李少金，方婉仙，肖水秀，匡文斌

（1.深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院，深圳 518110；2.廣州市達瑞生物技術(shù)股份有限公司，廣州 510665）

近年來，隨著社會經(jīng)濟的高速發(fā)展和人民生活水平的提高，腦血管病己經(jīng)成為中國居民的第一死因。中國平均每年200多萬人罹患此病，其中150萬以上死亡。腦血管病包括出血性和缺血性腦血管病兩大類，其中腦缺血性卒中發(fā)病率最高，約占全部卒中的75%[1]。臨床上治療腦缺血性卒中的唯一有效方法為快速恢復(fù)再灌注[2]，但研究發(fā)現(xiàn)再灌注后反而進一步加劇腦損傷即腦缺血再灌注損傷。其機制較為復(fù)雜，目前尚沒完全闡明，主要是與炎性反應(yīng)、自由基損傷、細胞毒性、線粒體通透性增加、細胞內(nèi)鈣超載等多種機制有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)抗炎和抗氧化藥物均可以有效地保護腦缺血再灌注損傷[3-4]。目前臨床上針對腦缺血再灌注損傷并沒有特效藥，故研究開發(fā)保護缺血性腦損傷的藥物具有重要的理論意義和實用價值。近年來研究表明[5]許多中藥有效成分在防治腦缺血再灌注損傷方面取得了較好的成效，可為臨床上有效藥物的開發(fā)提供方向。

魚腥草為三白草科多年生草本植物蕺菜的新鮮全草或干燥地上部分。其主要成分為揮發(fā)油，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、增加免疫力等多種功效[6]，提示魚腥草揮發(fā)油可能對腦缺血再灌注損傷具有較好的保護作用。目前魚腥草揮發(fā)油對腦缺血再灌注損傷的研究尚未見報道，本研究旨在探討魚腥草揮發(fā)油對腦缺血再灌注損傷的療效及作用機制，為臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動物 SPF級C57BL/6小鼠120只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，由山東省實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（魯）20140006。

1.2 藥物與試劑 辛伐他汀片：規(guī)格20 mg/片，山東魯抗醫(yī)藥集團賽特有限責任公司；魚腥草：廣東天泰藥業(yè)有限公司；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-8（IL-8）ELISA檢測試劑盒：博士德生物技術(shù)有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）檢測試劑盒：南京建成股份有限公司；氯化三苯四氮唑（TTC）：Sigma-Aldrich；栓線：廣州佳靈生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器 550酶標測定儀：日本Bio-red公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；Leica SM2010 R切片機:德國萊卡股份有限公司；體式顯微鏡：深圳市西派克光學儀器有限公司

1.4 方法

1.4.1 魚腥草揮發(fā)油的提取 參照文獻[7]的方法提取魚腥草揮發(fā)油，主要工藝條件如下：將干燥魚腥草粉碎成粗粉，按料液比為1∶10加入蒸餾水，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中浸泡10 h，70℃加熱回流10 h。

1.4.2 分組與給藥 動物適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后隨機分為假手術(shù)組、模型組、辛伐他汀陽性對照組，魚腥草揮發(fā)油低劑量組，魚腥草揮發(fā)油中劑量組，魚腥草揮發(fā)油高劑量組，每組20只。于造模前連續(xù)灌胃給藥14 d，辛伐他汀陽性對照組灌胃給藥20 mg/（kg·d），魚腥草揮發(fā)油低、中、高劑量組分別灌胃給藥5、10、20 mg/（kg·d），假手術(shù)組、模型組灌胃給予等量生理鹽水。

1.4.3 小鼠腦缺血（MCAO）模型的建立 各組小鼠連續(xù)灌胃給藥2周后，末次給藥1 h后開始造模，4%異戊巴比妥鈉腹腔麻醉小鼠，麻醉后仰臥固定于37℃恒溫手術(shù)臺上。按文獻方法[8]建立小鼠MCAO模型，主要步驟如下：剃去頸部毛發(fā)、碘伏消毒，正中縱向切口長約2 cm，暴露和分離左側(cè)頸總動脈，頸外動脈和頸內(nèi)動脈，4-0號縫合線結(jié)扎頸外動脈，利用體式顯微鏡于頸總動脈近心端剪一小口，把包被硅膠的9 mm長尼龍線從頸總動脈剪口處插入小口向頸內(nèi)動脈緩慢送入，略感到阻力后停止推進并固定栓線，即可堵塞大腦中動脈。缺血90 min后，輕輕抽出尼龍線，再灌注24 h，建立小鼠MCAO模型。

1.4.4 行為學評分 行為學評分按照Longa等5分制法，于小鼠再灌注24 h后進行行為評分。主要評分方法如下：無精神損傷癥狀為0分;不能完全伸展對側(cè)前爪為1分；向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈為2分；向?qū)?cè)傾倒為3分；不能自發(fā)行走，意識喪失為4分。

1.4.5 取材 小鼠摘眼球取血，常溫靜置1 h后，3 000 r/min離心15 min，分離血清，-20℃保存，待測。小心取腦，于-20℃冰凍30 min，從額極向枕極作厚度為2 mm的冠狀切片5片，置于1%TTC染色液中，37℃避光孵育30 min并掃描，應(yīng)用Image-Pro Plus圖像分析處理軟件計算小鼠腦梗死率，梗死率=梗死面積/總面積×100%。10%中性甲醛固定腦組織，石蠟切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察腦海馬齒狀回的形態(tài)學變化。稱取腦組織濕質(zhì)量，將腦組織放入恒溫干燥箱（105℃）烤72 h，稱取腦組織干質(zhì)量，計算腦含水量，腦含水量（%）=（濕質(zhì)量-干質(zhì)量）/濕質(zhì)量×100%。

1.4.6 生化指標檢測 采用ELISA雙抗體夾心法檢測血漿中TNF-α、IL-8含量；WST-1法檢測SOD活性，TBA法檢測MDA含量。實驗操作均按照試劑盒說明書進行。

1.4.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one way ANOVA），組間兩兩比較若方差齊采用LSD檢驗，以p＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 魚腥草揮發(fā)油對小鼠MCAO行為學評分的影響 見表1。

表1 各組小鼠行為學評分結(jié)果Tab.1 Results of behavioral evaluation of mice in various group

表1 各組小鼠行為學評分結(jié)果Tab.1 Results of behavioral evaluation of mice in various group

注：與假手術(shù)組比較，*p＜0.05，**p＜0.01；與模型組比較，#p＜0.05，##p＜0.01；與辛伐他汀陽性對照組比較，△p＜0.05；與魚腥草揮發(fā)油低劑量組比較，▲p＜0.05。

組別 動物數(shù) 行為學評分假手術(shù)組 10 0.00±0.00模型組 10 3.42±0.54**辛伐他汀陽性對照組 10 2.72±0.75**#魚腥草揮發(fā)油低劑量組 10 2.83±0.42**#魚腥草揮發(fā)油中劑量組 10 2.28±0.25*##魚腥草揮發(fā)油高劑量組 10 2.12±0.22*##△▲

從表1結(jié)果可見，與假手術(shù)組比較，各組小鼠行為學分數(shù)均顯著升高（p＜0.05）。與模型組比較，辛伐他汀組、魚腥草揮發(fā)油低、中、高劑量組行為學分數(shù)均顯著降低（p＜0.05）。與辛伐他汀組比較，魚腥草揮發(fā)油高劑量組小鼠行為學分數(shù)顯著降低（p＜0.05）。與魚腥草揮發(fā)油低劑量組比較，魚腥草揮發(fā)油高劑量組小鼠行為學分數(shù)顯著降低（p＜0.05）。

2.2 魚腥草揮發(fā)油對小鼠MCAO梗死率的影響 從圖1和圖2結(jié)果可見，與假手術(shù)組比較，各組小鼠腦梗死率均明顯升高（p＜0.01）。與模型組比較，辛伐他汀組、魚腥草揮發(fā)油低、中、高劑量組小鼠腦梗死率均顯著降低（p＜0.01）。與辛伐他汀組比較，魚腥草揮發(fā)油高劑量組小鼠腦梗死率顯著降低（p＜0.05）。與魚腥草揮發(fā)油低劑量組比較，魚腥草揮發(fā)油高劑量組小鼠腦梗死率顯著降低（p＜0.05）。

2.3 魚腥草揮發(fā)油對小鼠MCAO腦海馬齒狀回的影響 從圖3結(jié)果可見，假手術(shù)組小鼠海馬齒狀回神經(jīng)元細胞層數(shù)多，飽滿，胞核為圓形或橢圓形，核漿比值大，可見深染的核仁。模型組小鼠海馬齒狀回神經(jīng)元細胞層次明顯減少，胞體縮小，胞漿濃縮，核仁著色不明顯。與模型組比較，辛伐他汀組和魚腥草給藥組神經(jīng)細胞排列較緊密，著色較均勻，胞質(zhì)濃染神經(jīng)元明顯減少，而且魚腥草給藥組藥效具有劑量依賴性。

圖1 各組小鼠腦梗死面積觀察Fig.1 Observation of cerebral infarction area in various groups

圖2 各組小鼠腦梗死率觀察Fig.2 Observation of cerebral infarction rate in various groups

2.4 魚腥草揮發(fā)油對小鼠MCAO腦水含量的影響 從圖4結(jié)果可見，與假手術(shù)組比較，各組小鼠腦含水量均明顯升高（p＜0.01）。與模型組比較，辛伐他汀陽性對照組、魚腥草揮發(fā)油低、中、高劑量組小鼠腦含水量均顯著降低（p＜0.01）。與辛伐他汀陽性對照組比較，魚腥草揮發(fā)油高劑量組小鼠腦含水量顯著降低（p＜0.01）。與魚腥草揮發(fā)油低劑量組比較，魚腥草揮發(fā)油高劑量組小鼠腦含水量顯著降低（p＜0.01）。

圖3 各組小鼠腦海馬齒狀回觀察Fig.3 Observation of hippocampal dentate gyrus in various groups

2.5 魚腥草揮發(fā)油對小鼠MCAO血清TNF-α、IL-8的影響 從表2結(jié)果可見，與假手術(shù)組比較，模型組、辛伐他汀陽性對照組、魚腥草揮發(fā)油低、中劑量組小鼠血清TNF-α和IL-8含量均明顯升高（p＜0.01）。與模型組比較，辛伐他汀陽性對照組、魚腥草揮發(fā)油低、中、高劑量組小鼠血清TNF-α和IL-8含量均顯著降低（p＜0.05）。與辛伐他汀陽性對照組比較，魚腥草揮發(fā)油高劑量組小鼠血清TNF-α和IL-8含量均顯著降低（p＜0.01）。與魚腥草揮發(fā)油低劑量組比較，魚腥草揮發(fā)油高劑量組小鼠血漿TNF-α和IL-8含量均顯著降低（p＜0.01）。

2.6 魚腥草揮發(fā)油對小鼠MCAO血清SOD、MDA的影響 從表3結(jié)果可見，與假手術(shù)組比較，模型組、辛伐他汀陽性對照組、魚腥草揮發(fā)油低、中劑量組小鼠血清SOD活性顯著降低（p＜0.01），MDA含量顯著升高（p＜0.01）。與模型組比較，辛伐他汀陽性對照組、魚腥草揮發(fā)油低、中、高劑量組小鼠血清SOD活性顯著升高（p＜0.05），MDA含量顯著降低（p＜0.05）。與辛伐他汀陽性對照組比較，魚腥草揮發(fā)油高劑量組小鼠血清SOD活性顯著升高（p＜0.01），MDA含量顯著降低（p＜0.01）。與魚腥草揮發(fā)油低劑量組比較，魚腥草揮發(fā)油高劑量組小鼠血清SOD活性顯著升高（p＜0.01），MDA含量顯著降低（p＜0.01）。

圖4 各組小鼠腦含水量觀察Fig.4 Observation of cerebral water content in various groups

表2 各組小鼠血清TNF-α和IL-8含量變化（Tab.2 Content of TNF-α and IL-8 in serum of various groups（

表2 各組小鼠血清TNF-α和IL-8含量變化（Tab.2 Content of TNF-α and IL-8 in serum of various groups（

注：與假手術(shù)組比較，*p＜0.05，**p＜0.01；與模型組比較，#p＜0.05，##p＜0.01；與辛伐他汀陽性對照組比較，△△p＜0.01；與魚腥草揮發(fā)油低劑量組比較，▲p＜0.05，▲▲p＜0.01。

組別 動物數(shù) TNF-α IL-8假手術(shù)組 10 5.52±0.23 6.28±0.69模型組 10 19.28±1.71** 22.23±1.45**辛伐他汀陽性對照組 10 13.84±1.39**# 14.45±1.41**#魚腥草揮發(fā)油低劑量組 10 15.24±1.56**# 19.22±1.31**##魚腥草揮發(fā)油中劑量組 10 12.31±1.74**## 14.80±1.52**#魚腥草揮發(fā)油高劑量組 10 9.32±1.33##△△▲▲ 9.99±1.25##△△▲▲

3 討論

缺血性腦卒中是一類由腦血流供應(yīng)障礙導(dǎo)致的腦組織缺血、缺氧，繼而引發(fā)局灶性腦組織缺血性損傷或壞死的多發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變。而目前臨床上治療缺血性腦卒中的唯一有效方法為快速恢復(fù)血流[2]，但再灌注后反而進一步加劇腦損傷即腦缺血再灌注損傷。其致病機制較為復(fù)雜，目前尚沒完全闡明，其中炎癥和氧化損傷是造成腦缺血再灌注損害的重要機制[3-4]。辛伐他汀為半合成他汀類藥物，近年來研究發(fā)現(xiàn)[9]辛伐他汀除調(diào)血脂作用外，還具有其他方面的作用，如抗炎、抗氧化等作用。在缺血性卒中、多發(fā)性硬化、Alzheimer病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中有廣泛神經(jīng)保護作用[10]。而且通過對多種他汀類藥物的比較發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀脂溶性較高，易穿過血-腦屏障且對腦缺血損傷的保護作用最好[11]，故本研究以辛伐他汀作為陽性對照藥。

表3 各組小鼠血清SOD活性和MDA含量變化Tab.3 Activity of SOD and content of MDA in serum of various groups（

表3 各組小鼠血清SOD活性和MDA含量變化Tab.3 Activity of SOD and content of MDA in serum of various groups（

注：與假手術(shù)組比較，**p＜0.01；與模型組比較，#p＜0.05，##p＜0.01；與辛伐他汀陽性對照組比較，△△p＜0.01；與魚腥草揮發(fā)油低劑量組比較，▲▲p＜0.01。

組別 動物數(shù) SOD（U/mL） MDA（μmol/L）假手術(shù)組 10 175.22±5.77 8.84±1.32模型組 10 82.20±4.78** 22.18±3.74**辛伐他汀陽性對照組 10 104.84±5.97**# 17.24±1.53**#魚腥草揮發(fā)油低劑量組 10 99.75±5.36**# 19.25±1.22**#魚腥草揮發(fā)油中劑量組 10 135.26±3.76**## 15.12±1.78**##魚腥草揮發(fā)油高劑量組 10 156.94±3.78##△△▲▲ 12.36±1.37##△△▲▲

本研究發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組比較，模型組小鼠行為學評分和腦梗死率明顯升高（p＜0.01），表明模型組腦缺血再灌注損傷嚴重，提示造模成功。魚腥草揮發(fā)油低、中、高劑量組小鼠行為學評分和腦梗死率明顯降低（p＜0.05），表明魚腥草揮發(fā)油低、中、高劑量組可有效改善行為學和腦神經(jīng)細胞壞死，從而減輕腦缺血再灌注損傷。辛伐他汀陽性對照組小鼠也可降低行為學評分和腦梗死率（p＜0.05），但效果不及魚腥草揮發(fā)油高劑量組。病理組織學結(jié)果也顯示魚腥草揮發(fā)油能明顯改善腦腦海馬齒狀回神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的形態(tài)學變化，與上述指標相一致。腦水含量是衡量腦缺血再灌注損傷進程中的腦水腫嚴重程度的一個指標，也是評價抗缺血性腦損傷藥物的重要指標之一[12]。本研究法發(fā)現(xiàn)魚腥草給藥組小鼠明顯減輕腦水腫程度（p＜0.01），且呈劑量依賴性。而辛伐他汀陽性對照組也明顯減輕腦水腫程度（p＜0.01）。TNF-α與IL-8具有多種生物效應(yīng)的細胞炎癥因子，參與多種組織再灌注損傷，兩者含量高低可反映炎癥嚴重程度。本研究發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組比較，模型組小鼠 TNF-α 和 IL-8含量顯著升高（p＜0.01），而給予魚腥草揮發(fā)油可顯著降低血清TNF-α和IL-8含量（p＜0.05），且呈劑量依賴性，表明魚腥草揮發(fā)油低、中、高劑量組可明顯減輕腦缺血再灌注損傷所致的炎癥。辛伐他汀陽性對照組也可降低血清TNF-α 和 IL-8含量（p＜0.05），但效果不及魚腥草揮發(fā)油高劑量組。而SOD與MDA是反映機體自由基的清除能力及氧化應(yīng)激的損傷程度的重要指標。本研究發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組比較，模型組小鼠血清SOD活性顯著升高（p＜0.01），MDA含量顯著降低（p＜0.01），給予魚腥草揮發(fā)油可顯著升高血清SOD活性（p＜0.05），降低MDA 含量（p＜0.05），且呈劑量依賴性，表明魚腥草揮發(fā)油低、中、高劑量組可明顯減輕氧化應(yīng)激損傷。辛伐他汀陽性對照組也可升高血清SOD 活性（p＜0.05），降低 MDA 含量（p＜0.05），但效果不及魚腥草揮發(fā)油高劑量組。

綜上所述，魚腥草揮發(fā)油對腦缺血再灌注損傷具有較好的保護作用，其作用機制可能是通過減輕炎癥和抗過氧化損傷而改善癥狀，其可為臨床抗腦缺血再灌注損傷新藥研究開發(fā)提供部分實驗依據(jù)。

參考文獻：

[1]中華醫(yī)學會神經(jīng)病學分會腦血管病學組急性缺血性腦卒中診治指南撰寫組.中國急性缺血性腦卒中診治指南2010[J].中國臨床醫(yī)生，2011，39(3)：67-73.

[2] Maria-Giulia Perrelli,Francesca Tullio,Carmelina Angotti,et al.Catestatin reducesmyocard ialischaemia/reperfusion injury:involvement of PI3K/Akt,PKCs,mitochondria l KATP channels and ROS signalling[J].Pflugers Arch,2013,465(7):1031-1040.

[3] Kang C，Cho W，Park M，et al.H2O2-triggered bubble generating antioxidant polymeric nanoparticles as ischemia/reperfusion targeted nanotheranostics[J].Biomaterials,2016,85(2016):195-203.

[4] Surapaneni S，Prakash T，Ansari M，et al.Study on cerebroprotective actions of Clerodendron glandulosumleaves extract against long term bilateral common carotid artery occlusion in rats[J].Biomed Pharmacother，2016，80(2016):87-94.

[5] 李路迢,劉旺華.中醫(yī)藥治療腦缺血再灌注損傷的研究進展[J].湖南中醫(yī)雜志，2016，32(10):193-196.

[6] 孫 謙，胡中海，孫志高，等.魚腥草的生物活性及其機理研究進展[J].食品科學,2014,35(23):354-358.

[7] 張壯麗,趙 寧,趙志鴻等.魚腥草揮發(fā)油提取工藝優(yōu)化[J].中國醫(yī)藥科學,2015,5(1):82-85.

[8] Arjun Sapkota1,Bhakta Prasad Gaire1,Kyu Suk Cho,et al.Eupatilin exerts neuroprotective effects in mice with transient focal cerebral ischemia by reducing microglial activation[J].PLOS ONE,2017,12(2):e0171479.

[9]陳冠容.辛伐他汀的藥理作用及臨床新用途[J].老藥新用，2007，23（4）:20-21.

[10]王柏欣,王 昕,邱洪斌,等.辛伐他汀對大鼠腦缺血再灌注損傷細胞凋亡的影響[J].中國老年學雜志,2011,31(10):1826-1829.

[11]Sierra S,Ramos MC,Molina P,et al.Statins as neuroprotectants:a comparative in vitro study of lipophilicity,blood-brain-barrier penetration,lowering of brain cholesterol,and decrease of neuron cell death[J].J Alzheimers Dis,2011,23(2):307-318.

[12]Huang P,Zhou CM,Hu Q,et al.Cerebral care Granule attenuates blood-brain barrier disruption after middle cerebral artery occlusion in rats[J].Exp Neurol,2012,237(2012):453-463.