王旭榮，李文杰，張淑霞，張 康，王海瑞，張景艷，李建喜*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅蘭州 730050；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

乳房出血是由各種不良因素作用于乳房，引起輸乳管、腺泡及其周圍組織血管發(fā)生破裂而發(fā)生出血，血液進(jìn)入乳汁，以產(chǎn)后最初幾天最為常見。一般是由于乳房挫傷所致，如果一些產(chǎn)后母牛伴有血小板減少或其他血凝障礙性疾病，也易發(fā)生乳房出血[1]。乳房出血以后，為微生物的生長提供了豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，加劇了乳房炎發(fā)生的幾率，而微生物產(chǎn)生的毒素又可以加重出血，造成惡性循環(huán)，給治療帶來困難。金黃色葡萄球菌可引起出血性乳房炎，溶血素是該菌的一種重要的致病因子，溶血素分為α、β、γ、δ 4種類型[2]，對人類有致病作用的主要是α溶血素，而造成奶牛乳房炎的牛源金黃色葡萄球菌主要表現(xiàn)為β溶血[2-3]，而且金黃色葡萄球菌的β溶血素能夠損傷奶牛乳房上皮細(xì)胞， 增加α溶血素對機(jī)體的損害，促進(jìn)該菌對奶牛乳腺上皮細(xì)胞的黏附和增殖。劉美清等[4]發(fā)現(xiàn)從人的痰液、血液、傷口分泌物等樣本中分離的雙溶血環(huán)的金黃色葡萄球菌有比例增加的趨勢。為此，隨著環(huán)境的不斷改變和藥物壓力的選擇，細(xì)菌的演化造成老病新發(fā)的態(tài)勢，應(yīng)引起臨床獸醫(yī)工作者的重視。

2016年12月甘肅省白銀市某奶牛場有5頭產(chǎn)后奶牛出現(xiàn)血乳，患病乳區(qū)紅、腫、熱、痛，即局部增溫，患病乳區(qū)明顯腫脹，擠乳躲避有痛感，有的乳房血腫非常嚴(yán)重，乳房皮膚呈紅色甚至紫紅色；出血較為嚴(yán)重，乳汁為暗紅色絮狀。病牛精神委頓，體溫升高至41℃，食欲減少，反芻次數(shù)減少。使用青霉素、阿莫西林配合止血敏治療無效?？紤]到乳房出血一般是由碰撞、挫傷引起，在我們采樣的同時，建議牛場先檢查擠奶設(shè)備和排查飼養(yǎng)環(huán)境，但未發(fā)現(xiàn)造成乳房損傷的環(huán)境性因素。為查明造成該奶牛場出血性乳房炎的病因、病原菌及藥物敏感性，為該場的本次發(fā)病提供有效的防治措施和建議，進(jìn)行相關(guān)實驗室檢測,具體報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 按照農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《奶牛乳房炎乳汁中金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌、無乳鏈球菌分離鑒定方法》(NY/T2962-2016)的乳樣采集方法。先用溫水清洗5頭患病奶牛的乳房，然后依次用2 mL/L新潔爾滅浸泡的紗布、750 mL/L酒精棉擦拭消毒乳頭。每個乳頭棄去初始2把～3把奶，然后按無菌操作規(guī)程分別采集患病乳室的乳樣約5 mL，采集的乳樣保存于乳樣采集管中，做好記錄。在采樣箱中加入生物冰袋或冰塊，使乳樣溫度保持在2℃～8℃，立即帶回實驗室檢驗。采集的典型血乳如圖1所示。

圖1 患病奶牛的典型血乳Fig.1 The blood milk of the sick dairy cow

1.1.2 主要試劑和培養(yǎng)基 營養(yǎng)肉湯和血瓊脂平板，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品；兔血漿，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Premix ExTaqDNA聚合酶、DNA Marker、細(xì)菌DNA提取試劑盒、16 S rDNA BacteriaL Identification PCR Kit均，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;青霉素G、阿莫西林、頭孢西丁、苯唑西林、頭孢吡肟、四環(huán)素、紅霉素、慶大霉素、利福平、萬古霉素、夫西地酸、利奈唑胺、克林霉素、奎奴普丁、呋喃妥因、磺胺甲惡唑、泰利霉素、美羅培南、環(huán)丙沙星、氯霉素等藥敏紙片，Oxoid公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離與純化 按照農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《奶牛乳房炎乳汁中金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌、無乳鏈球菌分離鑒定方法》(NY/T2962-2016)中的乳樣接種方法，將待檢乳樣搖勻，無菌操作，用接種環(huán)取2環(huán)～3環(huán)待檢乳樣，間斷劃線接種于血瓊脂平板上，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h～24 h，觀察細(xì)菌生長情況。為了進(jìn)一步檢驗是否有厭氧致病菌的存在，同時每份乳樣分別接種于血瓊脂平板，培養(yǎng)于厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)18 h～24 h，觀察細(xì)菌生長情況。然后挑取細(xì)菌單菌落進(jìn)行涂片、革蘭染色、鏡檢、純化，并將純化后的細(xì)菌保存做好標(biāo)記，然后進(jìn)行下一步鑒定。

1.2.2 生化鑒定 對待檢細(xì)菌進(jìn)行接觸酶試驗和血漿凝固酶試驗。

1.2.2.1 接觸酶試驗 按照農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《奶牛乳房炎乳汁中金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌、無乳鏈球菌分離鑒定方法》(NY/T2962-2016)的接觸酶試驗操作方法，取30 mL/L H2O2溶液1滴～2滴置于干凈載玻片上，然后加一接種環(huán)被檢菌落，與H2O2滴液混合，立即產(chǎn)生氣泡者為陽性，不產(chǎn)生氣泡者為陰性。

1.2.2.2 血漿凝固酶試驗 選用商品化的兔血漿試劑，按說明書操作。在每支含有兔血漿的西林瓶中加入0.5 mL滅菌生理鹽水輕微搖晃至完全溶解，然后加入0.3 mL金黃色葡萄球菌肉湯培養(yǎng)物充分混合后，置于37℃培養(yǎng)箱，每30 min觀察1次，觀察6 h，如呈現(xiàn)凝即傾斜或倒置時，呈現(xiàn)凝塊或者凝固體積大于原體積的一半，被判定為陽性結(jié)果。本實驗室保存的金黃色葡萄球菌作為陽性對照菌株，無菌LB肉湯為陰性對照。

1.2.3 16 S rDNA序列分析 用接種環(huán)挑取細(xì)菌單菌落置于含有1 mL生理鹽水的1.5 mL 離心管中，渦旋3 min～5 min，充分混勻。12 000 r/min離心，去掉上清，嚴(yán)格按照細(xì)菌DNA提取試劑盒操作說明書提取被檢細(xì)菌的DNA，并以此為模板，選擇16 S rDNA Bacterial Identification PCR Kit 中的 forward primer和reverse primer擴(kuò)增16 S rDNA 片段，而后進(jìn)行核酸凝膠電泳。擴(kuò)增的目的片段由北京六合華大基因科技股份有限公司測序,所得序列在NCBI( http：// ncbi．nLm．nih．gov /) 的在線 Blast軟件對獲取的序列進(jìn)行搜索比對，并確定細(xì)菌種屬。

1.2.4 動物致病性試驗 取18只清潔級昆明小鼠，隨機(jī)分成6組，1組對照組和5組試驗組。5株金黃色葡萄球菌分離株分別接種到營養(yǎng)肉湯中，37℃培養(yǎng)18 h，與比濁管相比，細(xì)菌濃度約為1.0×109個/mL。取肉湯培養(yǎng)物0.1 mL，分別腹腔注射試驗組小鼠，對照組注射等量生理鹽水。隨時觀察小鼠發(fā)病情況。

1.2.5 藥物敏感試驗 將待檢測的分離菌株接種到到LB肉湯，置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)12 h～18 h制成菌懸液。使用比濁儀對菌懸液標(biāo)定到0.5麥?zhǔn)媳葷岫龋s1.0×108CFU/mL，將標(biāo)定好的菌懸液，用滅菌棉拭子將待檢細(xì)菌混懸液涂布于新鮮的MH培養(yǎng)基,涂布均勻，立即貼上藥敏紙片，用滅菌鑷子輕壓紙片使其與平皿緊密接觸不易掉落，之后放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑(mm)。結(jié)合臨床用藥實際情況選擇藥敏紙片，藥物敏感性判斷嚴(yán)格參考《CLSI的抗菌藥物敏感性試驗執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)2013》，藥敏紙片的規(guī)格及判斷標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 抗菌藥物敏感性試驗執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)

注：“-”表示無相關(guān)數(shù)值。

Note：“-”means no data.

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離結(jié)果

從采集的5份奶樣中均分離到同一類需氧兼性厭氧菌，有氧條件下，血瓊脂平板上菌落形態(tài)均為濕潤、光滑、隆起的圓形菌落，初呈灰白色，放置過夜后呈現(xiàn)金黃色，菌落周圍形成明顯的β溶血環(huán)，厭氧條件下，菌落稍小。革蘭染色后鏡檢，發(fā)現(xiàn)分離的細(xì)菌均為G+，球形或橢圓形，成對排列，或呈葡萄狀，初步確定為葡萄球菌屬的細(xì)菌，疑似金黃色葡萄球菌。

2.2 生化鑒定

5株分離菌均為接觸酶試驗陽性；5株分離菌均為血漿凝固酶試驗陽性，陽性對照和陰性對照均成立。

2.3 16 S rDNA 序列分析

分別以5株分離株的細(xì)菌 DNA 為模板，用16 S rDNA PCR擴(kuò)增試劑盒，擴(kuò)增片段的長度約1.5 kb(圖2)，擴(kuò)增片段由北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測序，所得序列通過在線 BLAST軟件進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，5株分離菌株與GenBank中的參考序列金黃色葡萄球菌FORC026(基因序列號CP013132.1)、金黃色葡萄球菌2148N(基因序列號CP016856.1)、金黃色葡萄球菌08-02119(基因序列號CP015645.1)的同源性為99%，故確定分離的5株細(xì)菌為金黃色葡萄球菌。

M．DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000 ；1～5. 5株分離株的16 S rDNA PCR基因片段；6.空白對照

M．DNA Marker DL 2 000；1-5.Gene fragments of 16 S rDNA PCR from 5 isolates；6.Blank control

圖2 5株分離菌的16 S rDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果

Fig.2 PCR results of 16 S rDNA from 5 isolates

2.4 致病性試驗

腹腔注射6 h后，小鼠出現(xiàn)萎靡不振、蜷縮，10 h～12 h后出現(xiàn)嗜臥不動、全身發(fā)抖等癥狀，24 h～48 h后試驗組小白鼠均死亡。解剖小鼠，24 h內(nèi)死亡的小鼠眼觀未見明顯的實質(zhì)臟器病變，24 h～48 h死亡的小鼠肝臟、脾臟、腎臟有出血點，從小鼠的肝、脾等實質(zhì)臟器中分離金黃色葡萄球菌。對照組小鼠正常。

2.5 藥敏試驗

藥敏試驗結(jié)果表明，在檢測的20種藥物中，此次分離的5株金黃色葡萄球菌對青霉素、阿莫西林和克林霉素耐藥率均為100%，對慶大霉素耐藥率為40%，對其他16種抗菌藥物敏感(表2)。

表2 5株金黃色葡萄球菌對20種抗菌藥物的敏感性試驗結(jié)果

3 討論

金黃色葡萄球菌是造成乳房炎的重要致病菌之一，隨著奶牛產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，金黃色葡萄球菌性乳房炎的發(fā)病率下降，但隨著飼養(yǎng)環(huán)境的改變和藥物壓力的影響，細(xì)菌演化也在持續(xù)不斷的進(jìn)化，出現(xiàn)了老病新發(fā)的態(tài)勢。林杰等已發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌可引起頑固性乳房炎[5]，而且也出現(xiàn)一些突變株，突變株的生物學(xué)特性和致病性發(fā)生了一定的變化[6-8]，這些新情況的出現(xiàn)為疾病防控帶來新的難點和挑戰(zhàn)。2016年底甘肅省白銀市某奶牛場產(chǎn)后奶牛出現(xiàn)血乳，檢查擠奶設(shè)備和排查飼養(yǎng)環(huán)境均無異常，在采集的病樣中均分離到β溶血金黃色葡萄球菌，而且動物致病性試驗表明有較強(qiáng)的致病性，結(jié)合本場曾多次發(fā)生金黃葡萄球菌性乳房炎的生物背景，說明該場一直存在致病性金黃色葡萄球菌，造成此次發(fā)病的主要原因是β溶血性金黃色葡萄球菌的感染。而且產(chǎn)后奶牛體質(zhì)弱，或許有血小板減少或其他血凝障礙性疾病的誘發(fā)，導(dǎo)致臨床癥狀嚴(yán)重，建議該場對部分產(chǎn)后奶牛進(jìn)行血液指標(biāo)進(jìn)行監(jiān)測，排除患病隱患。雖然國內(nèi)隨著乳房炎防控技術(shù)的提高，金黃色葡萄球菌引起的乳房炎發(fā)病率下降，但是由于牛群感染該菌后，容易形成慢性感染且易復(fù)發(fā)[9]，而且新的研究結(jié)果表明攜帶不同毒力因子的金黃色葡萄球菌其接觸傳染性風(fēng)險不同[10]，故有金黃色葡萄球菌感染的生物背景的牛場仍不能放松對該病原的監(jiān)測。

此次病例發(fā)生后，該場使用青霉素、阿莫西林配合止血敏治療無效。筆者通過藥物敏感性試驗，發(fā)現(xiàn)此次分離的金黃色葡萄球菌對青霉素、阿莫西林的耐藥率為100%，對苯唑西林、頭孢類藥物等其他16種藥物敏感。結(jié)合我國批準(zhǔn)的《無公害農(nóng)產(chǎn)品 獸藥使用準(zhǔn)則》(NY/T5030-2016)，建議使用苯唑西林，配合使用止血藥物，并且減少擠乳次數(shù)，檢查維護(hù)擠奶設(shè)備，病情得以控制。該病例的診治為進(jìn)一步有效預(yù)防和治療金黃色葡萄球菌引起的出血性乳房炎提供參考，而且提示獸醫(yī)臨床工作者對“老病新發(fā)”的臨床表現(xiàn)要重視，在日常工作中應(yīng)多加注意，切實做好牛場中一些病原的持續(xù)監(jiān)測工作。

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