)主要損害器官是肺臟。本次免疫組化所用組織為豚鼠死后冷藏72h后所取，在肺和氣管中仍檢見高表達(dá)，說(shuō)明類糜蛋白酶的活性在肺和氣管組織中較穩(wěn)定，不易受到腐敗等因素的影響。提示類糜蛋白酶在過(guò)敏死亡機(jī)體肺和氣管中的高表達(dá)，可以作為鑒定此類案件的一項(xiàng)較客觀的依據(jù)。

上述研究結(jié)果提示，類糜蛋白酶、類胰蛋白酶和TNF-α在頭孢類藥物過(guò)敏死亡法醫(yī)學(xué)鑒定中具有重要價(jià)值，可以作為頭孢類藥物過(guò)敏致死案件鑒定的參考性診斷指標(biāo)。另外，本研究對(duì)組織中上述指標(biāo)的含量或表達(dá)的考察具有重要實(shí)踐意義。與以往重點(diǎn)檢測(cè)相關(guān)免疫學(xué)指標(biāo)在血清中含量情況相比較，組織中尤其是氣管中的免疫學(xué)指標(biāo)不易受腐敗等因素影響，具有更高的穩(wěn)定性和可靠性；在尸體血液已經(jīng)喪失檢驗(yàn)條件或者尸體已經(jīng)被處理的此類案件中，采用免疫組織化學(xué)的方法考察肺和氣管中類糜蛋白酶的表達(dá)情況具有重要診斷價(jià)值；采用免疫組化的方法對(duì)組織中免疫學(xué)指標(biāo)的考察同樣適用于冰凍組織或陳舊石蠟切片，為此類案件的重新鑒定或回顧性研究指明了方向。

本研究考察了過(guò)敏死亡豚鼠體內(nèi)相關(guān)免疫學(xué)指標(biāo)在0～72h內(nèi)的變化情況，在此基礎(chǔ)上，還需收集人頭孢類藥物過(guò)敏死亡的案例，進(jìn)行上述指標(biāo)的系統(tǒng)性考察。此外，在實(shí)際檢案中，有很多尸體不能被及時(shí)檢驗(yàn)，尚需增加考察人過(guò)敏死亡72h后，上述免疫學(xué)指標(biāo)的變化規(guī)律。本實(shí)驗(yàn)豚鼠尸體保存條件為冷藏保存，有研究[6]表明保存尸體的條件會(huì)對(duì)尸體血清中IgE、類胰蛋白酶含量有影響，提示在高度懷疑人頭孢類藥物過(guò)敏死亡時(shí)，應(yīng)對(duì)尸體盡早冷藏或冷凍保存并盡早進(jìn)行尸體檢驗(yàn)。

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