曹善茂，王瀟，劉鋼，李曉雨，劉陽

(大連海洋大學遼寧省海洋生物資源恢復與生境修復重點實驗室，遼寧大連116023)

巖扇貝Crassadoma gigantea隸屬于軟體動物門Mollusca、瓣鰓綱Lamellibranchia、珍珠貝目Pterioida、扇貝科Pectinidae，自然分布在北美太平洋沿岸，成年巖扇貝閉殼肌的大小、風味與其他幾種養(yǎng)殖扇貝相比有很大優(yōu)勢。目前，巖扇貝已經(jīng)被大連海洋大學引入中國并成功完成了室內(nèi)全人工育苗及海上試養(yǎng)殖工作[1]，并對其代謝[2－3]、營養(yǎng)成分[4]等進行了研究。巖扇貝作為新引進品種，幼貝能否在養(yǎng)殖地區(qū)的海域順利生長發(fā)育是非常關鍵的環(huán)節(jié)[5]。貝類致病、致死等情況涉及貝類抗氧化防御系統(tǒng)對環(huán)境因子的響應[6]，尤其在幼貝階段。扇貝稚貝和幼貝期生長速度和成貝相比較快[7]，稚貝和幼貝生長發(fā)育受環(huán)境因子的影響相比成貝也更明顯[8－9]，因此，研究環(huán)境因子對巖扇貝幼貝抗氧化系統(tǒng)的響應，對巖扇貝的養(yǎng)殖具有一定的參考意義。

貝類的抗氧化系統(tǒng)比較簡單，易受外界脅迫影響，其中超氧化物歧化酶 (SOD)、過氧化氫酶(CAT)和總抗氧化能力 (T－AOC)在很多對貝類環(huán)境脅迫的研究中被認為可以作為檢測指標[10]。影響這些酶活力的環(huán)境因子有溫度[11－12]、pH[13－14]、鹽度、規(guī)格和餌料等，在這些因子中溫度是影響抗氧化酶活力的重要因素。之前關于溫度對抗氧化酶活力的影響研究大多數(shù)集中在離體粗酶液提取后反應溫度對抗氧化酶活性的影響上[15]，這些研究結(jié)果對確定不同物種生物抗氧化酶活力的測定方法有參考價值，但與外界環(huán)境溫度變化對貝類體內(nèi)抗氧化酶活力的實際影響不同。關于溫度脅迫對貝類抗氧化酶活力影響的報道，也集中在以適宜貝類生長發(fā)育的水溫 (通常為15～20℃)為對照，通過升溫或者降溫來完成溫度脅迫[16]，這些研究對象都是成貝，而以低溫為起點逐漸升溫的溫度脅迫對幼貝抗氧化酶活力影響的研究很少。巖扇貝最適宜的生長溫度為15℃，在15℃條件下巖扇貝生長發(fā)育速度最快[1]。為此，本研究中在實驗室模擬扇貝生長海域的溫度，從最低溫開始逐步升溫，檢測了巖扇貝幼貝鰓組織中3種抗氧化酶活力在一定時期隨溫度的變化情況，旨在為巖扇貝幼貝養(yǎng)殖技術的完善和推廣、養(yǎng)殖生產(chǎn)中分苗時機的把握，以及對幼貝的養(yǎng)殖管理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用巖扇貝親貝于2015年11月自加拿大溫哥華引進，親貝于2016年2月經(jīng)人工育苗得到稚貝，稚貝經(jīng)海上中間育成，于2016年5月將所得子一代幼貝移至大連市龍王塘海域養(yǎng)殖至12月齡，取殼長為(36.39±4.45)mm、殼高為(37.62±6.37)mm的幼貝400枚，于大連海洋大學遼寧省海洋生物資源恢復與生境修復重點實驗室進行試驗。試驗用海水經(jīng)過沙濾罐過濾，用循環(huán)水控溫裝置進行控溫，餌料來自圓柱形高密度餌料培養(yǎng)裝置。

1.2 方法

1.2.1 暫養(yǎng)與管理 將試驗用400枚巖扇貝幼貝暫養(yǎng)在實驗室海水循環(huán)水控溫裝置中，水溫為(4.1±0.2)℃，鹽度為 (31.3±0.2)，pH 為(8.14±0.15)。暫養(yǎng)期間連續(xù)充氣，循環(huán)水，每天全量更換海水1次，每天4:00、10:00、16:00、22:00投喂新月菱形藻、湛江等邊金藻混合餌料，第二天虹吸出幼貝殘餌、糞便等雜質(zhì)，及時清理死貝，暫養(yǎng)7 d后開始試驗。

1.2.2 溫度處理及取樣 根據(jù)對大連市龍王塘海區(qū)2015年全年海水溫度追蹤測量 (全年水溫變化在3.8～23.8℃)， 設定 5、 10、 15(對照)、 20、25℃ 5個溫度試驗組，實測平均溫度分別為(5.2±0.2)、 (9.7±0.2)、 (15.2±0.2)、 (20.4±0.2)、 (25.3±0.2)℃，每個溫度組設3個平行，每個平行試驗組放25枚幼貝。水溫從 (4.1±0.2)℃開始，以每天1℃的幅度進行升溫，到達設定溫度時開始計時，分別在計時后1、6、12、24、48 h時隨機挑選幼貝進行抗氧化酶活力測定試驗，每個溫度組的每個時間點設3組平行試驗。1.2.3 內(nèi)臟、鰓組織上清液的制備 從每個平行組隨機取3枚幼貝，然后在冰盤上取幼貝的內(nèi)臟組織和鰓組織，分別稱其質(zhì)量，按質(zhì)量體積比為1 mg∶4 mL加入預冷的生理鹽水，用電動勻漿機(10 000 r/min)在冰浴條件下勻漿3 min，勻漿液經(jīng)離心機以3500 r/min離心10 min，取上清液備用。由于內(nèi)臟組織每個溫度時間點上的酶活力測定值誤差偏差較大，故本試驗中僅選用巖扇貝鰓組織上清液進行酶活力測定。

1.2.4 抗氧化酶活力的測定 對鰓組織上清液分別進行SOD、CAT活力和T－AOC能力的測定。酶活力的測定使用南京建成科技有限公司試劑盒。根據(jù)計算要求，每次測量設置空白對照管、標準對照管、測定管，每管設置3個平行，計算方法和原理均參照試劑盒說明書。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析，用Duncan進行多重分析，試驗數(shù)據(jù)均用平均值±標準差表示，顯著性水平設為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度脅迫下巖扇貝幼貝鰓組織中SOD活力的變化

從圖1可見:溫度在5℃時，SOD活力相對于其他溫度組均較低，各個時間點SOD活力均顯著低于其他溫度組 (P＜0.05)；隨著溫度逐漸升高，10、15、20、25℃組SOD活力保持較高值，比較穩(wěn)定；在溫度脅迫1 h時，10℃組與15℃組無顯著性差異 (P＞0.05)，20℃與25℃組無顯著性差異 (P＞0.05)，其他溫度組間均有顯著性差異(P＜0.05)；脅迫時間超出6 h時，上述4個溫度組間均無顯著差異 (P＞0.05)。

在受脅迫的48 h內(nèi)，5℃組SOD活力略有下降；10、15℃組SOD活力隨著試驗時間的延長相對穩(wěn)定；20℃組SOD活力在溫度脅迫12 h時最高；25℃組SOD活力在溫度脅迫24 h時最高。

圖1 溫度漸變對巖扇貝幼貝SOD酶活力的影響Fig.1 Impact of gradual change in temperaturet on SOD activity in rock scallop Crassadoma gigantea

2.2 溫度脅迫下巖扇貝幼貝鰓組織中CAT活力的變化

從圖2可見:在溫度逐漸升溫的過程中，5、10、15、20℃組CAT活力比較穩(wěn)定且組間無顯著性差異 (P＞0.05)，這4個組的CAT活力均小于25℃組；溫度脅迫1 h時，僅20℃和25℃組的CAT活力有顯著性差異 (P＜0.05)；溫度脅迫6 h時，5個溫度組均無顯性著差異 (P＞0.05)；溫度脅迫12 h時，5、20℃組均與25℃組有顯著性差異 (P＜0.05)；溫度脅迫24 h時，僅5℃與25℃組的CAT活力有顯著性差異 (P＜0.05)；溫度脅迫48 h時，5、10、15℃均與25℃組有顯著性差異 (P＜0.05)。

在溫度脅迫的48 h內(nèi)，5℃組的CAT活力略有下降后基本不變；10、15、20℃組的CAT活力基本穩(wěn)定；25℃組CAT活力緩慢上升。

圖2 溫度漸變對巖扇貝幼貝CAT酶活力的影響Fig.2 Impact of gradual change in temperaturet on CAT activity in rock scallop Crassadoma gigantea

2.3 溫度脅迫下巖扇貝幼貝鰓組織中T－AOC能力的變化

從圖3可見:在溫度逐漸升溫的過程中，15℃組幼貝鰓組織中T－AOC能力均顯著高于其他溫度組 (P＜0.05)；溫度脅迫1～6 h時，15℃組TAOC能力顯著高于其他4組 (P＜0.05)，5℃組顯著低于其他4組 (P＜0.05)；脅迫12～48 h時，15℃組T－AOC能力顯著高于25℃組 (P＜0.05)，二者均顯著高于10、20℃組 (P＜0.05)，而5℃組顯著低于其他4組 (P＜0.05)?？梢姡瑴囟葟?5℃升高或降低，T－AOC能力都會顯著下降 (P＜0.05)，溫度從15℃降低至5℃時，T－AOC能力的下降幅度顯著高于溫度從15℃升高至25℃時T－AOC能力的下降幅度 (P＜0.05)。

在受脅迫的48 h內(nèi)，5、10、20℃組T－AOC能力較穩(wěn)定，15、25℃組的T－AOC能力略有升高。

圖3 溫度漸變對巖扇貝幼貝T－AOC能力的影響Fig.3 Impact of gradual change in temperaturet on TAOC capacity in rcok scallop Crassadoma gigantea

3 討論

3.1 水溫脅迫對巖扇貝幼貝鰓組織抗氧化酶活力的影響

溫度是水生生物尤其是貝類生存環(huán)境的關鍵因素之一，海洋生物的生長、繁殖和抗氧化能力等都與海水溫度密切相關，尤其在夏季持續(xù)高溫和春季水溫從低溫回升時，貝類死亡率明顯增加，很容易造成大面積死亡的現(xiàn)象。溫度過高或者過低都會在貝類體內(nèi)產(chǎn)生過多的自由基，這些自由基在體內(nèi)積累會對貝類造成一定損傷甚至死亡。在貝類的抗氧化體系中，主要依靠SOD、CAT來清除過多的自由基，尤其是SOD，其活力和生物體免疫水平息息相關[17]。SOD是一種還原酶，存在多種異構體，能夠直接作用于超氧陰離子(O2－·)，并與其發(fā)生歧化反應，生產(chǎn)危害較低的過氧化氫和分子氧，減輕自由基對機體的損害。CAT與SOD具有協(xié)同作用，可將SOD催化生成的過氧化氫催化生成氧氣和水，以消除超氧陰離子等中間產(chǎn)物對細胞的毒害。T－AOC是體現(xiàn)抗氧化體系的抗氧化能力總和，包含了直接作用在自由基或是間接消耗掉容易生成自由基的物質(zhì)，防止自由基在機體內(nèi)發(fā)生進一步反應。

本研究中設計了5組不同溫度試驗組，從低溫逐步升溫完成溫度脅迫試驗，涵蓋了大連市龍王塘海域2015年全年海水溫度跨度范圍 (全年水溫變化在3.8～23.8℃)，探究了水溫脅迫對巖扇貝幼貝鰓組織中抗氧化酶活力的變化。本研究中發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的升高，當溫度為15～25℃時，巖扇貝鰓幼貝組織中SOD活力無顯著性差異，CAT活力緩慢上升，在25℃時CAT活力達到最高，T－AOC水平在溫度超過15℃時顯著下降，這與賁月等[18]發(fā)現(xiàn)溫度從15℃漸變升溫到26℃過程中，隨著溫度升高蝦夷扇貝體腔液中CAT活力顯著升高、SOD活力差異不顯著、T－AOC能力先顯著下降后逐漸回復的結(jié)果基本一致。本研究中還發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的降低，當溫度從15℃降至5℃時，溫度變化對CAT活力影響不明顯，這與時少坤[19]對雜交鮑抗氧化酶研究結(jié)果中溫度由18℃降至6℃時CAT活力與對照組18℃無顯著性差異的結(jié)果也是一致的。本研究中，5℃時SOD活力顯著低于10、15、20、25℃組，可見低溫對巖扇貝幼貝鰓組織中SOD活力有著明顯的抑制作用；T－AOC水平在溫度從15℃降至5℃時顯著下降，下降幅度大于從15℃升到25℃時T－AOC的下降水平，這表明低溫對巖扇貝幼貝鰓組織中T－AOC活力有著明顯的抑制作用。

3.2 水溫脅迫試驗中影響巖扇貝幼貝鰓組織抗氧化酶活力的其他因素

溫度變化的過程中往往會引起抗氧化酶表達和活力增加[20－22]，但是抗氧化酶的變化涉及到很多復雜的因素交互影響。一是，試驗物種的不同會導致溫度對生物體的抗氧化酶活力影響的不同，王文文[23]、孔祥會等[24]研究表明，菲律賓蛤仔Ruditapes philippinarum、鋸緣青蟹Scylla serrata在低溫下可以保持高水平的抗氧化酶活力，低溫下菲律賓蛤仔、鋸緣青蟹體內(nèi)SOD、CAT活性水平已經(jīng)高出其生長發(fā)育最適溫度下的活性，這與溫度對扇貝抗氧化酶活力影響的研究結(jié)果不符[18]；二是，試驗對象發(fā)育時期不同，如本試驗中使用小規(guī)格幼貝，小規(guī)格貝類單位組織干重耗氧率和排氨率較大，代謝作用與成貝相比較強[25]，受溫度的波動及低溫和高溫等惡劣環(huán)境的影響較大，高振錕等[26]研究證明了小規(guī)格蝦夷扇貝在受一定溫度波動后死亡率高于大規(guī)格扇貝，成貝能夠適應一定范圍的水溫變化，尤其是對低溫環(huán)境的適應能力尤為明顯，成貝和幼貝的抗氧化酶活力對低溫的響應也不一樣[16，26]；三是，試驗設定溫度范圍、降溫方式和脅迫時間不同，很多研究是以適溫 (15℃左右)作為對照，分別升溫、降溫來完成的，而在低溫脅迫條件下，很多研究得出的結(jié)果與在常溫下的結(jié)果不一致甚至相反[27]，類似結(jié)果不一致的還有一些急性惡劣條件對貝類抗氧化酶活力的研究[26－29]，生物體若受到輕度逆境脅迫，其體內(nèi)的SOD活力往往會升高[30－31]，若受到重度或長時間逆境脅迫，SOD活力通常降低，這就促使生物體內(nèi)積累活性氧，從而對生物體造成損害[32－33]。本研究中的低溫和高溫就是一種逆境，在低溫條件下SOD活力、T－AOC能力均低于15℃時的活力。綜合溫度對3種抗氧化酶活力的影響，結(jié)果表明，15℃條件下巖扇貝幼貝抗氧化酶活力較高，從抗氧化酶活力變化證明15℃是巖扇貝生長的最適宜溫度。

綜上所述，在每天升溫1℃的條件下，高溫對巖扇貝幼貝鰓組織中SOD活力影響不明顯，對CAT活力有著明顯的誘導作用，對T－AOC能力有著明顯的抑制作用；低溫對巖扇貝幼貝鰓組織中CAT活力影響不明顯，對SOD、T－AOC能力有著明顯的抑制作用，其中低溫對T－AOC能力抑制程度比高溫大。綜合溫度對3種抗氧化酶活力的影響表明了15℃為巖扇貝幼貝抗氧化酶活力最高的溫度?？傊?，15℃巖扇貝幼貝抗氧化酶活力最高，溫度過低或過高對巖扇貝幼貝的抗氧化酶活力均產(chǎn)生顯著影響，這表明抗氧化酶活力可以作為巖扇貝對溫度脅迫檢測的指標，本研究結(jié)果可為巖扇貝幼貝養(yǎng)殖技術的完善和推廣、養(yǎng)殖生產(chǎn)中分苗時間的把握及幼貝的養(yǎng)殖管理提供參考。

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