付向晶，馮雪建，何 楊，張 繼

(鄭州大學(xué)藥學(xué)院鄭州大學(xué)國(guó)家藥物安全性評(píng)價(jià)研究中心/鄭州大學(xué)藥物關(guān)鍵制備技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450001)

炎癥是許多疾病的病變基礎(chǔ)，臨床上有“十病九炎” 一說(shuō)，多用非甾體類抗炎藥和腎上腺皮質(zhì)激素類等西藥進(jìn)行治療，雖然效果較好，但二者會(huì)有諸多不良反應(yīng)。而很多中藥都有良好的抗炎效果，且副作用較少。金花葵(HibiscusmanihotL.)為一年生草本錦葵科秋葵屬植物，又名菜芙蓉，雖未被《中國(guó)藥典》收載，但一些研究證明其有多種良好的藥理作用。金花葵在200多種秋葵植物中最具藥用、食用及保健價(jià)值[1]。本文旨在探討金花葵對(duì)小鼠急性炎癥發(fā)生發(fā)展的抑制作用，為開(kāi)發(fā)新的抗炎藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器及試劑 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，河南智誠(chéng)科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；電子天平，上海佑科儀器儀表有限公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司產(chǎn)品；全自動(dòng)脫水機(jī)、組織包埋機(jī)、切片機(jī)、染色封片一體工作站、圖像采集系統(tǒng)，德國(guó)徠卡有限公司產(chǎn)品；伊文思藍(lán)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司產(chǎn)品，批號(hào)：A1309044。

1.1.2 藥物 金花葵，來(lái)自安國(guó)市百子康藥行；復(fù)方醋酸地塞米松凝膠，江西吉安三力制藥有限公司產(chǎn)品，批號(hào)：151006；醋酸地塞米松片，福州海王福藥制藥有限公司產(chǎn)品，批號(hào)：1702220。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)昆明種小鼠60只，雌雄各半，體重18 g～22 g，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：No.41003100004522。

1.2 方法

1.2.1 金花葵提取物的制備 將金花葵全株50℃干燥，粉碎，過(guò)50目篩，加適量石油醚脫脂6 h，稱重，加40倍(m/V)量的800 mL/L乙醇，90 ℃水浴回流提取2 h，重復(fù)3次，合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至含原生藥1 g/mL，另配成每毫升含0.33 g和0.11 g原生藥，分別標(biāo)記為金花葵Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ溶液，置4℃冰箱備用。

1.2.2 金花葵對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響 采用腹腔染料滲出法，參照文獻(xiàn)[2]進(jìn)行，取30只小鼠，將小鼠隨機(jī)分成5組：動(dòng)物模型組、地塞米松組、金花葵Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組。每組6只，雌雄各半。陽(yáng)性藥物選擇醋酸地塞米松片，用量1.17 mg/kg。灌胃給藥，灌胃體積0.2 mL，連續(xù)5 d，每天1次。動(dòng)物模型組灌胃等體積生理鹽水，試驗(yàn)期間小鼠自由采食。末次給藥30 min后尾靜脈注射20 g/L伊文思藍(lán)生理鹽水溶液0.01 mL/只，隨即腹腔注射6 mL/L醋酸溶液0.2 mL/只，20 min后采用頸椎脫臼法處死小鼠。用5 mL生理鹽水沖洗腹腔，將洗液2 500 r/min離心5 min，取上清，檢測(cè)其在590 nm波長(zhǎng)處吸光值(OD)，以此表示色素滲出率。

1.2.3 金花葵對(duì)二甲苯致小鼠耳片腫脹的抑制作用 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組同1.2.2。陽(yáng)性藥物選擇復(fù)方醋酸地塞米松凝膠，用20 μL二甲苯均勻涂抹各組小鼠右耳內(nèi)外兩側(cè)，左耳涂以同體積蒸餾水作為對(duì)照。30 min后，動(dòng)物模型組右耳涂抹生理鹽水，其余組在右耳均勻涂抹相應(yīng)藥物，各組左耳均涂抹同體積生理鹽水。用藥1 h后采用頸椎脫臼法處死小鼠，沿耳廓基線剪下雙耳，分別在左右耳相同部位用9 mm打孔器打下耳片，立即稱重，以左右兩耳片質(zhì)量差值表示腫脹度，并與模型組比較計(jì)算耳片腫脹抑制率。具體操作方法參考文獻(xiàn)[3]方法進(jìn)行。

耳片腫脹率(%)=(右耳片質(zhì)量-左耳片質(zhì)量)/左耳片質(zhì)量×100%

耳片腫脹抑制率(%)=(模型組平均腫脹率-藥物組平均腫脹率)/模型組平均腫脹率×100%

1.2.4 金花葵對(duì)角叉菜膠致小鼠足腫脹的抑制作用 動(dòng)物分組和用藥同1.2.2。將25 μL 10 g/L角叉菜膠注射于小鼠左足趾掌側(cè)皮下，右側(cè)注射等體積生理鹽水作為對(duì)照。用藥后2 h處死小鼠，沿踝關(guān)節(jié)下緣剪下左右兩足，準(zhǔn)確稱量，記錄數(shù)據(jù)，計(jì)算腫脹度及腫脹抑制率。具體操作方法參考文獻(xiàn)[4]方法進(jìn)行。

足趾腫脹率(%)=(左足趾厚度-右足趾厚度)/右足趾厚度×100%

足趾腫脹抑制率(%)=(模型組平均腫脹率-藥物組平均腫脹率)/模型組平均腫脹率×100%

將足趾沿正中矢狀面切開(kāi)，一部分組織稱重，剪碎，加9倍量(m/V)生理鹽水，室溫浸泡2 h，5 000 r/min離心5 min，取上清液200 μL加入2 mL 0.5 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液，50℃水浴20 min，吸取200 μL加于96孔板，用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm處吸光度(OD)，用OD值代表炎癥部位PGE2的含量。另一部分足用40 mL/L甲醛溶液固定HE染色，觀察組織病理變化。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理分析 用徠卡顯微鏡及圖像處理系統(tǒng)對(duì)足趾切片進(jìn)行觀察及采集。應(yīng)用SPSS軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 金花葵對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響

與動(dòng)物模型組相比，地塞米松組和金花葵Ⅰ組在急性炎癥發(fā)生時(shí)能極顯著地抑制小鼠腹腔毛細(xì)血管透通性的增加(P<0.01)，金花葵Ⅱ組小鼠腹腔毛細(xì)血管透通性顯著降低(P<0.05)，金花葵Ⅲ組小鼠腹腔毛細(xì)血管透通性雖有所下降，但差異不顯著(P>0.05)，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 金花葵對(duì)小鼠耳片腫脹的抑制作用

金花葵Ⅰ組、Ⅱ組雖較地塞米松組效果稍差，但與動(dòng)物模型組相比，金花葵Ⅰ組、Ⅱ組均能顯著降低二甲苯所致的小鼠耳腫脹的發(fā)生(P<0.05)，金花葵Ⅲ組，耳片腫脹率無(wú)顯著性差異(P>0.05)。且隨金花葵溶液濃度的下降，其對(duì)耳片腫脹率抑制效果降低，呈劑量依賴性，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 金花葵對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響

注：與動(dòng)物模型組相比，“*”表示差異顯著(P<0.05)，“**”表示差異極顯著(P<0.01)。

Note:“* ” meansP<0.05，“**” meansP<0.01 vs model control group.

表2 金花葵對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹率的影響

注：與動(dòng)物模型組相比，“*”表示差異顯著(P<0.05)，“**”表示差異極顯著(P<0.01)。

Note:“* ” meansP<0.05，“**” meansP<0.01 vs model control group.

2.3 金花葵對(duì)小鼠足腫脹的抑制作用

2.3.1 小鼠足趾腫脹的測(cè)定與分析 結(jié)果顯示，與模型組比較，地塞米松組和金花葵Ⅰ組對(duì)小鼠足趾腫脹有極顯著的抑制作用(P<0.01)；金花葵Ⅱ組有顯著的抑制作用(P<0.05)；金花葵Ⅲ組對(duì)足趾腫脹無(wú)顯著性抑制作用，該結(jié)果與其對(duì)足趾炎癥部分PGE2滲出抑制結(jié)果相一致，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3.2 小鼠足趾腫脹病理學(xué)改變 和正常足趾相比，模型組小鼠足趾血管充血，皮下結(jié)締組織及肌間水腫，且有大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，表現(xiàn)為急性化膿性炎癥(圖1B)。與動(dòng)物模型組相比，地塞米松及金花葵Ⅰ組炎性細(xì)胞滲出明顯變少，水腫減輕。金花葵Ⅱ組、Ⅲ組主要表現(xiàn)為炎性細(xì)胞滲出減少，水腫差異不明顯，炎癥程度明顯有所緩解，結(jié)果見(jiàn)圖1。

表3 金花葵提物對(duì)角叉菜膠致小鼠足趾腫脹的影響

注：與動(dòng)物模型組相比，“*”表示差異顯著(P<0.05)，“**”表示差異極顯著(P<0.01)。

Note:“* ” meansP<0.05，“**” meansP<0.01 vs model control group.

A.右側(cè)正常足；B.動(dòng)物模型組；C.地塞米松組；D.金花葵高劑量組；E.金花葵中劑量組；F.金花葵低劑量組

A．Normal foot; B.Animal model group; C.Dexamethasone group; D.Hibiscusmanihothigh dose group; E.Hibiscusmanihotmiddle dose group; F.Hibiscusmanihotlow dose group

圖1各組小鼠足組織病理學(xué)切片HE染色結(jié)果(100×)

Fig.1 Histopathological section HE staining of paw in each group (100×)

3 討論

炎癥是具有血液循環(huán)的活體組織對(duì)損傷因子所產(chǎn)生的防御性反應(yīng)，是平時(shí)人們所說(shuō)的“發(fā)炎”。 炎癥發(fā)生的中心環(huán)節(jié)是炎癥部位的血管反應(yīng)，其主要表現(xiàn)為炎癥部位毛細(xì)血管充血擴(kuò)張，通透性增加，進(jìn)而炎癥部位水腫和炎性細(xì)胞游出。本試驗(yàn)所選動(dòng)物模型可以很好地模擬急性炎癥臨床發(fā)病過(guò)程與癥狀，且操作簡(jiǎn)便，被廣泛用于抗炎藥物的初篩和藥效評(píng)價(jià)。金花葵含其主要有效成分由黃酮類、氨基酸及多糖等多種有效成分，具有解熱抗炎[5-7]、鎮(zhèn)痛[8-9]、抗腫瘤[10]、抗氧化[11]和調(diào)節(jié)血脂[12]等多種生物活性?？梢运幱煤褪秤?，根、莖、葉、花及果均可利用，有“植物界大熊貓”之稱[11]。

本文利用3種動(dòng)物模型探討金花葵總提物對(duì)小鼠急性炎癥的影響。結(jié)果表明，金花葵可以有效緩解急性炎癥部位毛細(xì)血管的充血擴(kuò)張及滲透性的增加，減少PGE2在炎癥部位的釋放。進(jìn)而降低炎癥的部位的水腫程度和炎性細(xì)胞的滲出量。對(duì)炎癥的發(fā)生有明顯的抑制作用，金花葵高劑量組與地塞米松效果相近，且呈劑量依賴性的抑制急性炎癥的發(fā)生。

金花葵雖未被《中國(guó)藥典》收載，但其成分復(fù)雜，含有較高的黃酮類化合物、不飽和脂肪酸和多糖類化合物，鑒于其具有多種藥理活性和巨大潛在臨床應(yīng)用價(jià)值，因此有必要對(duì)其進(jìn)行詳細(xì)和全面的藥效評(píng)價(jià)。

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