林映汐，陶華林

(西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院檢驗科，四川瀘州 646000）

乳腺癌是導致全球女性死亡最常見的惡性腫瘤之一[1]。從90年代起，乳腺癌發(fā)病率呈兩倍的速度增長。近幾十年來，盡管乳腺癌分子生物學機制得到了廣泛研究，但在臨床上仍存在著許多問題，如：延遲診斷、復發(fā)、轉移等。因此，尋找一種更為有效的早期篩查和預后指標成為當前研究的重點。

外泌體（exosome），一種能被幾乎所有細胞分泌的微小囊泡，直徑30～150 nm[2]，廣泛分布于血液、尿液、乳汁、腦脊液等體液當中。人們一直認為它是細胞的廢棄物。然而近幾年，人們發(fā)現(xiàn)這種微小囊泡中含有特殊蛋白、脂質和核酸等，能作為信號分子傳遞給其它細胞從而改變其它細胞的功能[3]。這些發(fā)現(xiàn)引起了人們對細胞分泌囊泡的興趣。最近研究發(fā)現(xiàn)外泌體在很多生理病理上起著重要的作用，如免疫與疫苗的開發(fā)、腫瘤的生長和遷移、靶向給藥等[4-6]。

長鏈非編碼RNA(（long non-coding RNA，ln?cRNA)是一類轉錄長度超過200 nt的RNA分子,由于缺少開放的閱讀框、蛋白質編碼能力，曾被學者一度視為基因的“垃圾”[7]。近年來研究表明，lncRNA參與X染色體修飾、轉錄調(diào)節(jié)、小RNA的構建等多種生理過程，且與腫瘤有著密切聯(lián)系。肺腺癌轉移相關轉錄本1（MALAT1）是一個長度約為8 000 bp，位于染色體11q13.1上，也是首次發(fā)現(xiàn)與非小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展有著密切關系的長鏈非編碼RNA[8]。MALAT1在人類正常組織中是廣泛表達的，近年來研究發(fā)現(xiàn)，MALAT1在多種惡性腫瘤異常高表達，如宮頸癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、結腸癌和肝癌等。目前越來越多的證據(jù)表明MALAT1表達水平的上調(diào)與乳腺癌有著密切的關系，因此，MALAT1可作為乳腺癌潛在的生物標記物。然而，血漿外泌體中MALAT1的表達水平研究目前尚未見報道。本研究旨在通過定量逆轉錄PCR(qRT-PCR)檢測MALAT1在乳腺癌血漿外泌體中的表達情況，分析其與乳腺癌臨床病理資料的相關性以及對乳腺癌的潛在診斷價值，為乳腺癌的診斷和治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標本收集

收集2016年8月至2017年4月在本院收治的乳腺癌初診的女性患者50例為病例組，均未經(jīng)手術、放療及化療，年齡在32～71歲。收集乳腺癌患者術前新鮮血漿標本50例，包括乳腺癌侵潤性導管癌45例，導管內(nèi)癌2例，小葉癌2例，黏液癌1例。根據(jù)2016年美國腫瘤聯(lián)合會（AJCC）第8版癌癥分期系統(tǒng)，分為Ⅰ期12例、Ⅱ期13例、Ⅲ期16例、Ⅳ期9例。并選取同期在本院住院期間確診為乳腺良性疾病的女性患者25例，采血前未經(jīng)任何臨床治療，年齡在21～51歲，其中乳腺纖維瘤18例，乳腺病7例。又收集同期本院女性健康者25例，年齡在24～65歲。標本采集前均與患者簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與設備

exoRNeasy serum/plasma Midi Kit（德國凱杰公司）、PrimescriptTMRTⅡ逆轉錄試劑盒（大連寶生物公司）、PCR引物（Invitrogen公司）、QuantiNova SYBR Green PCR Kit（德國凱杰公司）、7500Fast熒光定量PCR儀器（美國ABI公司）、ND-1000UV微量紫外分光光度計（美國Nanodrop公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 標本處理

采集各研究對象的空腹靜脈血4mL置于EDTA-K2抗凝真空管中，收集后室溫下1 h內(nèi)以3 000 r/min離心15 min分離血漿。將分離后的血漿重新轉移至無菌無酶的EP管中，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 外泌體RNA提取及逆轉錄

按照exoRNeasy試劑操作說明書提取血漿外泌體中RNA，將提取后的RNA進行純度（A260/280）和完整性檢測，選取純度在1.8～2.0的樣本進行后續(xù)實驗。按照PrimescriptTMRTⅡ試劑盒操作說明書進行逆轉錄反應，cDNA樣本置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 lncRNA MALAT1表達水平的檢測

選擇血穩(wěn)定表達的β-action作為內(nèi)參，采用Primer Premier 5.0軟件設計β-action（GenBan序列號：NM-001293171.2）引物，經(jīng)BLAST測試后由Invit?rogen公司合成，引物序列：β-action上游5ˊ -TCCTCTCCCAAGTCCACACA-3'，下 游 5'-GCACGAAGGCTCATCATTCA-3'；MALAT1 上 游5'-GACTACAGAGCCCCGAATTAATAC-3ˊ；下 游5'-CATTTTCGTCTGCGTTTAGTAAATG-3'。PCR總反應體積為 20 μL，包括 SYBR Green PCR Master Mix(2 ×)10 μL，QNRox Reference Dye 0.1 μL，上下游引物各 2 μL，cDNA 模板 2 μL，RNase-Free Water 3.9 μL。循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 2 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 25 s，共40個循環(huán)。用7500 System Software-SDS 2.2軟件在60℃時收集熒光信號，并進行熔解曲線分析。MALAT1的相對表達量用2-△△Ct法計算，△△Ct=△Ct病例組（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）-△Ct對照組（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）。

1.4 統(tǒng)計分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行。定性資料采用頻數(shù)及百分比表示分析，定量資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)）［M（P25，P75）］表示，定性資料的組間比較采用χ2檢驗，定量資料的組間比較采用秩和檢驗，以乳腺良性病變患者和體檢健康者作為對照組，乳腺癌患者為疾病組，采用sigmaplot 12.5軟件繪制ROC曲線，ROC曲線下面積用于評價MALAT1相對表達量對不同類型標本的鑒別診斷價值，檢驗水準α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 血漿外泌體MALAT1在各組的表達

乳腺癌組血漿外泌體MALAT1表達量為[1.660（0.901,2.493）]、乳腺良性病變組表達量為[0.739（0.377,1.816）]和健康對照組表達量為[0.717（0.525,1.797）],各組間比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=10.245，P=0.006)。乳腺癌組血漿外泌體MALAT1表達水平明顯高于乳腺良性病變組(Z=-2.877，P=0.004)、健康對照組(Z=-2.304，P=0.021)，見圖1。

圖1 血漿外泌體MALAT1在各組中相對表達量的比較

2.2 乳腺癌患者血漿外泌體中MALAT1表達與臨床病理參數(shù)相關性

對50例乳腺癌患者病理資料統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)血漿外泌體MALAT1表達水平與ER、PR、c-erbB-2、Ki-67及淋巴結轉移相關（P＜0.05），而與年齡、病理類型、TNM分期、P120（膜）無相關性，見表1。

2.3 評價外泌體MALAT1對乳腺癌的診斷價值

采用sigmaplot 12.5繪制ROC曲線分析50例乳腺癌血漿外泌體MALAT1的診斷價值。ROC曲線分析表明：MALAT1 AUCROC=0.684，當臨界值 =0.743，敏感度=0.840，特異度=0.520，優(yōu)登指數(shù)=0.360，見圖2。

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌血漿外泌體可穩(wěn)定表達MALAT1，其表達水平高于乳腺良性病變組及健康對照組，且外泌體MALAT1的靈敏度和特異度都較高。以上結果與國外研究報道核酸可在外泌體和血漿樣品中檢測出差異性變化結果相一致[9]。由于外泌體具有脂質雙層膜結構[10]，不易被外界的各種酶所降斛，所以能很好的保護其包被的物質。

表1 乳腺癌患者血漿外泌體MALAT1表達與臨床病理參數(shù)的相關性

圖2 乳腺癌血漿外泌體MALAT1 ROC曲線

研究表明，lncRNA MALAT1在癌癥發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色，MALAT1在非小細胞肺癌、宮頸癌、前列腺癌、結腸癌等腫瘤中過表達。同時MALAT1在細胞周期和細胞凋亡中扮演著調(diào)節(jié)作用，Guo[11]發(fā)現(xiàn)MALAT1在宮頸癌Caski48A9亞克隆細胞株中高表達，通過siRNA干擾后，G1期細胞數(shù)量顯著增多而S期細胞減少，大大降低了宮頸癌細胞的增殖能力，同時Caspase-3、Caspase-8、Bax等促凋亡蛋白上調(diào)。c-erbB-2作為乳腺癌常見的一個致癌基因，其表達也預示了乳腺癌患者預后差，復發(fā)率高和5年生存率低[12]。有研究表明Ki-67表達與乳腺癌發(fā)生發(fā)展有關，Ki-67表達陽性的乳腺癌細胞惡性程度高，轉移率更高[13]。P120（膜）在乳腺癌組織中也異常表達，與E-cadherin表達相關，并且與浸潤性小葉癌的發(fā)生發(fā)展更為密切[14]。本研究結合臨床病理資料提示血漿外泌體MALAT1表達水平與ER（+）、PR（+）、c-erbB-2（+）、Ki-67（+）及淋巴結轉移具有相關性，提示血漿外泌體中異常表達的MALAT1可能為 ER（+）、PR（+）、c-erbB-2（+）、Ki-67（+）乳腺癌的預測靶標。在本研究中，乳腺癌的年齡、病理類型、TNM分期、P120（膜）與血漿外泌體MALAT1表達差異無統(tǒng)計學意義，其原因有可能是我們收集的樣本量有限，組間偏倚較大，后續(xù)我們將擴大樣本量繼續(xù)研究血漿外泌體MALAT1水平在乳腺癌患者治療前后差異是否有統(tǒng)計學意義。

4 結 論

血漿外泌體MALAT1有望成為乳腺癌早期篩查、診斷與預后的潛在性生物標志物。

1. Ferlay J,Soerjomataram I,Dikshit R,et al.Cancer inci?dence and mortality worldwide:sources,methods and ma?jor patterns in GLOBOCAN 2012[J].Int J Cancer,2015,136(5):359-386.

2. Colombo M，Raposo G，Thery C.Biogenesis secretion and intercellular interactions of exosomes and other extra?cellular vesicles[J].Annu Rev Cell Dev Biol，2014，30:255-289.

3. Regev-Rudzki N,Wilson DW,Carvalho TG,et al.Cell-cell communication between malaria-infected red blood cells via exosome-like vesicles[J].Cell，2013，153(5):1 120-1 133.

4. Vallabhajosyula P，Korutla L，Habertheuer A，et al,Tis?sue-specific exosome biomarkers for noninvasively moni?toring immunologic rejection of transplanted tissue[J].J Clin Invest,2017，127(4):1 375-1 391.

5. T.N.Le M，Hamar P，Guo CY，et al.miR-200-contain?ing extracellular vesicles promote breast cancer cell metas?tasis[J].Journal of Clinical Investigation，2014，124(12):5 109-5 128.

6. Kamerkar S，LeBleu VS，Sugimoto H，et al,Exosomes fa?cilitate therapeutic targeting of oncogenic KRAS in pan?creatic cancer[J].Nature，2017，546(7659):498-503.

7. Hansji H,Leung EY,Baguley BC,et al.Keeping abreast with long non-coding RNAs in mammary gland devel?opment and breast cancer[J].FrontGenet,2014，5:379

8. Ji P，Diederichs S,Wang W et al.MALAT-1,a novel noncoding RNA,and thymosin β 4 predict metastasis and survival in early-stage non-small cell lung cancer[J].Oncogene，2003，22：8 031-8 041

9. Zhang W,Xia W,Lv Z，et al.Liquid biopsy for cancer:circulating tumor cells,circulating free DNA or exosomes[J].Cell Physiol Biochem 2017，41:755-768.

10.Liu T，Zhang X，Gao S，et al.Exosomal long noncoding RNA CRNDE-h as a novel serum-based biomarker for diagnosis and prognosis of colorectal cancer[J].Oncotar?get，2016，7:85 551-85 563.

11.Guo F ，Li Y ，Liu Y et al.Inhibition of metastasis associat?ed lung adenocarcinoma transcript 1 in CaSki human cer?vical cancer cells suppresses cell proliferation and invasion[J].Acta Biochim Biophys Sin（Shanghai），2010，42（3）：224-229.

12.English DP，Roque DM，Santin AD． HER2 expression beyond breast cancer:therapeutic implications for gyneco?logicmalignancies[J]．MolDiagnTher，2013，17(2):85-99．

13.Yuan P，Xu BL ，Wang CZ ，et al.Ki-67 expression in lu?minal type breast cancer and its association with the clini?copathology of the cancer[J].Oncol Lett,2016，11(3):2 101-2 105.

14. Kourtidis A，Ngok SP，Anastasiadis PZ，et al.P120 catenin:an essential regulator of cadherin stability,adhe?sion-induced signaling,and cancer progression[J].Prog Mol Biol Transl Sci,2013，116:409-432.