薛無涯，王艦梅，夏 天，葉入裴，肖秀麗，龍漢安

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，四川瀘州 646000）

在美國，結(jié)直腸癌的發(fā)病率及致死率均位居惡性腫瘤第3位，隨著民眾健康意識的增強、診療技術(shù)及篩查手段的進(jìn)步，其發(fā)病率與死亡率均有所下降[1]。但在我國，結(jié)直腸癌的發(fā)病率及致死率均位居惡性腫瘤前5位，且發(fā)病年齡日趨年輕化，發(fā)病率逐年上升[2-3]。盡管目前有多種方法診治結(jié)直腸癌，但其早期癥狀不明顯，患者就診時間較晚，預(yù)后也較差[4]。因此對結(jié)直腸癌發(fā)病相關(guān)分子的識別及其功能特點的研究不僅能為早期診斷結(jié)直腸癌提供依據(jù)，也能為其治療提供新的靶點與思路。Masuda等[5]的報道指出microRNA(miRNA)在結(jié)直腸癌中異常表達(dá)，并與腫瘤分化程度、臨床分期、治療反應(yīng)及預(yù)后有關(guān)，提示miRNA與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)，可作為早期診斷結(jié)直腸癌及反映病人預(yù)后的指標(biāo)。miR-204-5p在多種惡性腫瘤組織中低表達(dá)，并能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移及EMT[6-9]，但其在結(jié)直腸癌的相關(guān)報道較少。本研究通過觀察miR-204-5p在結(jié)直腸癌與正常腸黏膜組織中的表達(dá)差異及其對細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelia-mesenchymal transition,EMT）的影響，探討其發(fā)揮作用的可能機制，旨在為早期診治結(jié)直腸癌提供新的依據(jù)及靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標(biāo)本與臨床資料的收集

選取2016年12月至2017年6月于本院確診并手術(shù)治療的23名結(jié)直腸癌患者的新鮮癌組織及配對的正常腸黏膜組織（距癌組織邊緣＞5 cm）。標(biāo)本切除后立即置于RNAwai（t非凍型組織RNA保存液）中，4℃過夜，-20℃長期保存。所有標(biāo)本來源均為初診病人，并已簽署知情同意書。

1.1.2 細(xì)胞株和主要試劑

人結(jié)直腸癌HT29、LoVo細(xì)胞由西南醫(yī)科大學(xué)病理實驗室保存；RNAwait購自北京Solarbio公司；過表達(dá)人miR-204-5p慢病毒上清購自美國GeneCopoeia公司；miR-204-5p特異引物序列由廣州銳博公司合成；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Premix Ex Taq購自日本Takara公司；培養(yǎng)液（RPMI-1640、DMEM/F12）購自美國HyClone公司；Transwell小室購自美國Corning公司；E-cadherin及Vimentin抗體購自美國CST公司；MAPRE2抗體購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

HT29、LoVo細(xì)胞在37 ℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液中。設(shè)置過表達(dá)人miR-204-5p的HT29-204-5p組、LoVo-204-5p組及轉(zhuǎn)染空載病毒的HT29-NC組、LoVo-NC組。將細(xì)胞均勻接種于6孔板，24 h后細(xì)胞融合約60%時進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染。8～12 h后換液，常規(guī)培養(yǎng)至72 h，觀察并檢測轉(zhuǎn)染效率。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染成功后傳代培養(yǎng)。

1.2.2 總RNA的提取及熒光定量PCR檢測miR-204-5p的表達(dá)

細(xì)胞融合至90%時終止培養(yǎng)，4℃的PBS沖洗3次，加入RNA裂解液。取組織標(biāo)本50～100 mg置于勻漿器中，加入1 mL RNA裂解液，于冰上充分勻漿裂解。紫外分光光度計下檢測RNA的濃度及純度。PCR擴增儀將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。熒光定量PCR儀檢測miR-204-5p的表達(dá)情況。使用U6作為內(nèi)參，以2-△△Ct法計算miR-204-5p的相對表達(dá)量，配對正常腸黏膜組織作為對照組。

1.2.3 平板克隆形成實驗

取4組細(xì)胞各200～300個，于6孔板中培養(yǎng)2～3周。當(dāng)肉眼可見的克隆斑形成時，吸去培養(yǎng)液，常規(guī)浸洗、固定、染色，流水緩慢沖洗，室溫下自然干燥，計數(shù)肉眼可見的克隆斑數(shù)目。

1.2.4 劃痕修復(fù)實驗

在六孔板背側(cè)標(biāo)記3～5條間距0.5 cm以上的平行線。取4組細(xì)胞均勻鋪于6孔板，24 h后細(xì)胞融合達(dá)80%以上時用10 μL槍頭沿標(biāo)記橫線劃痕，PBS沖洗2～3次以去除懸浮細(xì)胞。加入2 mL無血清DMEM/F12培養(yǎng)液，于劃痕后0、12和24 h拍照，觀察并計算劃痕愈合程度。

1.2.5 Transwell小室侵襲實驗

將Transwell小室用預(yù)冷的RPMI-1640培養(yǎng)液潤濕，在其上室面鋪Matrigel膠，37℃聚合2 h，取4組細(xì)胞各2×104個，用100 μL含1%血清的RP?MI-1640培養(yǎng)液重懸后接種于上室，下室加500 μL RPMI-1640完全培養(yǎng)基以趨化細(xì)胞。24～48 h后擦掉上室側(cè)的細(xì)胞及Matrigel膠，常規(guī)固定、染色、浸洗，室溫干燥。于光學(xué)顯微鏡下拍照、計數(shù)小室膜下室側(cè)的細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 Western blot

提取各組細(xì)胞總蛋白。常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗4℃孵育12～18 h，二抗37℃孵育1 h，ECL化學(xué)法顯影。Fusion軟件分析蛋白灰度值，并統(tǒng)計分析各組蛋白相對表達(dá)量。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計分析實驗結(jié)果數(shù)據(jù)。計量資料以x±s表示，其統(tǒng)計分析采用t檢驗，計數(shù)資料采用Pearson卡方檢驗統(tǒng)計分析。P＜0.05時差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-204-5p的表達(dá)水平和臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

PCR結(jié)果顯示miR-204-5p在結(jié)直腸癌組織中低表達(dá)（圖1）。根據(jù)miR-204-5p的表達(dá)水平，將23例結(jié)直腸癌分為miR-204-5p高表達(dá)組和miR-204-5p低表達(dá)組，并分析其與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系（臨床資料見表1）。結(jié)果顯示，其表達(dá)水平與腫瘤大小、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05），而與患者年齡、性別、腫瘤分化程度、腫瘤部位及血清CEA水平無明顯相關(guān)性（P＞0.05），見表2。

圖1 miR-204-5p在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況

表1 結(jié)直腸癌患者臨床病理資料

2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染效率的檢測

過表達(dá)miR-204-5p的慢病毒載體及空載病毒分別轉(zhuǎn)染HT29、LoVo細(xì)胞，72 h后置于熒光顯微鏡下觀察，HT29-204-5p組、LoVo-204-5p組、HT29-NC組及LoVo-NC組均見綠色熒光（圖2A）。RT-PCR結(jié)果顯示HT29-204-5p組、LoVo-204-5p組中miR-204-5p的表達(dá)顯著高于HT29-NC組、Lo?Vo-NC組（圖2B），提示成功上調(diào)HT29及LoVo細(xì)胞中miR-204-5p的表達(dá)水平。

2.3 miR-204-5p抑制HT29、LoVo細(xì)胞的克隆形成

克隆形成實驗結(jié)果顯示，HT29-204-5p組、Lo?Vo-204-5p組、HT29-NC組、LoVo-NC組克隆形成率分別為（11±2.25）%、（14.67±3.33）%、（18.33±2.75）%及（27.67±2.93）%，HT29-204-5p 組 、Lo?Vo-204-5p組克隆形成率顯著低于HT29-NC組、Lo?Vo-NC組，且HT29-204-5p組、LoVo-204-5p組克隆斑的體積也明顯小于HT29-NC組、LoVo-NC組克隆斑的體積（圖3）。

2.4 miR-204-5p抑制HT29、LoVo細(xì)胞的遷移

劃痕實驗結(jié)果顯示，劃痕24 h后HT29-204-5p組、LoVo-204-5p組、HT29-NC組和LoVo-NC組劃痕愈合率分別為（16.03±2.35）%、（15.30±0.99）%、（25.41± 4.36）%及（37.79± 4.70）%，HT29-204-5p組、LoVo-204-5p組劃痕愈合率顯著低于HT29-NC組和LoVo-NC組劃痕愈合率（圖4）。

表2 結(jié)直腸癌中miR-204-5p表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

圖2 慢病毒轉(zhuǎn)染HT29、LoVo細(xì)胞情況

圖3 過表達(dá)miR-204-5p后HT29、LoVo細(xì)胞平板克隆實驗

圖4 過表達(dá)miR-204-5p后HT29、LoVo細(xì)胞劃痕實驗

2.5 miR-204-5p抑制HT-29細(xì)胞及LoVo細(xì)胞的侵襲

Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示，HT29-204-5p組、LoVo-204-5p組、HT29-NC組和LoVo-NC組細(xì)胞透過數(shù)分別為（15.07±3.23）個、（51.47±4.35）個、（28.93±4.02）個及（112.9±7.73）個，HT29-204-5p組、LoVo-204-5p組細(xì)胞透過數(shù)顯著少于HT29-NC組、LoVo-NC組細(xì)胞透過數(shù)（圖5）。

2.6 miR-204-5p抑制HT29、LoVo細(xì)胞EMT

Western blot結(jié)果顯示，與HT29-NC組、LoVo-NC組相比，HT29-204-5p組、LoVo-204-5p組E-cad?herin表達(dá)明顯上調(diào)，Vimentin表達(dá)明顯下調(diào)（圖6）。

2.7 MAPRE2為miR-204-5p的潛在靶基因

生物信息軟件TargetScan、microRNA.org及miR?TarBase預(yù)測發(fā)現(xiàn)MAPRE2可能為miR-204-5p的靶基因（圖7 A）。Western blot結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-204-5p能下調(diào)MAPRE2表達(dá)水平（圖7B）。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)幾乎所有惡性腫瘤中都存在miRNA的表達(dá)異常，miRNA靶向作用于癌基因或抑癌基因而參與腫瘤發(fā)生與發(fā)展，影響患者的預(yù)后[10]。研究發(fā)現(xiàn)miR-204-5p在宮頸癌、胃癌、乳腺癌、腎癌及甲狀腺癌等多種惡性腫瘤中低表達(dá)[6,11-16]。研究還發(fā)現(xiàn)，miR-204-5p靶向作用于IGFBP5、BCL2、SIRT1、FOXC1、USP47及RAB22等多種基因而影響腫瘤的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移[6-9]，但關(guān)于miR-204-5p在結(jié)直腸癌中的研究較少。因此，探討miR-204-5p在結(jié)直腸癌增殖、侵襲及遷移中的作用具有重要的意義。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-204-5p在結(jié)直腸癌組織中低表達(dá)，這與其在胃癌、乳腺癌、腎癌、黑色素瘤等惡性腫瘤中的研究結(jié)果較一致[6,11-16]。臨床病理資料顯示miR-204-5p的表達(dá)水平與腫瘤大小、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，本研究還發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-204-5p能顯著削弱結(jié)直腸癌HT29、LoVo細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的能力，這與其在甲狀腺癌、口腔癌、喉癌及肝癌中的研究結(jié)果較一致[6-9]，這些結(jié)果說明miR-204-5p能廣泛參與各類腫瘤的發(fā)生和發(fā)展等過程，并能在一定程度上作為臨床判斷預(yù)后的指標(biāo)及治療的靶點。侵襲及轉(zhuǎn)移是影響腫瘤患者預(yù)后的重要因素[17-18]，而EMT是腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的重要機制[19]。發(fā)生EMT后，上皮細(xì)胞的形態(tài)和表型向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變，并獲得較強的遷移能力，其上皮標(biāo)記物E-cadherin、Cytokeratin表達(dá)下調(diào)，而Vimentin、Fibronectin等間葉標(biāo)記物上調(diào)。為了進(jìn)一步研究miR-204-5p對結(jié)直腸癌侵襲、轉(zhuǎn)移的機制，本實驗檢測了過表達(dá)miR-204-5p的HT29、LoVo細(xì)胞中E-cadherin及Vi?mentin的表達(dá)情況。結(jié)果顯示miR-204-5p顯著上調(diào)E-cadherin的表達(dá)，下調(diào)Vimentin的表達(dá)，提示miR-204-5p能抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT，這與Zeng J等[15]在乳腺癌中的研究結(jié)果較一致，部分解釋了miR-204-5p抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的機制。生物信息學(xué)軟件TargetScan、microRNA.org及miR?

TarBase預(yù)測結(jié)果顯示MAPRE2為miR-204-5p的潛在靶基因。MAPRE2蛋白是一種與細(xì)胞分裂、運動密切相關(guān)的微管相關(guān)蛋白，它可以通過下調(diào)細(xì)胞粘附分子N-cadherin的表達(dá)削弱細(xì)胞間的粘附能力[20]，而其磷酸化調(diào)節(jié)在細(xì)胞有絲分裂的正確進(jìn)行及維持基因組的穩(wěn)定中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用[21]。Abiatari等[22]研究發(fā)現(xiàn)MAPRE2可通過調(diào)節(jié)微管的動態(tài)參與胰腺癌細(xì)胞的嗜神經(jīng)侵襲，其表達(dá)水平與患者的預(yù)后負(fù)相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)miR-204-5p抑制HT29、Lo?Vo細(xì)胞中MAPRE2的表達(dá)，提示miR-204-5p可能靶向作用于MAPRE2進(jìn)而影響結(jié)直腸癌的惡性生物學(xué)行為，但這還需行進(jìn)一步的相關(guān)試驗來驗證。

圖5 過表達(dá)miR-204-5p后HT29、LoVo細(xì)胞Transwell小室侵襲實驗

圖6 過表達(dá)miR-204-5p后HT29、LoVo細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)情況

圖7 miR-204-5p的靶基因預(yù)測情況

4 結(jié) 論

miR-204-5p在結(jié)直腸癌中低表達(dá)，其可能通過調(diào)控MAPRE2基因和EMT而抑制結(jié)直腸癌的增殖、侵襲及遷移，這為miR-204-5p可能作為診治結(jié)直腸癌的新指標(biāo)和新靶點提供了重要的理論依據(jù)。但目前尚未明確miR-204-5p是否通過直接作用于MA?PRE2而抑制結(jié)直腸癌的惡性生物學(xué)行為，仍需進(jìn)一步研究。

1. Siegel RL,Miller KD,Fedewa SA,et al.Colorectal can?cer statistics,2017[J].CA Cancer J Clin,2017,67(3):177-193.

2. Chen W,Zheng R,Baade PD,et al.Cancer statistics in China,2015[J].CA Cancer J Clin,2016,66(2):115-132.

3. Chen W,Zheng R,Zhang S,et al.Cancer incidence and mortality in China in 2013:an analysis based on urbaniza?tion level[J].Chin J Cancer Res,2017,29(1):1-10.

4. Brenner H,Kloor M,Pox CP.Colorectal cancer[J].Lan?cet,2014,383(9927):1 490-1 502.

5. Masuda T,Hayashi N,Kuroda Y,et al.MicroRNAs as biomarkers in colorectal cancer[J].Cancers(Basel),2017,9(9):124.

6. Liu L,Wang J,Li X,et al.MiR-204-5p suppresses cell proliferation by inhibiting IGFBP5 in papillary thyroid carcinoma[J].Biochem Biophys Res Commun,2015,457(4):621-626.

7. Wang X,Li F,Zhou X.miR-204-5p regulates cell pro?liferation and metastasis through inhibiting CXCR4 ex?pression in OSCC[J].Biomed Pharmacother,2016,82:202-207.

8. Gao W,Wu Y,He X,et al.MicroRNA-204-5p inhib?its invasion and metastasis of laryngeal squamous cell carci?noma by suppressing forkhead box C1[J].J Cancer,2017,8(12):2 356-2 368.

9. Jiang G,Wen L,Zheng H,et al.miR-204-5p targeting SIRT1 regulates hepatocellular carcinoma progression[J].Cell Biochem Funct,2016,34(7):505-510.

10. Mraz M,Pospisilova S.MicroRNAs in chronic lympho?cytic leukemia:from causality to associations and back[J].Expert Rev Hematol,2012,5(6):579-581.

11.Lee H,Kim KR,Cho NH,et al.MicroRNA expression profiling and Notch1 and Notch2 expression in minimal deviation adenocarcinoma of uterine cervix[J].World J Surg Oncol,2014,12:334.

12. Gowrishankar B,Ibragimova I,Zhou Y,et al.MicroR?NA expression signatures of stage,grade,and progression in clear cell RCC[J].Cancer Biol Ther,2014,15(3):329-341.

13.Chang H,Kim N,Park JH,et al.Different microRNA expression levels in gastric cancer depending on Helico?bacter pylori infection[J].Gut Liver,2015,9(2):188-196.

14. Kozubek J,Ma Z,Fleming E,et al.In-depth character?ization of microRNA transcriptome in melanoma[J].PLoS One,2013,8(9):e72 699.

15.Zeng J,Wei M,Shi R,et al.MiR-204-5p/Six1 feed?back loop promotes epithelial-mesenchymal transition in breast cancer[J].Tumour Biol,2016,37(2):2 729-2 735.

16. Luo YH,Tang W,Zhang X,et al.Promising significance of the association of miR-204-5p expression with clini?copathologicalfeaturesofhepatocellularcarcinoma[J].Medicine(Baltimore),2017,96(30):e7 545.

17. Friedl P,Locker J,Sahai E,et al.Classifying collective cancer cell invasion[J].Nat Cell Biol,2012,14(8):777-783.

18. Mareel M,Leroy A.Clinical,cellular,and molecular as?pects of cancer invasion[J].Physiol Rev,2003,83(2):337-376.

19. Iwatsuki M,Mimori K,Yokobori T,et al.Epitheli?al-mesenchymal transition in cancer development and its clinical significance[J].Cancer Sci,2010,101(2):293-299.

20. Stenner F,Liewen H,G?ttig S,et al.RP1 Is a Phosphory?lation target of CK2 and is involved in cell adhesion[J].Plos One,2013,8(7):67 595.

21. Iimori M,Watanabe S,Kiyonari S,et al.Phosphorylation of EB2 by Aurora B and CDK1 ensures mitotic progres?sion and genome stability[J].Nature Communications,2016,7:11 117.

22. Abiatari I,Gillen S,DeOliveira T,et al.The microtu?bule-associated protein MAPRE2 is involved in perineu?ral invasion of pancreatic cancer cells[J].Int J Oncol,2009,35(5):1 111-1 116.