盧子劍，寇玉伶，郭慶喜，熊小明，孫興旺

（西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院病理科，四川瀘州 646000）

結(jié)直腸癌是常見的發(fā)生于結(jié)腸部位的消化道惡性腫瘤，近10年來，全球結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率水平基本穩(wěn)定，但占全球惡性腫瘤發(fā)病、死亡的比例仍有所增加[1]。結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展是多基因共同作用的結(jié)果，其中，組蛋白賴氨酸甲基化在基因的表達調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。有研究顯示，組蛋白賴氨酸甲基化可以介導腫瘤的發(fā)生[2]。而大多數(shù)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶在組蛋白的甲基化中扮演了重要的角色，SetDB1（set domain bifurcated 1）是組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶中重要的結(jié)構(gòu)域之一。SetDB1又稱為組蛋白H3賴氨酸9甲基轉(zhuǎn)移酶，定位于1q21染色體上，基因長度為50 kbp。SetDB1與HP1（特異性異染色質(zhì)蛋白）及CAF1（染色質(zhì)組裝因子）相關(guān)聯(lián)形成復合物，HP1-CAF1-SetDB1復合物可以導致K9在H3上發(fā)生單甲基化，進而促進H3K9me3的形成，介導腫瘤的發(fā)生[3]。國外研究顯示，SetDB1在前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、肺癌的發(fā)生發(fā)展中均扮演重要的角色[4-9]。

另有研究表明[10]，結(jié)直腸癌細胞的增殖、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學行為依賴多種信號通路轉(zhuǎn)導，如TGF-β、Wnt信號通路等。其中Wnt信號通路備受關(guān)注。Wnt信號通路普遍存在于各種動物體內(nèi)，在胚胎的發(fā)育、細胞增殖與分化等過程中有著重要作用，值得注意的是，Wnt/β-catenin通路的激活在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中也起到了重要的作用[11]。國外研究發(fā)現(xiàn)，在非小細胞肺癌中，SetDB1可以通過調(diào)控Wnt信號通路中的關(guān)鍵因子APOE、IGFBP4、FZD1、LRP8，從而影響β-catenin在胞漿的聚集和入核，進而加速腫瘤的發(fā)生[8]。但是在結(jié)直腸癌中SetDB1是否能通過調(diào)控β-catenin從而影響腫瘤的發(fā)生卻鮮有文獻報道。因此，本文通過免疫組織化學的方式，檢測SetDB1、β-catenin在結(jié)直腸癌中的表達并探討其臨床病理特征，以期了解它們在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 標本來源

收集西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院2013年6月至2014年6月期間，接受手術(shù)治療的原發(fā)性結(jié)直腸癌患者腫瘤組織標本及距腫瘤邊緣＞5 cm處的正常腸黏膜組織標本各70例，其中男性32例，女性38例，年齡39～76歲，平均年齡60.6歲。其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性31例，陰性39例；本次標本腫瘤組織類型為腺癌，分化程度按高、中、低分組，分別為23、39、8例；腫瘤組織最長徑＜5 cm有39例，最長徑≥5 cm有31例。所有的結(jié)直腸癌患者術(shù)前均未做過術(shù)前放化療及其他抗腫瘤治療等?；颊呔橥猓厢t(yī)學倫理學相關(guān)規(guī)定。

1.2 主要試劑

SetDB1鼠抗人抗體及β-catenin兔抗人抗體分別購自Abcam及Cell Signaling公司；EDTA抗原修復液、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組化染色

所有標本做常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，6 μm厚連續(xù)切片，采用EnVision免疫組化染色方法進行SetDB1、β-catenin染色：將石蠟組織切片后置于60℃恒溫烤箱烤片3 h，浸于二甲苯脫蠟、酒精濃度梯度脫水，PBS緩沖液洗滌3次，每次5 min；于枸椽酸鹽緩沖液(pH 6.0)中高壓修復3 min，冷卻至室溫后，用蒸餾水沖洗2 min；滴加3%的過氧化物酶阻斷劑，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，避光孵育15 min；蒸餾水沖洗，PBS洗滌3次，各5 min；滴加一抗SetDB1(1∶300)、β-catenin（1∶500），27 ℃孵育60 min；PBS沖洗切片3次，每次3 min；滴加二抗，27℃孵育30 min；用PBS沖洗切片3次，每次3 min；滴加預先準備好的顯色劑DAB工作液，顯微鏡下控制顯色，顯色完全后，用自來水沖洗，終止顯色；流水沖洗5 min；蘇木精復染2 min、0.1%稀鹽酸分化、飽和碳酸鋰反藍、脫水、透明、封片。

1.4 結(jié)果判讀

由兩位本院主治級別以上病理科醫(yī)生各自獨立進行盲審，采用半定量方法來評定染色情況。Set?DB1表達陽性的結(jié)果根據(jù)陽性細胞比例及著色深度計分，著色深度評分標準按細胞著色評分：無著色0分；淡棕黃色1分；棕黃色2分；棕褐色3分。陽性細胞比例評分標準：無著色為0分；同一顯微鏡視野下計算陽性細胞數(shù)，按其占腫瘤細胞的比例＜30%為1分，30%～70%為2分，＞70%為3分。根據(jù)上述兩項指標的分數(shù)相加分為4個等級：0分，陰性(-)；1～2分，弱陽性(+)；3～ 4分，陽性(++)；5 ～ 6分，強陽性（+++）。我們將“-/+”定義為蛋白低表達，“++/+++”，定義為蛋白高表達。

β-catenin染色結(jié)果判讀標準按照Maruyama等[12]的方法：細胞膜陽性表達細胞率＞70%為正常表達，胞漿或胞核陽性表達細胞率＞10%為陽性表達。

1.5 統(tǒng)計學處理

使用SPSS 17.0統(tǒng)計學的軟件進行分析。計數(shù)資料用χ2檢驗，相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 SetDB1蛋白在結(jié)直腸癌中的表達

SetDB1蛋白陽性信號為棕黃色顆粒，主要定位于細胞核（圖1），成顆?；蛘邎F狀分布，偶可見細胞膜和細胞質(zhì)也有染色。結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中SetDB1蛋白陽性表達率97.14%，明顯高于癌旁正常組織SetDB1蛋白陽性表達率30%（χ2＝68.13，P ＜0.05），見表1。

表1 結(jié)直腸癌組織及癌旁正常黏膜中SetDB1的表達情況

圖1 SetDB1蛋白陽性表達（EnVision法染色，×400）

2.2 癌組織中SetDB1蛋白表達與臨床病理特性的關(guān)系

2.2.1 癌組織分化程度

癌組織全為腺癌，分化程度按照高、中、低分化三個等級進行分組，SetDB1蛋白在癌組織高分化組的表達率為65.21%，中分化組為89.74%，低分化組為50.00%，其中高、中分化組之間及中、低分化組之間的差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝8.710，P ＜ 0.05），見表2。結(jié)果提示SetDB1可能參與腫瘤組織的分化類型。

表2 癌組織中SetDB1的表達與分化程度的關(guān)系

2.2.2 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

所有手術(shù)切除癌組織標本腸周淋巴結(jié)均仔細清理、尋找，淋巴結(jié)總數(shù)不少于15枚。結(jié)果顯示，在31例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，SetDB1高表達率為80.64%，而在39例未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，Set?DB1的高表達率為74.36%，差異無統(tǒng)計學意義（χ2＝0.387，P＞0.05）。這表明SetDB1的表達可能與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。

2.2.3 其他臨床病理特征

SetDB1的表達與腫瘤組織的浸潤深度、腫瘤大小、患者年齡和性別均無關(guān)（P＞0.05），見表3。

表3 癌組織中SetDB1的表達與臨床指標的關(guān)系

2.3 β-catenin在結(jié)直腸癌中的表達情況

β-catenin蛋白陽性信號仍為棕黃色顆粒，在正常情況下，β-catenin定位于細胞膜；如果Wnt通路被激活從而導致β-catenin發(fā)生陽性表達，則β-catenin蛋白信號將陽性表達于細胞漿和細胞核（圖2）。β-catenin在結(jié)直腸癌組織和正常腸黏膜組織中的漿核陽性表達率分別為84.28%、47.14%，結(jié)直腸癌組織的β-catenin陽性表達率明顯高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計學意義（χ2＝21.431，P ＜ 0.001），見表4。

表4 結(jié)直腸癌組織及癌旁正常黏膜中β-catenin的表達情況

圖2 β-catenin蛋白陽性表達（EnVision法，× 400）

2.4 癌組織中β-catenin蛋白表達與臨床病理特性的關(guān)系

2.4.1 癌組織分化程度

癌組織中高、中、低分化組別β-catenin蛋白陽性表達率分別為52.17%、66.67%、50.00%，其中各組間差異無統(tǒng)計學意義（χ2＝1.643，P ＞ 0.05），見表5。

表5 癌組織中β-catenin的表達與分化程度的關(guān)系

2.4.2 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

在42例β-catenin陽性表達癌組織中，其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中β-catenin蛋白的陽性表達率為77.42%，顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的β-catenin蛋白陽性表達率46.15%，差異具有統(tǒng)計學意義（χ2＝8.159，P ＜ 0.05）。提示β-catenin的陽性表達可能參與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學行為。

2.4.3 其他臨床病理特征

β-catenin的陽性表達與腫瘤組織的分化程度、浸潤深度、腫瘤大小、患者年齡和性別均無關(guān)（P＞0.05），見表6。

表6 結(jié)直腸癌β-catenin表達與臨床病理因素的關(guān)系

2.5 SetDB1與β-catenin相關(guān)性分析

癌組織中SetDB1與β-catenin均呈高表達（圖3），且 SetDB1與β-catenin表達存在相關(guān)性（r＝0.397，P＝0.001），見表7 。

表7 SetDB1與β-catenin相關(guān)性分析

圖3 免疫組化檢測SetDB1和β-catenin在結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中的表達（EnVision法，×40）

3 討 論

正常人體組織、細胞的生長受到癌基因和抑癌基因的精確調(diào)控。國內(nèi)外大量研究表明，腫瘤細胞的無限增殖是由于細胞凋亡受到抑制（癌基因被激活或抑癌基因被抑制）的結(jié)果[13]。近幾年研究表明，-CpG島發(fā)生甲基化是導致抑癌基因低表達的關(guān)鍵因素之一[14]。甲基化是蛋白質(zhì)和核酸的一種重要修飾，甲基化功能的本質(zhì)是甲基化機制的建立、維持和去除甲基[15]，早在1975年，Holliday R等[16]就發(fā)現(xiàn)胞嘧啶在CpG位點的甲基化可以通過體細胞的分裂進行遺傳。甲基化主要包括DNA的甲基化和蛋白質(zhì)（主要是精氨酸和賴氨酸）的甲基化。組蛋白尾部通過發(fā)生甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等共價修飾來組成組蛋白密碼，調(diào)節(jié)著許多生物學事件[17]。

賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶四大家族中的許多成員與腫瘤的形成有關(guān)，賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶活性缺失或失調(diào)可能是導致腫瘤發(fā)生的原因[18]。而甲基化是通過甲基轉(zhuǎn)移酶進行催化、維持，因此，組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶在組蛋白的甲基化中扮演著重要的角色[19]，大多數(shù)的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶都含有Set結(jié)構(gòu)域，構(gòu)成了Set-domain組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶家族(SET-do?main protein methyltransferase family），組蛋白賴氨酸的甲基化幾乎全部由Set-domain家族催化執(zhí)行[19]。

Set-domain分支型1(即SET domain bifurcated 1，SetDB1)是組蛋白賴氨酸N端甲基轉(zhuǎn)移酶家族中的一員，其編碼基因位于人類染色體1q21上[20]。Set?DB1與特異性異染色質(zhì)蛋白HP1及染色質(zhì)組裝因子CAF1相關(guān)聯(lián)形成復合物，這種HP1-CAF1-SetDB1復合物可以導致K9在非核小體組蛋白H3上發(fā)生單甲基化，從而促進H3K9me3的形成，介導腫瘤的發(fā)生[3]。Set結(jié)構(gòu)域蛋白的主要功能是調(diào)節(jié)細胞相關(guān)增殖基因的活性，但是具體機制還不甚明確。有學者發(fā)現(xiàn)SetDB1在多種腫瘤細胞株，比如乳腺癌細胞株和腎臟癌細胞株[21]中的表達均有上調(diào)。祝順琴[22]研究表明沉默SetDB1基因后導致神經(jīng)母細胞瘤生長、增殖受到抑制，下調(diào)SetDB1會抑制嘌呤核苷酸的從頭合成從而影響腫瘤的增殖和分化，這表明SetDB1對神經(jīng)母細胞的增殖和分化具有重要的作用。國內(nèi)外大量研究也證實SetDB1在前列腺癌、肝細胞癌、腎癌、乳腺癌、腦膠質(zhì)瘤、黑色素瘤等多種腫瘤細胞中呈現(xiàn)高表達，并且可以通過下調(diào)SetDB1的表達來影響腫瘤的生長能力。癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫亦顯示SetDB1在腫瘤高表達基因的排名中屬于最靠前基因之一[23]。因此，目前已經(jīng)有部分學者將SetDB1基因作為癌基因看待。本研究顯示在70例結(jié)直腸癌中，SetDB1在癌組中的陽性率（97.14%）較癌旁組（30%）明顯增高，說明SetDB1可能對結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展起到一定的促進作用；本研究另一結(jié)果顯示，SetDB1的高表達與腫瘤組織的分化程度有關(guān)，中、高分化程度的結(jié)直腸癌SetDB1陽性率達到了71.42%，提示SetDB1可能還參與腫瘤的組織分化調(diào)控。

Wnt信號傳導通路作為與胚胎發(fā)育及腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的信號通路之一，目前成為近年來的研究熱點。Wnt/β-catenin通路包含3部分：細胞外因子Wnt蛋白、胞膜上的卷曲蛋白及受體及胞質(zhì)內(nèi)β-catenin蛋白受體、細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子TCF4/Lef[11]。各種原因?qū)е掳庖蜃覹nt被激活，通過一系列的作用激活胞內(nèi)的β-catenin蛋白受體，致β-catenin無法被磷酸化從而在胞質(zhì)內(nèi)累積，大量游離的β-catenin在胞漿內(nèi)聚集，入核與TCF4結(jié)合形成復合物，啟動下游靶基因的異常轉(zhuǎn)錄，進而誘發(fā)細胞異常增殖、促進腫瘤發(fā)生[24-25]。如上所述，Wnt通路中的關(guān)鍵因子β-catenin如果發(fā)生突變或失調(diào)都有可能誘導癌癥的發(fā)生[26]。鄒慧娟等[27]在結(jié)直腸癌患者血清中發(fā)現(xiàn)某些因子可以活化Wnt信號通路，活化后的Wnt信號通路可能會通過β-catenin上調(diào)細胞增殖相關(guān)因子（c-myc和cyclin D1），從而促進結(jié)直腸癌細胞的增殖。還有學者通過對結(jié)腸癌組織的基因表達譜進行檢測，發(fā)現(xiàn)在癌組織里Wnt信號通路中調(diào)控細胞周期、基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因子均呈上調(diào)表達，說明Wnt信號通路的激活可能是結(jié)直腸癌發(fā)生的重要原因之一，也說明Wnt通路可能是結(jié)直腸癌演變過程中的重要信號通路之一[28]。本研究結(jié)果顯示，β-catenin蛋白在癌組中的表達顯著高于癌旁組，說明在結(jié)直腸癌患者中Wnt/β-catenin可能被激活，筆者推測Wnt/β-catenin通路的激活可能參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，并且本研究的另一結(jié)果表明，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中β-catenin蛋白的高表達率為77.42%，顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，因此筆者推測在結(jié)直腸癌中，淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移可能與Wnt/β-catenin通路是否激活有關(guān)，這與目前木爾扯爾等人的研究相符[29]。

SetDB1和β-catenin的相關(guān)性分析結(jié)果表明，相關(guān)系數(shù)r＝0.397，小于0.8，提示在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中，SetDB1和β-catenin兩者之間可能還有其他因子的作用。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，SetDB1和β-catenin在結(jié)直腸癌組織中呈現(xiàn)高表達，SetDB1和β-catenin的關(guān)聯(lián)性分析表明兩者呈中度相關(guān)，結(jié)合相關(guān)文獻及關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果推測SetDB1和β-catenin的高表達可能會促進結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展，但由于SetDB1和β-catenin的關(guān)聯(lián)性分析表明兩者呈中度相關(guān)，Set?DB1在結(jié)直腸癌中是否能夠通過某種方式上調(diào)β-catenin的表達進而激活Wnt/β-catenin通路還有待進一步研究。

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