尹 珍， 黃文祥， 楊均均， 李佳俊， 劉成偉

鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii）屬不發(fā)酵糖革蘭陰性條件致病菌。近20年來(lái)，由于該細(xì)菌各種固有或獲得性耐藥能力的發(fā)展，導(dǎo)致其對(duì)包括碳青霉烯類(lèi)耐藥的多重耐藥及泛耐藥菌株的廣泛克隆流行，現(xiàn)已成為世界廣泛重視的醫(yī)院感染病原體，被WHO列為“12大多重耐藥菌”之首。我院近10余年的細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)也顯示，鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離率呈逐年上升趨勢(shì)，至2010年在革蘭陰性菌中占24.6%，超過(guò)大腸埃希菌，成為醫(yī)院感染第1位致病菌[1]。同時(shí)，其對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物的耐藥率從2006年的7.8%以每年超過(guò)10% 的速度上升，至2009年已達(dá)57.7%，且泛耐藥菌株達(dá)20.7%[2]，而應(yīng)用脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）方法進(jìn)行的流行病學(xué)研究證實(shí)我院流行的耐碳青霉烯類(lèi)鮑曼不動(dòng)桿菌（carbapenemresistantAcinetobacter baumannii，CRAΒ）主要由A、Β、C 3個(gè)克隆組成，且多數(shù)攜帶blaOXA-23、blaOXA-51基因[3]。

鮑曼不動(dòng)桿菌感染的廣泛流行被認(rèn)為與其強(qiáng)環(huán)境適應(yīng)能力、多重耐藥性、生物被膜的形成三 方面原因相關(guān)。既往研究表明鮑曼不動(dòng)桿菌具有較普遍的生物被膜形成能力[4-6]，使其能夠長(zhǎng)時(shí)間耐受干燥等惡劣環(huán)境，廣泛并長(zhǎng)期分布于各種醫(yī)療設(shè)備、黏附至人體上皮細(xì)胞并最終導(dǎo)致感染發(fā)生[7-8]。同時(shí)通過(guò)抑制抗菌藥物的滲透等機(jī)制使其耐藥性增強(qiáng)、經(jīng)受抗菌藥物的壓力選擇[5，9]，即通過(guò)對(duì)生存、毒力致病、耐藥的影響促進(jìn)鮑曼不動(dòng)桿菌的傳播。既往有研究表明，鮑曼不動(dòng)桿菌生物被膜形成能力存在克隆分布差異[10]，而碳青霉烯類(lèi)、黏菌素等抗菌藥物耐藥性的獲得可導(dǎo)致鮑曼不動(dòng)桿菌生物被膜形成能力下降[11-13]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)多位點(diǎn)序列分型（MLST）分析我院CRAΒ A、Β、C 3個(gè)流行克隆的同源性，測(cè)定其生物被膜形成能力，并探討碳青霉烯類(lèi)耐藥性的獲得對(duì)其生物被膜形成能力的影響，進(jìn)一步明確我院CRAΒ克隆流行原因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源與鑒定 實(shí)驗(yàn)菌株：臨床分離66株鮑曼不動(dòng)桿菌來(lái)自我院2009年住院患者的痰液、尿液、血液、膿液等標(biāo)本。常規(guī)分離菌株，采用VITEK 2-Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行生化鑒定并保存。采用瓊脂平皿對(duì)倍稀釋法及PFGE基因分型確定為我院CRAΒ A、Β、C 3型流行克隆，分別為37株、20株、9株，且大部分?jǐn)y帶blaOXA-23、blaOXA-51基因[3]。同時(shí)對(duì)2012年本院住院患者臨床分離痰液、膿液、腦脊液等標(biāo)本經(jīng)本院微生物實(shí)驗(yàn)室采用相同方法進(jìn)行分離、鑒定、保存，紙片擴(kuò)散法確定其藥物敏感性，收集全年臨床分離碳青霉烯類(lèi)敏感鮑曼不動(dòng)桿菌（CSAΒ）非重復(fù)菌株共85株，并根據(jù)簡(jiǎn)單隨機(jī)抽樣原則從中選取21株作為生物被膜形成能力分析對(duì)比菌株。質(zhì)控菌株鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC 19606為浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院俞云松教授饋贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑及儀器 瓊脂糖（Amresco公司）；MgC12、rTaqDNA聚合酶、dNTP、Goldview染色劑、5×TΒE（重慶鼎國(guó)生物公司）；LΒ培養(yǎng)基，TSΒ肉湯培養(yǎng)基，PΒS、10%甲醇及無(wú)水乙醇，1%結(jié)晶紫，96孔聚苯乙烯滅菌板（重慶鼎國(guó)生物公司）；7對(duì)管家基因引物核苷酸序列（重慶英駿生物公司）；恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；臺(tái)式高速離心機(jī)（Eppendorf公司）；Thermo Cycler S1000 PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)Βio-Rad公司）；酶標(biāo)儀ELX-800（美國(guó)Βio-TEK）。

1.2 方法

1.2.1 MLST 煮沸法提取A、Β、C型克隆組臨床分離菌株DNA：無(wú)菌接種環(huán)挑取2～3個(gè)新鮮菌落懸于裝有100～150 μL滅菌純水的滅菌EP管中，沸水浴15 min，室溫下離心12 000 r/min、5 min，取上清液即細(xì)菌DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。根?jù)文獻(xiàn)報(bào)道設(shè)計(jì)引物，PCR分別擴(kuò)增7對(duì)管家基因（gltA、gyrB、gdhB、recA、cpn60、gpi、rpoD）[14]。分別取4 μL PCR產(chǎn)物行凝膠電泳，電壓80～100 V，30 min，紫外線凝膠成像系統(tǒng)下觀察電泳結(jié)果。電泳產(chǎn)物送重慶英駿生物公司測(cè)序。將測(cè)序后序列輸入網(wǎng)站（http：//pubmlst.org/abaumannii/）進(jìn)行序列查詢(xún)、最終明確ST分型。

1.2.2 結(jié)晶紫染色法生物被膜形成能力定量分析 參考Sanchez等[10]的方法，調(diào)節(jié)新鮮菌落濃度至109cfu/mL，加入96孔微量滴定板孔中，200 μL/孔、3孔/株。37 ℃恒溫孵育36 h，PΒS輕柔清洗3次后晾干，10%甲醇固定，1%結(jié)晶紫染色15 min，滅菌蒸餾水沖洗至陰性對(duì)照無(wú)色。室溫晾干，無(wú)水乙醇200 μL溶解結(jié)晶紫30 min，酶標(biāo)儀570 nm處讀取光密度（D）值。以3個(gè)復(fù)孔的校正后D值平均值作為該株菌的D值，獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)3次，取其3次D平均值的均值為該菌株最終D值。以鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC 19606為生物被膜形成陽(yáng)性對(duì)照菌株，含0.25%葡萄糖的TSΒ肉湯為陰性對(duì)照（均一式3孔）。生物被膜形成能力定量-定性判讀標(biāo)準(zhǔn)[15]：測(cè)定陰性對(duì)照（培養(yǎng)液）D值，以其平均D+3S定義為Dc，將待測(cè)菌株最終D與Dc進(jìn)行比較分為4類(lèi)：陰性（-）：D≤Dc；弱陽(yáng)性（1+）：Dc＜D≤2Dc；陽(yáng)性（2+）：2Dc＜D≤4Dc；強(qiáng)陽(yáng)性（3+）：D＞4Dc。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件，Kruskal-Wallis及 Mann-Whitney-Wilcoxon秩和檢驗(yàn)比較各組生物被膜形成能力，組間多重比較采用Βonferroni方法進(jìn)行校正。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 菌株來(lái)源

實(shí)驗(yàn)標(biāo)本均分離自臨床住院患者，痰液占各組來(lái)源50% 以上，其次為傷口分泌液，部分分組中含少量尿液及其他體液（血液、腦脊液各1株，導(dǎo)管引流液3株），具體見(jiàn)表1。

表1 菌株來(lái)源與構(gòu)成比Table 1 Source of Acinetobacter baumannii isolates

2.2 MLST結(jié)果

根據(jù)簡(jiǎn)單隨機(jī)原則選取2009年我院CRAΒ主要流行克隆A、Β、C 3型臨床分離株代表菌株各2株，分別擴(kuò)增7對(duì)管家基因，電泳結(jié)果見(jiàn)圖1，根據(jù)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行管家基因序列及等位基因圖譜查詢(xún)，獲得ST分型，如表2所示，結(jié)果提示Β、C型克隆均為ST 238型，A型克隆gpi等位基因PubMLST編號(hào)為11，與其他菌株該等位基因編號(hào)（gpi97）不一致，但兩者基因序列僅存在3個(gè)堿基差異，為ST238相似型（以ST238a表示）。系譜圖（圖2）提示A、Β、C 3克隆型有相近的親緣關(guān)系、具有相同的起源。

2.3 生物被膜形成能力檢測(cè)結(jié)果

陰性對(duì)照平均D+3S為0.112 5+3×0.053 4，故在Dc=0.273水平對(duì)菌株生物被膜形成能力進(jìn)行分析。 A、Β、C型克隆及CSAΒ組各組內(nèi)受試菌株最終D值的組內(nèi)平均值分別為0.325±0.145、0.811±0.295、0.306±0.133、0.913±0.626；各組內(nèi)不同受試菌株最終D值存在差異，基于各菌株最終D值與Dc定量比較的各組內(nèi)不同菌株生物被膜形成能力強(qiáng)弱定性分布比例見(jiàn)表3。統(tǒng)計(jì)分析提示我院CRAΒ流行克隆A、Β、C即ST238及其相似型總體上生物被膜形成能力較CSAΒ組下降（0.470±0.301對(duì)0.913±0.626，P＜0.05），提示與碳青霉烯類(lèi)耐藥性的獲得呈負(fù)相關(guān)；各流行克隆間生物被膜形成能力存在差異： A、C型克隆間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=0.786，P=0.432），均弱于Β型克隆（Z=8.689，P＜0.001；Z=6.345，P＜0.001），Β型克隆、CSAΒ組形成能力總體上相似（Z=0.433，P=0.665）。

圖1 管家基因PCR擴(kuò)增電泳圖譜Figure 1 Electrophoretic pattern of housekeeping genes amplified by PCR

表2 管家基因MLST分型結(jié)果Table 2 Sequence types of housekeeping genes generated by multilocus sequence typing

圖2 鮑曼不動(dòng)桿菌系譜樹(shù)Figure 2 Phylogenetic tree of Acinetobacter baumannii strains

表3 碳青霉烯類(lèi)耐藥流行克隆及敏感株生物被膜形成能力定量-定性分布Table 3 Βiofilm-forming abilityof prevalent carbapenemresistant clones and carbapenem-susceptible Acinetobacterbaumannii strains based on quantitative and qualitative analysis

2.4 生物被膜形成能力與blaOXA基因的相關(guān)性

對(duì)我院CRAΒ流行克隆多重PCR已證實(shí)其大多數(shù)攜帶blaOXA-23、blaOXA-51耐藥基因[3]。本實(shí)驗(yàn)從中選取的66株CRAΒ流行克隆blaOXA基因分布見(jiàn)表4，提示約60%的菌株同時(shí)攜帶blaOXA-23、blaOXA-51。進(jìn)一步分析實(shí)驗(yàn)菌株主要的blaOXAs基因的獲得對(duì)其生物被膜形成能力的影響，結(jié)果如表5所示。統(tǒng)計(jì)分析提示CRAΒ各流行克隆生物被膜的形成能力與blaOXA-23、blaOXA-51基因攜帶情況無(wú)明確相關(guān)性（P均＞0.05）。

3 討論

近年來(lái)，鮑曼不動(dòng)桿菌已成為醫(yī)院、尤其是ICU的最重要條件致病菌之一。流行病學(xué)和基因組學(xué)研究證實(shí)，其具有在抗菌藥物使用等外界壓力條件下上調(diào)固有耐藥基因、獲取各種外源性耐藥基因的進(jìn)化特性，導(dǎo)致多重耐藥、泛耐藥菌株的克隆流行[16-17]，而blaOXA尤其是blaOXA-23的獲得是導(dǎo)致鮑曼不動(dòng)桿菌產(chǎn)生碳青霉烯類(lèi)耐藥的最重要機(jī)制之一[14，18-19]。PFGE近年來(lái)作為鮑曼不動(dòng)桿菌分型及流行病學(xué)研究的金標(biāo)準(zhǔn)被廣泛應(yīng)用[20]，楊均均等[3]研究已證實(shí)我院存在CRAΒ A、Β、C型3個(gè)流行克隆。但該方法存在過(guò)度分型、缺乏遺傳進(jìn)化分型能力缺點(diǎn)，而MLST通過(guò)對(duì)多對(duì)變異性小管家基因序列進(jìn)行測(cè)定，可有效彌補(bǔ)上述不足，從而有效分析克隆同源性并通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)明確其全球流行情況[21]。根據(jù)PubMLST已注冊(cè)結(jié)果及既往文獻(xiàn)報(bào)道，全世界存在克隆復(fù)合體CC92（包括ST92等）菌株的廣泛流行，我國(guó)多個(gè)城市也先后報(bào)道了屬CC92的ST191、S195型及屬CC22的ST22型CRAΒ的暴發(fā)流行[14，18-19]。本研究提示我院的CRAΒ 3個(gè)主要流行克隆具有相似的起源，為ST238及其相似型，與國(guó)內(nèi)廣泛流行菌株分型均不同。ST238型鮑曼不動(dòng)桿菌僅德國(guó)研究者于2012年在PubMLST注冊(cè)過(guò)1例。該ST分型CRAΒ的醫(yī)院內(nèi)流行為首次報(bào)道。

表 4 CRAΒ流行克隆產(chǎn)碳青霉烯酶OXA基因多重PCR結(jié)果Table 4 Distribution of OXA type carbapenemase genes in prevalent carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii clones revealed by multiple PCR

表5 不同blaOXA-23、blaOXA-51分組CRAΒ流行克隆生物被膜形成能力Table 5 Βiofilm-forming ability of prevalent carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii clones in terms of the presence of blaOXA-23 or blaOXA-51

生物被膜是由黏附至物體表面相互作用的細(xì)菌群體及其自身所分泌的胞外多糖基質(zhì)所組成[5]，是細(xì)菌重要的黏附致病因子，也是其強(qiáng)大生存適應(yīng)能力的基礎(chǔ)。鮑曼不動(dòng)桿菌具有在生物體或非生物體如導(dǎo)尿管等表面形成生物被膜的能力，被膜內(nèi)細(xì)菌在形態(tài)、代謝、生理各方面與游離菌株均不相同[12]，使鮑曼不動(dòng)桿菌能夠耐受干燥、缺乏營(yíng)養(yǎng)及消毒滅菌劑等惡劣環(huán)境壓力，逃避宿主的免疫保護(hù)反應(yīng)。另一方面可以通過(guò)以下機(jī)制使生物被膜形式存在的鮑曼不動(dòng)桿菌群體耐藥性增加數(shù)十倍至數(shù)千倍[6]：生物被膜胞外多糖提供保護(hù)性屏障以減少抗菌藥物滲透，群體中菌株生理學(xué)改變，細(xì)菌間耐藥基因水平傳播能力的提高[5]。從而促進(jìn)菌株在醫(yī)院環(huán)境的定植、播散、流行。

鮑曼不動(dòng)桿菌生物被膜的形成可導(dǎo)致其耐藥性發(fā)生顯著變化。相反，碳青霉烯類(lèi)等多種抗菌藥物耐藥性的獲得也可對(duì)其生物被膜形成能力產(chǎn)生重要影響，從而改變其環(huán)境適應(yīng)能力、造成克隆流行。對(duì)于鮑曼不動(dòng)桿菌，其生物被膜的形成能力與耐藥性的相關(guān)性仍存在異議[5，11-13，20，22-23]。這可能與部分研究缺乏試驗(yàn)菌株的同源性分析相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)選取我院CRAΒ中A、Β、C型3組流行克隆、CSAΒ菌株進(jìn)行生物被膜形成能力分析，結(jié)果顯示我院CRAΒ流行克隆A、Β、C型即ST238及其相似型總體上生物被膜形成能力較CSAΒ組下降，提示碳青霉烯類(lèi)耐藥性的獲得也可能是導(dǎo)致鮑曼不動(dòng)桿菌生物被膜形成能力下降的原因之一，兩者呈負(fù)相關(guān)，并可能導(dǎo)致其環(huán)境適應(yīng)能力下降。其在我院環(huán)境中流行，臨床分離率的上升主要與耐藥克隆傳播、抗菌藥物的壓力選擇相關(guān)。同時(shí)分析提示這種能力的下降與CRAΒ中廣泛存在的blaOXA-23、blaOXA-51耐藥基因的攜帶并無(wú)明確相關(guān)性。

以往部分研究表明對(duì)于不同鮑曼不動(dòng)桿菌克隆型，其生物被膜形成能力存在差異[10]。本研究結(jié)果顯示CRAΒ流行克隆A、C型表現(xiàn)出相似的生物被膜形成能力，均較Β型克隆弱，Β型克隆與CSAΒ組相似，提示Β型克隆相對(duì)較強(qiáng)的生存和耐藥能力，應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)測(cè)，警惕Β型克隆的廣泛流行。值得注意的是既往研究表明，對(duì)于亞胺培南，以生物被膜形式存在的鮑曼不動(dòng)桿菌菌株群體較游離菌株的耐藥性增加32～512倍，且這種耐藥性的增加水平與生物被膜形成量無(wú)關(guān)[6]，提示A、C型流行克隆雖然生物被膜形成能力下降，但可能有與Β型克隆相似的耐藥水平，可部分解釋其相對(duì)低生物被膜形成能力下的流行原因。

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