劉 暢，曹鈺晗,趙春陽，徐璐堯，張文勁，賴金倫，陳穎鈺,2，郭愛珍,2，胡長敏,2*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖北武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室，湖北武漢 430070)

乳腺炎是養(yǎng)牛業(yè)最常見重要疾病之一，其臨床特征表現(xiàn)為乳房炎癥及產(chǎn)奶量和牛乳質(zhì)量的下降，主要流行病學(xué)特征為發(fā)病率高、發(fā)病范圍廣、病因復(fù)雜及防治困難[1]。奶牛乳腺炎的發(fā)生發(fā)展與病原微生物、環(huán)境、管理等因素密切相關(guān)，同時與奶牛自身的天然免疫機能密切相關(guān)。

天然免疫又稱先天性免疫或固有免疫，是防止病原微生物進入宿主體內(nèi)的第一道防線，與獲得性免疫共同構(gòu)成機體的免疫系統(tǒng)。天然免疫中的重要組成部分——模式識別受體(pattern recognition receptors,PRRs)的研究成為熱點。模式識別受體存在于多種動植物細(xì)胞中，且能夠通過識別病原微生物的保守序列——病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMP)來判斷和識別不同于機體自身的“非我”病原微生物，進而啟動相關(guān)反應(yīng)。模式識別受體主要包括Toll樣受體家族(Toll-like receptors,TLRs)、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域蛋白受體家族(nucleotide binding oligomerization domain(NOD)-like receptors,NLRs)、維甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ型受體家族 (retinoic acid-induced gene-Ⅰ like helicases,RLHs)及HIN-200蛋白家族。本文對核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域蛋白(nucleotide binding oligonucleotide dimerization domain,NOD)家族中NOD1、NOD2在奶牛乳腺炎中的最新研究情況進行綜述。

1 NOD樣蛋白受體家族

NOD樣蛋白受體家族是一類存在于胞漿內(nèi)含有核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域的可溶性蛋白家族，且遺傳高度保守。NOD樣受體家族與多種疾病和自發(fā)炎癥失調(diào)密切相關(guān)，如克羅恩病、布勞綜合征、哮喘、周期熱、穆韋二氏綜合征、癌癥及心血管疾病等。

哺乳動物中NOD樣受體家族成員有20余個，根據(jù)NOD樣受體家族分子效應(yīng)區(qū)的不同可將NOD樣受體家族分為以下幾個亞類：即NODs、NALPs(NACHT-LRR-PYD-containing proteins)、CIITA(MHC class Ⅱ transcription activator)、IPAF(ICE(IL-1β-converting enzyme)-protease-activating factor)與NAIP(neuronal apoptosis inhibitor protein)[2]。

NOD樣受體家族分子包括3個特異性結(jié)構(gòu)域，N端的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域，不同亞類的組成不同，可為熱蛋白結(jié)構(gòu)域(pyrin domain，PYD)，也可為半胱天冬酶活化募集結(jié)構(gòu)域(caspase-activiting and recruitment domain，CARD)，兩者雖結(jié)構(gòu)不同但均可募集下游效應(yīng)信號分子；中央是核苷酸結(jié)合寡聚化區(qū)域(nucleotide-binding and oligomerization，NACHT)(又稱NOD結(jié)構(gòu)域)，具有結(jié)合核酸及ATP酶活性，對NOD樣受體家族的寡聚體化和活化極為重要；C端為富亮氨酸重復(fù)序列(leucine-rich-repeat,LRR)結(jié)構(gòu)域，可探測和識別配體(包括保守的 PAMP或其他配體)，同時也介導(dǎo)自身調(diào)控和蛋白間的相互反應(yīng)[3]。

NOD樣受體家族信號通路起始于C端LRR結(jié)構(gòu)域識別相應(yīng)的PAMP，當(dāng)PAMP直接或間接結(jié)合到 LRR 后，NOD樣受體家族分子通過改變構(gòu)象，暴露出中央的NACHT結(jié)構(gòu)域，從而觸發(fā)寡聚體化(可能形成六聚體或七聚體)，同時暴露出N端的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域，啟動下游信號通路[4]。

2 NOD1與NOD2作用研究

2.1 NOD1與NOD2 異同

NOD1(又名CARD4)與NOD2(又名CARD15)是NOD樣受體家族中最早發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞內(nèi)模式識別受體，分別識別細(xì)菌的細(xì)胞壁成分肽聚糖(peptidoglycan，PGN)中特定的分子[5]。兩者在結(jié)構(gòu)與作用上相似卻略有不同，本文在此進行簡單總結(jié)。

NOD1與NOD2的N端均為CARD區(qū)域，但NOD1只有1個 CARD 結(jié)構(gòu)域而 NOD2有2個；位于中央的NACHT區(qū)域，該區(qū)域包含P環(huán)(P-loop,或稱Walk A Box)和Mg2+結(jié)合位點(Walker B Box)，可介導(dǎo)NOD1和NOD2分子自身發(fā)生寡聚反應(yīng)[6]。此外，NOD1和NOD2功能上有所區(qū)別，NOD1和NOD2均可識別細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖結(jié)構(gòu)，但NOD1能夠識別的最小配體是肽聚糖中的γ-谷氨?；?D-內(nèi)消旋-二氨基庚二酸(γ-D-glutamyl-meso-diaminopimelic acid，iE-DAP)，NOD2識別肽聚糖中結(jié)構(gòu)高度保守的胞壁酰二肽(muramyl dipeptide，MDP)。

NOD1/2有著相似的結(jié)構(gòu)和功能，但是可能也因為結(jié)構(gòu)上細(xì)微的差異決定其功能、配體的不同。

2.2 NOD1在天然免疫反應(yīng)中作用機制研究

NOD1除可被細(xì)菌激活外，還可被其他微生物激活。研究證明 ，NOD1能夠廣泛表達于呼吸系統(tǒng)的呼吸道上皮細(xì)胞及肺部組織，且肺部感染煙曲霉菌時NOD1的表達水平顯著上調(diào)，表明NOD1在真菌感染時發(fā)揮一定的作用[7]。丙型肝炎病毒(HCV)的RNA依賴性RNA聚合酶NS5B具有復(fù)制活性，NS5B刺激原代和傳代肝細(xì)胞可激活NOD1通路，表明肝細(xì)胞的NOD1可識別病毒復(fù)制過程中產(chǎn)生的雙鏈RNA，并且介導(dǎo)天然免疫的產(chǎn)生[8]。也有研究表明巨噬細(xì)胞中NOD1/RIP2信號通路能被氧化型低密度脂蛋白激活并且呈現(xiàn)劑量依賴性，NOD1/RIP2信號通路激活后促使巨噬細(xì)胞的炎性活化及其表型變化，這可能是其參與動脈粥樣硬化形成和發(fā)展過程的主要機制[9]。這些結(jié)果均提示NOD1可調(diào)控宿主天然免疫進程進而在多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

2.3 NOD2在天然免疫反應(yīng)中的作用機制研究

NOD2能識別細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的裂解產(chǎn)物MDP，并廣泛參與細(xì)胞內(nèi)病原微生物的識別及炎癥應(yīng)答，但有研究表明NOD2也可識別病毒組分。Sabbah A等[10]研究發(fā)現(xiàn)，NOD2能對單鏈RNA產(chǎn)生免疫應(yīng)答并能激活I(lǐng)RF3產(chǎn)生IFN-β，感染呼吸道合胞體病毒、胞疫性口炎或者流感病毒(均為含有單鏈RNA基因組的病毒)均能觀察到NOD2介導(dǎo)的IRF3激活；研究發(fā)現(xiàn)NOD2可以識別皰疹病毒科中的人類巨噬細(xì)胞病毒(Human cytomegalovirus，HCMV)，該種病毒同時含有DNA和RNA，HCMV感染U373膠質(zhì)瘤細(xì)胞后NOD2表達量顯著升高，下游炎性因子如IFN-β、IL-8等表達升高，同時病毒復(fù)制受抑制，但用皰疹病毒1和皰疹病毒2進行相同試驗卻不能激活NOD2[11]。NOD2與黏膜免疫密切相關(guān)，大量研究表明人腸道疾病克羅恩病的發(fā)生與發(fā)展和NOD2的突變密切相關(guān)，Ramanan D等[12]研究發(fā)現(xiàn)NOD2可通過限制普通擬桿菌的擴散防止小腸炎癥發(fā)生。

綜上所述NOD2可被多種病原微生物激活，包含細(xì)菌和病毒等，同時NOD2參與腸道黏膜免疫，表明NOD2對于機體抵抗病原微生物感染以及觸發(fā)機體免疫反應(yīng)均發(fā)揮重要作用。

3 NOD1/2信號通路

TLRs和NLRs是目前被廣泛研究的模式識別受體，TLRs主要存在于細(xì)胞膜，而NLRs主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，識別躲避位于細(xì)胞膜的TLRs而進入胞內(nèi)的PAMPs，但是目前對于這些PAMP是如何躲避了TLRs的監(jiān)視進入細(xì)胞質(zhì)的機制還未明確，可能與胞吞作用有關(guān)。

3.1 NOD1/2經(jīng)典信號通路

NOD1/2 通過LRR區(qū)域識別進入細(xì)胞的PAMP，隨后自身寡聚化形成同源二聚體，并通過 CARD 結(jié)構(gòu)域招募同樣具有CARD結(jié)構(gòu)域的接頭分子受體互作蛋白RIP2(receptors interaction protein 2)，RIP2 是一種絲氨酸蘇氨酸激酶，使用RIP2抑制劑可以阻斷MDP對NOD2的激活作用。RIP2活化后直接接觸支架蛋白亞基 IKKγ(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase γ )，IKKγ是IKK(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase)復(fù)合物的調(diào)節(jié)亞基，通過激活I(lǐng)KKγ的輔酶和 IκB (inhibitor of nuclear factor kappa-B)激酶 IKKα 和 IKKβ，從而形成活化的IKK復(fù)合物，進而激活NF-κB信號通路[13]。此外，RIP2還能夠通過K63介導(dǎo)的泛素化過程招募并激活轉(zhuǎn)化生長因子β激活激酶1(TGFβ-activated kinase 1,TAK1)，TAK1后續(xù)激活MAPKs和IKK復(fù)合物，激活MAPKs和NF-κB信號通路[14]。

3.2 新發(fā)現(xiàn)的NOD1/2信號通路

隨著研究的深入，不少學(xué)者發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)部存在一些新的蛋白可參與或調(diào)控NOD1/2通路。Travassos L H等[15]發(fā)現(xiàn)NODs可將ATG16L1募集至細(xì)菌進入位點后互作，并以RIP2非依賴的方式促進自吞噬作用的發(fā)生。

同時，有研究發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞中存在一些細(xì)胞因子可參與NOD1/2信號通路的調(diào)節(jié)。Lecat A等[16]研究發(fā)現(xiàn)一種新的負(fù)調(diào)控蛋白JNKBP1，其可抑制MDP對NOD2信號通路的激活，且NOD2下游信號NF-κB的活化、IL-8的分泌、NOD2殺菌作用等亦受限。Park S等[17]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞中存在p62/SQSTM1蛋白通過穩(wěn)定NOD2寡聚化增強NOD2信號通路的活化及炎癥因子的表達。

由此可見，NOD下游作用分子不僅限于RIP2，還有多種下游分子參與或調(diào)控NOD信號通路的反應(yīng)進程。

4 NOD1/2與奶牛乳腺炎

奶牛乳腺炎是病原微生物侵入乳房后導(dǎo)致乳房紅腫、發(fā)炎、產(chǎn)奶量減少，甚至導(dǎo)致奶牛淘汰的一種奶牛高發(fā)病，給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的損失。同時，也給人類健康帶來巨大威脅。引發(fā)乳腺炎的主要病原微生物包括金黃色葡萄球菌、停乳鏈球菌、無乳鏈球菌及大腸埃希菌等。

徐丹丹等利用金黃色葡萄球菌構(gòu)建小鼠乳腺模型，隨NOD1、NOD2 mRNA表達升高，RIP2、NF-KB、IL-6及TNF-α的mRNA表達水平也升高，表明NOD1、NOD2可能參與金黃色葡萄球菌的識別及下游通路的激活，從而參與乳腺免疫應(yīng)答[18]。金黃色葡萄球菌刺激奶牛乳腺上皮細(xì)胞可促進NOD2水平升高，而滅活的金黃色葡萄球菌未有促進作用[19]，表明金黃色葡萄球菌既可作用于小鼠也可作用于奶牛乳腺細(xì)胞，并依賴于NOD1/2。

近年來，國內(nèi)外綜合防治乳腺炎措施以菌苗預(yù)防為主，葡萄球菌和鏈球菌引起的奶牛乳腺炎的發(fā)生率明顯下降，大腸埃希菌為主的腸道桿菌在奶牛乳腺炎主要病原菌中的優(yōu)勢地位日趨明顯。Roussel P等[20]發(fā)現(xiàn)MG1655、B1171、D6-117.29等3株大腸埃希菌可被牛乳腺上皮細(xì)胞識別，并激活NOD2觸發(fā)后續(xù)炎癥反應(yīng)。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是大腸埃希菌細(xì)胞壁的成分之一，常作為TLR4信號通路的特異性激動劑，但有研究表明粗提LPS(cLPS)可促進于牛中性粒細(xì)胞NOD1及促炎因子的表達；使用NOD1抑制劑ML130預(yù)刺激細(xì)胞，cLPS刺激細(xì)胞后促炎因子、黏附相關(guān)因子的表達量均下降，且中性粒細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力下降[21]。這些結(jié)果均表明大腸埃希菌性乳腺炎依賴于NOD1/2通路，但具體菌體中哪種蛋白或分泌產(chǎn)物激活通路仍需后續(xù)深入研究。

徐綺嬪等[22]發(fā)現(xiàn)MDP刺激牛乳腺成纖維細(xì)胞后，NOD2、IL-6、IL-8、TNF-α mRNA的表達均上調(diào)。李文文等[23]研究發(fā)現(xiàn)NOD受體表達下調(diào)或缺失是導(dǎo)致圍產(chǎn)期奶牛外周PMN細(xì)胞吞噬和呼吸爆發(fā)功能減弱的重要原因，并與乳腺炎的易感性有關(guān)。劉洋等[24]用MDP刺激小鼠乳腺后TNF -α mRNA 顯著升高，而 IL-6mRNA 沒有顯著升高，這可能與不同細(xì)胞對于MDP的應(yīng)答效應(yīng)不同有關(guān)。

綜上所述，病原微生物及其產(chǎn)物刺激乳腺后分別激活乳腺的不同細(xì)胞中NOD1/2信號通路，促進獲得性免疫及炎癥的發(fā)生發(fā)展，但具體病原微生物中的哪些組分激活NOD1/2通路以及激活的機理尚不清楚。

5 展望

本文對NOD1/2蛋白結(jié)構(gòu)、信號通路、NOD1/2與奶牛乳腺炎的關(guān)系等方面的最新研究進展進行了階段性總結(jié)。目前對于NOD樣受體家族受體的研究涵蓋方向較為全面，但其在不同疾病中是如何發(fā)揮作用、發(fā)揮怎樣的作用等問題仍有待研究。NOD樣受體家族作為重要的質(zhì)溶性模式識別受體，對于逃避了位于細(xì)胞膜上的模式識別受體而進入到細(xì)胞內(nèi)部的病原微生物及其產(chǎn)物發(fā)揮了抑制和/或清除作用。NOD1、NOD2被相應(yīng)的病原微生物或其代謝產(chǎn)物激活后活化下游轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄因子入核后啟動相關(guān)促炎因子(IL-6、TNF-α)趨化因子(CCL2等)以及多種效應(yīng)分子促進免疫應(yīng)答和炎癥的發(fā)生發(fā)展[25]。研發(fā)NOD樣受體家族受體激活劑或者阻斷劑可作為新型藥物的免疫佐劑或者免疫調(diào)節(jié)劑，參與新型免疫藥物對于某些炎性疾病、癌癥以及病毒性疾病的治療，但具體用法及用量仍需后期繼續(xù)研究。

奶牛乳腺炎是多種不良因素共同作用于乳腺導(dǎo)致的炎性疾病，除物理、化學(xué)、飼養(yǎng)管理等致病因素外，病原微生物種類復(fù)雜是引發(fā)該病的重要因素。目前研究表明，金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌刺激乳腺后觸發(fā)炎癥反應(yīng)均依賴于NOD1/2信號通路，但其他重要致病菌，如無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、綠膿桿菌侵襲乳腺誘發(fā)炎癥是否依賴于NOD信號通路卻鮮有報道，為今后的研究提供了方向。

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