張馨琢，江 南，黃永茂，周英順

(西南醫(yī)科大學(xué)：1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室；2國際教育學(xué)院大二教研室；3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室；4附屬醫(yī)院感染科，四川瀘州 646000)

碳青霉烯類藥物是治療革蘭陰性細(xì)菌尤其是腸桿菌科細(xì)菌感染的最后可選擇藥物，但由于近年廣泛使用，也導(dǎo)致對碳青霉烯抗生素產(chǎn)生了耐藥，主要由于出現(xiàn)水解該類抗生素的酶，包括blaOXA型碳青霉烯酶，金屬β-內(nèi)酰胺酶（blaNDM、blaIMP和blaVIM），A類碳青霉烯酶（blaKPC和blaGES）[1]。研究發(fā)現(xiàn)，醫(yī)院污水中富集了來自臨床的大量耐藥細(xì)菌和用于治療感染的殘留抗菌藥物，使醫(yī)院污水集聚了高密度的耐藥菌和抗菌藥物，成為耐藥基因的儲(chǔ)蓄池[2]。醫(yī)院污水中存在碳青霉烯不敏感菌株多樣性和耐碳青霉烯耐藥基因如何，目前不清楚。本研究擬探索醫(yī)院污水中碳青霉烯不敏感細(xì)菌種類和主要的碳青霉烯酶基因型。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、LB固體培養(yǎng)基、LB營養(yǎng)瓊脂、M-H肉湯均購自Solarbio北京索萊寶科技有限公司；DNA聚合酶Ex Taq、Premix TaqTM、dNTP Mixture、DNA Marker、瓊脂糖均購自TakaRa大連寶生物有限公司；引物合成及測序由上海生工技術(shù)有限公司完成。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌株來源和鑒定

2017年7 月于西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院污水站進(jìn)水口采集原水1 000 mL，充分混勻后作1∶10稀釋，取100 μL涂布于含1 mg/L美羅培南（倍能，深圳海濱制藥有限公司）的產(chǎn)色平板(CHROM Agar，科瑪嘉，法國)，37℃孵育過夜，篩選出對美羅培南敏感性降低（MIC＞4 mg/L）的污水細(xì)菌16株。采用煮沸法提取細(xì)菌DNA。菌種鑒定選用通用引物27F和1492R通過對16S rRNA基因的部分測序，以及引物UP-1和UP-2r對gryB基因的測序完成[3-4]。擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物有限公司進(jìn)行序列測定，所獲基因序列通過GenBank、EzTaxon6和LeBIBI數(shù)據(jù)庫（https://umr5558-bibiserv.univ-lyon1.fr/lebibi/lebibi.cgi）檢索鑒定污水菌種。

1.3 污水菌株的MIC值測定

采用微量肉湯稀釋法測定16株污水菌株對亞胺培南西司他丁和美羅培南的MIC值。質(zhì)控菌株大腸埃細(xì)菌ATCC25922。結(jié)果依照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（CLSI）2016年版規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)判讀。

1.4 污水菌株的耐藥基因檢測

采用煮沸法制備模板DNA。PCR擴(kuò)增A類碳青霉烯酶編碼基因blaGES[5]、blaKPC[6]和新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶編碼基因blaNDM-1。多重PCR擴(kuò)增OXA型碳青霉烯酶編碼基因（blaOXA-51、blaOXA-23、blaOXA-24、blaOXA-58、blaOXA-143）[7-8]和金屬β-內(nèi)酰胺酶的編碼基因（blaIMP、blaVIM、blaSPM、blaGIM、blaSIM）[9]。PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件如參考文獻(xiàn)所述。對多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳顯示有陽性目標(biāo)條帶的菌株，再通過單一PCR驗(yàn)證。目的基因陽性的PCR產(chǎn)物全部送上海生工技術(shù)有限公司測序。PCR引物見表1。

表1 各目的基因PCR擴(kuò)增引物序列及PCR產(chǎn)物片段長度

2 結(jié)果

2.1 醫(yī)院污水菌株分離、鑒定及MIC值

從醫(yī)院污水中分離出對碳青霉烯類敏感性降低的污水菌株共16株，通過16S序列測定和Genbank，EzTaxon6和LeBIBI數(shù)據(jù)庫在線比對，發(fā)現(xiàn)4株不動(dòng)桿菌屬，其中3株約氏不動(dòng)桿菌屬（H4、H6、H7），1株溶血不動(dòng)桿菌（H5）；4株氣單胞菌屬，包括2株嗜水氣單胞菌（L1、L3），2株豚鼠氣單胞菌(L2、L4)；2株睪丸酮叢毛單胞菌(H2、H3)；4株屎腸球菌(SL1、SL2、SL3、SL4)；2株嗜麥芽窄食單胞菌(B1、B2)。MIC及細(xì)菌形態(tài)特征見表2。

表2 污水菌株的菌種鑒定及MIC值測定

2.2 污水菌株的耐藥基因檢測

16株對碳青霉烯類敏感性降低的污水菌株中，有4株不動(dòng)桿菌屬（H4、H5、H6、H7）均檢測出攜帶新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶編碼基因blaNDM-1，4株氣單胞菌屬（L1、L3、L2、L4）均檢測出攜帶A類碳青霉烯酶編碼基因blaKPC-2，2株睪丸酮叢毛單胞菌（H2、H3）和2株不動(dòng)桿菌屬（H5、H7）攜帶有blaOXA143耐藥基因。在所有菌株中均未檢測到blaOXA和blaGES型產(chǎn)碳青霉烯酶耐藥基因。

3 討 論

碳青霉烯類抗生素已經(jīng)成為臨床治療革蘭氏陰性桿菌的最后可選擇藥物，對產(chǎn)碳青霉烯耐藥性的監(jiān)控對細(xì)菌耐藥性的防治具有重要意義。本研究從醫(yī)院污水中分離出16株碳青霉烯類不敏感菌株，發(fā)現(xiàn)4株不動(dòng)桿菌，2株嗜水氣單胞菌，2株豚鼠氣單胞菌，2株睪丸酮叢毛單胞菌，4株屎腸球菌，2株嗜麥芽窄食單胞菌。研究發(fā)現(xiàn)所分離菌均為條件致病菌，如不動(dòng)桿菌屬[11]、屎腸球菌，嗜麥芽窄食單胞菌為臨床常見條件致病菌。豚鼠氣單胞菌主要引起人類和動(dòng)物的腹瀉，在全世界許多國家都有發(fā)現(xiàn)，豚鼠氣單胞菌可粘附在人或動(dòng)物的腸上皮細(xì)胞上并聚集成團(tuán)，形成生物被膜，從而導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞的破損，引起腹瀉。除腸道外，豚鼠氣單胞菌還能損傷人和動(dòng)物的肝、肺、腎等重要器官以及肌肉組織等[12]。2015年Lopes AC等報(bào)道了巴西一起由豚鼠氣單胞菌產(chǎn)生耐熱腸毒素引發(fā)的腹瀉在人群中的爆發(fā)流行[13]。嗜水氣單胞菌廣泛分布于自然界的各種水體，是典型的人-獸-魚共患病病原菌，可以產(chǎn)生溶血素、組織毒素、壞死毒素、腸毒素、蛋白酶等外毒素，主要通過粘附人和動(dòng)物的腸道組織引發(fā)感染。通常具有高粘附力的嗜水氣單胞菌株同時(shí)也能產(chǎn)生毒性很強(qiáng)的外毒素，從而導(dǎo)致暴發(fā)性出血病。睪丸酮叢毛單胞菌，主要引起呼吸道感染。通過ERIC-PCR對所分離細(xì)菌進(jìn)行克隆相似性分析，所分離細(xì)菌為不同克隆類型，表明了醫(yī)院污水中存在條件致病菌多樣性。

通過耐藥基因檢測發(fā)現(xiàn)，4株不動(dòng)桿菌屬（H4～7）均檢測出攜帶新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶編碼基因blaNDM-1。近年來，國內(nèi)blaNDM-1相關(guān)報(bào)道逐漸增多，但多見于臨床菌株。攜帶blaNDM-1的污水菌株是否也來源于臨床，其毒力因子是否增強(qiáng)，值得進(jìn)一步關(guān)注和研究。在4株氣單胞菌屬[2株嗜水氣單胞菌（L1、L3），2株豚鼠氣單胞菌（L2、L4）]均檢測出攜帶A類碳青霉烯酶編碼基因blaKPC-2。國內(nèi)blaKPC-2相關(guān)報(bào)道較多，但氣單胞菌檢測及相關(guān)報(bào)道較少。在2株睪丸酮叢毛單胞菌（H2，H3）和2株不動(dòng)桿菌屬（H5，H7）攜帶有blaOXA143耐藥基因，此外還有6株對亞胺培南等碳青霉烯類天然耐藥的屎腸球菌和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌，結(jié)果表明醫(yī)院污水中存在耐藥基因多樣性。

4 結(jié)論

總之，本研究從醫(yī)院污水中檢測到對碳青霉烯類敏感性降低的5個(gè)屬16株細(xì)菌攜帶blaNDM-1、blaK?PC-2、blaOXA-143等能水解碳青霉烯類的耐藥基因。表明醫(yī)院污水碳青霉烯不敏感菌菌株多樣性和細(xì)菌耐藥基因多樣性，表明醫(yī)院污水是重要但常常被忽視的耐藥菌株和耐藥基因的儲(chǔ)蓄池，應(yīng)該受到更多關(guān)注。

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