王 威，何曉璇，仝曉寧，劉 哲，鄧 凱，王 剛

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，西安 710061)

活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)可以反映內(nèi)源性凝血途徑和(或)共同途徑的因子缺乏，并且在多因子缺乏或者明顯的單因子缺乏時(shí)表現(xiàn)為時(shí)間延長(zhǎng)，但當(dāng)因子缺乏時(shí)，APTT是否延長(zhǎng)及延長(zhǎng)的程度取決于APTT試劑對(duì)內(nèi)源性凝血因子的敏感性。不同的APTT試劑對(duì)內(nèi)源性凝血因子的敏感性不同，這種差異不僅來源于APTT試劑所采用的激活劑以及磷脂種類的不同，還來源于試劑各組分的濃度差異[1-2]。那么，實(shí)驗(yàn)室如何評(píng)估APTT試劑對(duì)內(nèi)源性凝血因子FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ的敏感性，如何做到標(biāo)準(zhǔn)化評(píng)估操作，臨床如何應(yīng)用因子敏感性不同的試劑，這些均是實(shí)驗(yàn)室亟待解決的問題。美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)在H47-A2文件中將APTT試劑敏感性定義為APTT升高到已建立的正常參考區(qū)間上限時(shí)的因子水平[3]。在我國，實(shí)驗(yàn)室工作人員已注意到不同品牌的APTT試劑對(duì)同一份標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果不盡相同，但很少深究造成差異的原因，以及這種差異可能導(dǎo)致的臨床后果[4-5]。國內(nèi)前期研究中，雖然評(píng)估了不同APTT試劑的因子敏感性，但并未給出詳細(xì)的定量的內(nèi)源性因子敏感性結(jié)果[1]。本研究采用CLSI提供的APTT試劑敏感性的評(píng)估方法，量化評(píng)估本實(shí)驗(yàn)室可獲得的4種不同APTT試劑的因子敏感性，分析其不同的臨床適用范圍，以及H47-A2未提及的FⅫ對(duì)APTT結(jié)果的影響，期望篩選出適用于術(shù)前篩查及單因子缺乏患者篩查的試劑。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 儀器：日本Sysmex CS5100全自動(dòng)血凝儀；法國恩塔高(STAGO)-R全自動(dòng)血凝儀。試劑A：APTT測(cè)定試劑盒(CS-5100適用)，上海太陽生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，接觸激活物為鞣花酸；試劑B：APTT測(cè)定試劑盒(STAGO適用)，上海太陽生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，接觸激活物為白陶土；試劑C：APTT測(cè)定試劑盒(Siemens Dade Actin)，西門子(Siemens)生產(chǎn)，接觸激活物為鞣花酸；試劑D：APTT測(cè)定試劑盒(STAO?-PTTA)，STAGO公司生產(chǎn)，接觸激活物為硅土。4種APTT試劑組分中所含的磷脂種類均為兔腦磷脂。所有APTT試劑的說明書均注明適用于相關(guān)儀器。CaCl2來自于相應(yīng)的APTT試劑廠家，濃度均為0.025 mmol/L。

1.2標(biāo)本來源 凍干標(biāo)準(zhǔn)血漿、凍干乏Ⅷ因子血漿、凍干乏Ⅸ因子血漿、凍干乏Ⅺ因子血、凍干乏Ⅻ血漿均來自于SIEMENS。整個(gè)研究過程中，均使用同一批號(hào)的凍干血漿。健康人血漿標(biāo)本來自20～48歲的30例男性和30例女性捐獻(xiàn)者(問卷調(diào)查排除飲食、藥物、疾病等影響因素)，平均年齡28.6歲。標(biāo)本采用0.109 mmol/L枸櫞酸鈉抗凝，2 000×g離心15 min收獲血漿，無溶血、脂血、黃疸。

1.3方法 凍干標(biāo)準(zhǔn)血漿及乏因子血漿恢復(fù)至室溫后，每支加入1 mL蒸餾水復(fù)融。標(biāo)準(zhǔn)血漿及單因子缺乏血漿的FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ因子活性，采用Siemens Dade Actin試劑和相應(yīng)Siemens乏因子血漿試劑在CS-5100儀器進(jìn)行檢測(cè)。APTT因子敏感性評(píng)估參照CLSI H47-A2相關(guān)指南進(jìn)行[3]：用商品化的單因子缺乏血漿與標(biāo)準(zhǔn)血漿按比例配制出不同單因子活性的混合血漿，因子活性范圍為<1%～100%，由此可以得到單因子活性為100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、<1%的11份標(biāo)本。每份標(biāo)本一式3份均用4種不同的APTT試劑，在相應(yīng)的儀器上進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果取平均值，且每管間差異(CV%)須小于5%。60例健康捐獻(xiàn)者的標(biāo)本分離的新鮮血漿分別用4種不同APTT試劑進(jìn)行檢測(cè)，所得APTT檢測(cè)結(jié)果用于計(jì)算各APTT試劑的正常參考區(qū)間[2]。APTT試劑敏感性為達(dá)到正常參考區(qū)間上限的最大因子濃度。正常參考區(qū)間上限定義為APTT測(cè)定結(jié)果的均值加2s[2,6]。所有標(biāo)本均在4 h內(nèi)完成測(cè)定。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 APTT試劑測(cè)定不同因子水平的混合血漿，所得的APTT均值分別與相應(yīng)的凝血單因子活性擬合非線性回歸曲線，曲線與正常參考區(qū)間上限交叉點(diǎn)的百分活度(%)即相應(yīng)因子的敏感性[3]。所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用GraphPad Prism 4(GraphPad Software,Inc.La Jolla,CA,USA)軟件。

2 結(jié) 果

2.1標(biāo)準(zhǔn)血漿與乏因子血漿內(nèi)源性因子活性結(jié)果 標(biāo)準(zhǔn)血漿與乏因子血漿的FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ因子活性，見表1。標(biāo)準(zhǔn)血漿的因子活性均在正常參考范圍內(nèi)。乏因子血漿除去特定的因子活性<1%外，其余因子活性均在正常參考范圍內(nèi)，但低于標(biāo)準(zhǔn)血漿的因子活性。

2.24種不同APTT試劑的內(nèi)源性因子敏感性 4種不同APTT試劑的正常參考范圍上限：試劑A為37.0 s；試劑B為41.1 s；試劑C為40.1 s；試劑D為44.2 s。相應(yīng)因子的敏感性為非線性回歸曲線與正常參考區(qū)間上限交叉點(diǎn)的百分活度(%)。4種APTT試劑的FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ敏感性，見表2。4種APTT試劑FⅧ敏感性范圍為25.6%(試劑B)～54.0%(試劑A)；FⅨ敏感性范圍為16.5%(試劑B)～37.3%(試劑A)；FⅪ敏感性范圍為19.1%(試劑D)～56.5%(試劑A)；FⅫ敏感性范圍為18.6%(試劑B)～36.4%(試劑A)。試劑A對(duì)FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ均表現(xiàn)為最高敏感性，且對(duì)FⅧ、FⅪ表現(xiàn)為超敏感(>50%)。試劑B對(duì)FⅧ、FⅨ、FⅫ均表現(xiàn)為最低敏感性，且對(duì)FⅨ、FⅫ敏感性均低于20%。試劑D對(duì)FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ均表現(xiàn)為低敏感性(<30%)，對(duì)FⅨ敏感性低于20%，但對(duì)FⅧ、FⅨ、FⅫ的敏感性高于試劑Ⅱ。試劑C對(duì)FⅧ、FⅨ、FⅪ表現(xiàn)為適中的敏感性(>30%～<50%)，對(duì)FⅫ表現(xiàn)為低敏感性(<30%)。

表2 4種不同APTT試劑的內(nèi)源性途徑因子敏感性(%)

3 討 論

本研究應(yīng)用CLSI H47-A2指南實(shí)現(xiàn)了對(duì)APTT試劑因子敏感性的量化評(píng)估，研究表明4種不同的APTT試劑的內(nèi)源性因子敏感性差異較大。因此，臨床應(yīng)用中應(yīng)根據(jù)不同的目的選擇相應(yīng)的APTT試劑。CLSI H47-A2指出：APTT所在檢測(cè)系統(tǒng)(試劑/儀器組合)在FⅧ、FⅨ、FⅪ低于0.3 U/mL(30%因子活性)時(shí)，應(yīng)當(dāng)表現(xiàn)為時(shí)間異常延長(zhǎng)，理想狀態(tài)下，試劑對(duì)因子的敏感性應(yīng)該在30%～45%[3]。本研究中，試劑A與試劑C對(duì)FⅧ、FⅨ、FⅪ的敏感性均≥30%，符合CLSI指南要求。由于這兩種試劑對(duì)FⅧ、FⅨ有較高的敏感性，均可用于亞臨床型血友病A、B[7]的篩查，但試劑A優(yōu)于試劑C。在我國，多數(shù)實(shí)驗(yàn)室的FⅧ、FⅨ活性的檢測(cè)是在標(biāo)準(zhǔn)曲線的基礎(chǔ)上，根據(jù)APTT的檢測(cè)結(jié)果換算得到血漿中凝血因子的活性值[8]。如果應(yīng)用對(duì)FⅧ、FⅨ不敏感的APTT試劑，在檢測(cè)FⅧ、FⅨ輕度缺乏的標(biāo)本時(shí)，不會(huì)出現(xiàn)APTT的延長(zhǎng)，從而導(dǎo)致所獲得的因子活性值在正常范圍內(nèi)，得到一個(gè)假陰性結(jié)果。因此，試劑B與試劑D并不適用于輕型或亞臨床型血友病的篩查，但可作為中度或重度單因子缺乏的確證試劑應(yīng)用于臨床。

遺傳性FⅪ缺陷癥在臨床較為罕見。FⅪ水平高低與出血的嚴(yán)重程度不呈正比，無明顯的自發(fā)性出血傾向[9-10]。但在外傷或手術(shù)中，某些缺乏FⅪ的患者，F(xiàn)Ⅺ的水平高于30 IU/dL，也會(huì)有明顯的出血，部分患者FⅪ的水平即便達(dá)到40 IU/dL，也會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的出血及低凝血酶生成[11]。由此可見，術(shù)前篩查需要FⅪ敏感的APTT試劑，用于檢出FⅪ輕度缺乏的患者，預(yù)防術(shù)中的出血。筆者認(rèn)為，用于術(shù)前篩查的APTT試劑，F(xiàn)Ⅺ敏感性應(yīng)至少達(dá)到40%(40 IU/dL)，才能滿足篩查試驗(yàn)的要求。本研究中試劑A與試劑C符合要求。

根據(jù)CLSI指南，試劑A與試劑C均可作為合格的術(shù)前篩查試劑應(yīng)用于臨床。但是，筆者認(rèn)為適用于術(shù)前篩查的APTT試劑，不僅要考慮其對(duì)內(nèi)源性因子FⅧ、FⅨ、FⅪ的敏感性，也需要考慮FⅫ的影響。FⅫ屬于接觸激活因子，是體外模擬內(nèi)源性凝血途徑的啟動(dòng)因子，在APTT試驗(yàn)中占有重要的地位。FⅫ活性的減低不會(huì)引起明顯的出血現(xiàn)象，有研究報(bào)道：遺傳性FⅫ缺陷的患者，F(xiàn)Ⅻ:c為2%，F(xiàn)Ⅻ:Ag<1%時(shí)也未見明顯出血[12]。所以，術(shù)前篩查應(yīng)當(dāng)選擇對(duì)FⅫ的敏感性盡可能低的APTT試劑，以避免FⅫ輕度缺乏導(dǎo)致的APTT延長(zhǎng)，誤導(dǎo)臨床醫(yī)生給患者進(jìn)行后續(xù)的確診試驗(yàn)，延誤患者治療。試劑A的FⅫ敏感性是本研究中最高的，比試劑C高8%。因此，作為術(shù)前篩查的試劑，試劑A并不合適。試劑B與試劑D雖然FⅫ敏感性低(<25%)，但對(duì)FⅧ、FⅨ、FⅪ的敏感性也很低(<30%)。因此，這兩種試劑也不適用于術(shù)前凝血項(xiàng)篩查。試劑C對(duì)FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ的敏感性處于相對(duì)適中的范圍，適用于術(shù)前篩查。

不同的APTT試劑對(duì)內(nèi)源性凝血因子的敏感性不同，激活劑是其中很重要的影響因素。本研究中的4種APTT試劑，試劑A因子敏感性高于試劑B，試劑D敏感性最低，與文獻(xiàn)報(bào)道不一致[10]，此結(jié)果可能與試劑的其他組分濃度有關(guān)。磷脂的種類和濃度亦會(huì)影響APTT檢測(cè)結(jié)果[6]，在本研究中，4種試劑所用磷脂雖均為兔腦磷脂，但磷脂濃度未知，因此APTT試劑對(duì)因子的敏感性不同是否是由于不同磷脂濃度造成的，還需要進(jìn)一步研究。

對(duì)APTT試劑可以用于普通肝素的監(jiān)測(cè)、狼瘡抗凝物質(zhì)檢測(cè)及內(nèi)源性因子缺乏檢測(cè)，本研究?jī)H關(guān)注了其中的一個(gè)方面。目前，幾乎所有廠家的APTT試劑說明書均未標(biāo)注出APTT試劑的適用范圍，以及對(duì)因子、肝素、狼瘡抗凝物質(zhì)的敏感性。如何在眾多APTT試劑中選擇合適的試劑，并將APTT檢測(cè)的效用最大化，還需要檢驗(yàn)工作者加強(qiáng)對(duì)試劑的了解，根據(jù)不同的臨床需求選擇相應(yīng)的試劑，并對(duì)所選擇的試劑進(jìn)行評(píng)估。

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