邢玉娟，王建國，潘康鎖，喬登江，楊彥平，陳玉庫

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300；2.山東省威海市環(huán)翠區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，山東威海 264203；3.陜西省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，陜西西安 710016；4.內(nèi)蒙古烏蘭察布市興和縣動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古烏蘭察布市 013650；5.西安雨田農(nóng)業(yè)科技有限責(zé)任公司，陜西西安 710086)

蒲地藍(lán)消炎口服液是由蒲公英、黃芩、板藍(lán)根、苦地丁 4 味中藥組成，具有清熱解毒、抗炎消腫的功效，用于癤腫、腮腺炎、咽炎、淋巴結(jié)炎、扁桃體炎等疾病的治療[1-2]。近年來，我們在蒲地藍(lán)消炎口服液的基礎(chǔ)上，將口服液改為顆粒劑，應(yīng)用在雞傳染性支氣管炎的對(duì)癥治療，取得了良好的效果。為進(jìn)一步探討蒲地藍(lán)消炎顆粒治療感染性疾病的藥理作用機(jī)制,開展了以下研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)藥物 蒲地藍(lán)消炎顆粒，西安雨田農(nóng)業(yè)科技有限責(zé)任公司生產(chǎn)，100 g/袋，1.5 g生藥/g，批號(hào)20120205。用雙蒸餾水超聲溶解，配成濃度為200 mg/mL的供試品原液，常規(guī)消毒后備用；蒲地藍(lán)消炎片，云南白藥集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字Z20064017。

1.1.2 試驗(yàn)菌株 金黃色葡萄球菌ATCC 25923、大腸埃希菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 27853、白色念珠菌CMCC (B)10231，由陜西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.3 主要試劑和器材

1.1.3.1 主要試劑 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基；2,4-二硝基苯酚(化學(xué)純)、二甲苯(分析純)，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3.2 主要器材 比濁儀，法國生物梅里埃公司產(chǎn)品；超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1FD)，蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；手提式滅菌鍋，河北華泰設(shè)備醫(yī)療有限公司產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱、電熱恒溫干燥箱，上海一恒科技有限公司產(chǎn)品；電子天平(BX320S)，上海精密儀器儀表有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ICR小鼠，體重18 g～22 g，雌雄各半，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(陜)2007-001；SD大鼠50只，雄性，體重180 g～220 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(陜)2007-001。

1.2 方法

1.2.1 體外抑菌試驗(yàn)

1.2.1.1 菌懸液的制備 無菌條件下，分別用接種環(huán)取金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌第2代菌懸液，在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上劃線，35℃培養(yǎng)24 h；取白念珠菌的第2代菌懸液在改良馬丁培養(yǎng)基上劃線，25℃培養(yǎng)48 h。無菌條件下，用接種環(huán)調(diào)取單個(gè)菌落，置于裝有5 mL滅菌生理鹽水的試管中，震蕩搖勻，校正其濃度為0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)(MCF)約108CFU/ mL 的菌懸液[3]。

1.2.1.2 最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)測定 采用試管二倍稀釋法[4]。取滅菌具塞試管10支，編號(hào)排列于試管架上。每支試管加入2 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，于第1支試管中加入2 mL供試品原液，混合均勻，取2 mL加入第2支試管中，振搖混合均勻后，取2 mL加入第3個(gè)試管中，依此類推，直到稀釋到第8個(gè)試管，將第8支試管混合均勻后，從中取出2 mL棄去，得到蒲地藍(lán)消炎顆粒的濃度分別為100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5、0.781 25 mg生藥/mL。

取0.5 MCF的菌懸液，用無菌生理鹽水稀釋10倍，于每支試管分別加入0.1 mL稀釋后的菌懸液，作為試驗(yàn)組。第9支試管不加供試藥物，加入0.1 mL的供試菌懸液，為陽性對(duì)照。第10支試管加入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基2 mL，再加入供試品原液2 mL不加菌液，為陰性對(duì)照。將試驗(yàn)組、陽性對(duì)照組、陰性對(duì)照組各管置37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出，觀察。在陽性對(duì)照管細(xì)菌生長正常陰性對(duì)照管無菌生長的條件下，營養(yǎng)肉湯未發(fā)現(xiàn)渾濁的最低稀釋濃度即為該樣品的最低抑菌濃度(MIC)，分別吸取以上各試驗(yàn)管培養(yǎng)物0.1 mL移種在不含藥物的瓊脂培養(yǎng)基上,經(jīng)孵育過夜，分別菌落計(jì)數(shù)，其菌落數(shù)少于5個(gè)的藥物濃度即為最低殺菌濃度(MBC)。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 對(duì)腹腔注射金黃色葡萄球菌引起小鼠死亡的保護(hù)作用

1.2.2.1 菌液的制備 將濃度為0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)(MCF)約108CFU/ mL 的金黃色葡萄球菌菌懸液，用生理鹽水以10倍順序稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8等不同濃度的菌液，備用。

1.2.2.2 預(yù)試驗(yàn) 將不同濃度的菌液分別腹腔注射于體重為18 g～22 g的小鼠，每濃度組5只，每只0.5 mL，觀察小鼠在7 d內(nèi)的死亡情況，選用引起小鼠80%～100%死亡的菌液濃度進(jìn)行藥物防治試驗(yàn)。預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，引起90%的小鼠死亡的濃度為107個(gè)/mL，所以防治試驗(yàn)中細(xì)菌用量為0.5 mL/只(濃度107個(gè)/mL)[5]。

1.2.2.3 感染及給藥方法 取18 g～22 g小鼠60只，雌雄各半，按性別、體重隨機(jī)分為6組，蒲地藍(lán)消炎顆粒高、中、低劑量組含生藥分別為9.6、4.8、2.4 g/kg，藥物對(duì)照組(蒲地藍(lán)消炎片，4.8 g生藥/kg)，陽性對(duì)照組，陰性對(duì)照組。將藥物分別溶解于生理鹽水0.5 mL，灌胃。各給藥組連續(xù)灌胃給藥3 d，每天1次，每次0.5 mL，陰性對(duì)照組灌胃等容量的生理鹽水。于末次給藥30 min后，1組～5組小鼠腹腔注射107個(gè)/mL金黃色葡萄球菌造成感染，每只0.5 mL，陰性對(duì)照組腹腔注射0.5 mL生理鹽水。觀察小鼠的死亡情況，連續(xù)7 d，統(tǒng)計(jì)各組的死亡率，卡方檢驗(yàn)比較各組差異[6]。

1.2.3 對(duì)2,4-二硝基苯酚所致大鼠發(fā)熱的解熱作用

1.2.3.1 2,4-二硝基苯酚溶液的配制 精密稱取2,4-二硝基苯酚150 mg，置于80 mL生理鹽水中，滴加5 mol/L NaOH溶液，不斷攪拌，待藥液變?yōu)榱咙S色，再加入生理鹽水至100 mL。

1.2.3.2 造模及給藥方法 雄性大鼠，試驗(yàn)前以MC-612型電子數(shù)字式體溫計(jì)測定大鼠肛溫，每日早晚各測量體溫1次，連續(xù)3 d，選取肛溫波動(dòng)在0.5℃以內(nèi)者納入試驗(yàn)，隨機(jī)分為5組，每組10只，即蒲地藍(lán)消炎顆粒高劑量組(6.8 g/kg)、中劑量組(3.4 g/kg)、低劑量組(1.7 g/kg)，藥物對(duì)照組(蒲地藍(lán)消炎片3.4 g/kg)，陽性對(duì)照組。試驗(yàn)日各組大鼠灌胃給藥，1 mL/100 g，陽性對(duì)照組灌胃給予等量的生理鹽水，給藥后1 h于背部皮下注射2,4-二硝基苯酚1 mL/100 g(15 mg/kg)，每60 min測體溫1次，連續(xù)測定4 h[7-8]。

1.2.4 對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響 小鼠50只，雌雄各半，按體重、性別隨機(jī)分5組，每組10只，蒲地藍(lán)消炎顆粒高劑量組(9.6 g/kg)、中劑量組(4.8 g/kg)、低劑量組(2.4 g/kg)，藥物對(duì)照組(蒲地藍(lán)消炎片4.8 g/kg)，陽性對(duì)照組。各給藥組連續(xù)灌胃給藥3 d，每天1次，每次0.1 mL/10 g，陽性對(duì)照組灌胃等量的生理鹽水。于末次給藥30 min后，用二甲苯棉球接觸小鼠左耳約5 s，15 min后脫頸椎處死，手術(shù)剪剪下小鼠雙耳，用直徑 7 mm打孔器在左右耳相對(duì)稱部位打下耳片，稱重，記錄其重量，以左耳重減右耳重為小鼠的耳腫脹度[9-11]。

2 結(jié)果

2.1 體外抑菌試驗(yàn)

蒲地藍(lán)消炎顆粒對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、綠膿桿菌、白色念珠菌有不同程度的抑制作用，其中，藥物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用最強(qiáng)，MIC為6.25 mg/mL，MBC為12.5 mg/mL(表1)。

2.2 對(duì)腹腔注射金黃色葡萄球菌引起小鼠死亡的保護(hù)作用

蒲地藍(lán)消炎顆粒高、中、低劑量組和藥物對(duì)照組小鼠死亡率顯著低于陽性對(duì)照組(P<0.05)，其中蒲地藍(lán)消炎顆粒高劑量組死亡率與陽性對(duì)照組相比較，差異極顯著(P<0.01)(表2)。

表1 蒲地藍(lán)消炎顆粒的體外抑菌作用

2.3 對(duì)2,4-2硝基苯酚所致大鼠發(fā)熱的解熱作用

由表3可見，攻毒后1 h，各給藥組體溫升高值均低于陽性對(duì)照組，但差異不顯著(P>0.05)。攻毒后2 h～4 h，各給藥組體溫升高值均極顯著低于陽性對(duì)照組(P<0.01)。在攻毒后2 h～3 h的蒲地藍(lán)消炎顆粒高、中劑量組，體溫升高值低于藥物對(duì)照組，但差異不顯著(P>0.05)。攻毒后4 h，蒲地藍(lán)消炎顆粒和藥物對(duì)照組的體溫升高值相當(dāng)。結(jié)果表明，蒲地藍(lán)消炎顆粒和藥物對(duì)照組對(duì)2,4-二硝基苯酚引起的大鼠體溫升高具有良好的解熱作用，蒲地藍(lán)消炎顆粒的效果優(yōu)于藥物對(duì)照組。

2.4 對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響

蒲地藍(lán)消炎顆粒高、中、低劑量組和藥物對(duì)照組均能顯著抑制二甲苯所致的小鼠耳腫脹，與空白對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，其中，蒲地藍(lán)消炎顆粒高劑量組效果最好，與陽性對(duì)照組比較差異極顯著(P<0.01)(表4)。

3 討論

體外抗菌試驗(yàn)顯示，蒲地藍(lán)消炎顆粒對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌有不同程度的抑制作用，其中，藥物對(duì)G+菌(金黃色葡萄球菌)的抑菌作用最強(qiáng)，MIC為6.25 mg/mL，對(duì)銅綠假單胞菌抑菌作用較弱，MIC為100 mg/mL。這與龐載元等研究結(jié)果一致[4]。

外科感染性疾病其發(fā)病多責(zé)之為“熱毒”、“火毒”,《醫(yī)宗金鑒》指出,“癰疽原是火毒生”。急性感染期多以清熱解毒、消腫散結(jié)為治療原則。本研究結(jié)果表明，蒲地藍(lán)消炎顆粒高、中、低劑量組和藥物對(duì)照組小鼠死亡率顯著低于陽性對(duì)照組(P<0.05)，其中蒲地藍(lán)消炎顆粒高劑量組死亡率與陽性對(duì)照組相比較，差異極顯著(P<0.01)，對(duì)金黃色葡萄球菌感染小鼠有一定的保護(hù)作用。

表2 蒲地藍(lán)消炎顆粒對(duì)小鼠體內(nèi)感染金黃色葡萄球菌的作用

注：與陽性對(duì)照組比較,*P<0.05，**P<0.01。

Notes:Compared with the positive control group,*P<0.05,**P<0.01.

表3 蒲地藍(lán)消炎顆粒對(duì)大鼠體溫的影響

注：與陽性對(duì)照組比較,*P<0.05，**P<0.01。

Notes:Compared with the positive control group,*P<0.05,**P<0.01.

表4 蒲地藍(lán)消炎顆粒對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響

注：與陽性對(duì)照組比較,*P<0.05，**P<0.01。

Notes:Compared with the positive control group,*P<0.05,**P<0.01.

2,4-二硝基苯酚是一種代謝刺激劑，注入大鼠體內(nèi)可引起產(chǎn)熱增加，造成機(jī)體發(fā)熱[7]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，攻毒后1 h，各給藥組體溫升高值均低于陽性對(duì)照組，表明中藥的解熱作用雖已顯現(xiàn)，但差異不顯著(P>0.05)；攻毒后2～4 h，蒲地藍(lán)消炎顆粒高、中、低劑量組對(duì)2,4-二硝基苯酚引起的大鼠體溫升高具有良好的解熱作用，與陽性對(duì)照組比較差異極顯著(P<0.01)，且蒲地藍(lán)消炎顆粒的效果優(yōu)于藥物對(duì)照組，提示顆粒劑有較強(qiáng)的解熱作用，其解熱作用的具體環(huán)節(jié)，有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

二甲苯作為一種化學(xué)致炎劑，因操作簡便常被選擇作為藥理試驗(yàn)抗炎作用的造模致炎劑[10]。試驗(yàn)結(jié)果顯示，與陽性對(duì)照組相比，蒲地藍(lán)消炎顆粒高、中、低劑量組均能顯著抑制二甲苯所致的小鼠耳腫脹(P<0.05)，蒲地藍(lán)消炎顆粒高劑量組效果最好，與陽性對(duì)照組比較差異極顯著(P<0.01)。

蒲地藍(lán)消炎顆粒是由蒲公英、黃芩、板藍(lán)根、苦地丁 4 味中藥組成，具有清熱解毒、抗炎消腫的功效。現(xiàn)代研究證明，蒲公英具有良好的廣譜抗菌、抗自由基、抗病毒、抗感染、抗腫瘤作用[12]。黃芩及其有效成分具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤和抗菌等多重藥理作用，尤其顯著的抗細(xì)菌抗真菌活性對(duì)于治療日漸增多的耐藥性細(xì)菌/真菌感染有重要意義[13]。板藍(lán)根的不同提取部位均具有抗炎、鎮(zhèn)痛活性[14]。苦地丁具有抗炎、鎮(zhèn)靜催眠等功效[15]，諸藥相合，共湊抗菌消炎、解熱鎮(zhèn)痛之功。

參考文獻(xiàn)：

[1] Jiang Lei，Meng Xiang-song，Li Jun，et al．Determination of pudilan xiaoyan oral liquid[J].Qilu Pharmaceutical Affairs，2012，31(2) :75．

[2] 史國舉.蒲地藍(lán)消炎口服液解熱抗炎作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生,2011，50(9)：9-10.

[3] 張賽奇，王 米，雷 娜，等．中藥對(duì)豬源大腸桿菌O8體外抑菌試驗(yàn)研究[J].家畜生態(tài)學(xué)報(bào)，2015，36(8)：62-65.

[4] 龐載元，賢 麗，華 毅.4 種中藥對(duì)30 株廣泛耐藥銅綠假單胞菌的抑菌作用[J].中國執(zhí)業(yè)藥師，2015，12(2)：25-28.

[5] 譚嬌梅，喬紅群，丁亞軍，等.注射用磷酸特地唑胺體內(nèi)抗菌作用研究[J].中國抗生素雜志，2017，42(5)：425-428.

[6] 熊 昀，廉 冰，汪 宏.國產(chǎn)頭孢拉宗鈉對(duì)臨床分離致病菌的體內(nèi)外抗菌作用研究[J].華西藥學(xué)雜志，2017，32(2)：176-179.

[7] 李曉紅，張英華，牟 陽.復(fù)方黃連顆粒劑對(duì)2，4-二硝基苯酚所致大鼠發(fā)熱的影響[J].中國中醫(yī)藥科技，2012，19(6):509.

[8] 柳長鳳，汪 娜，劉樹民，等.黃芩對(duì)2,4-二硝基苯酚誘導(dǎo)熱病證候模型的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2011，26(5)：981-985.

[9] 趙桂芝，王緒平，俞忠明.艾葉揮發(fā)油對(duì)耳腫脹急性炎癥模型小鼠的抗炎作用研究[J].浙江中醫(yī)雜志，2016，51(4)：288-289.

[10] 谷 捷，李 鑫，余黃合，等.二甲苯致小鼠耳腫脹急性炎癥模型的建立[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，36(5):32-35.

[11] 全智慧，趙自明，黃雪君，等.制川烏配方顆粒與標(biāo)準(zhǔn)煎劑對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹抑制作用的比較研究[J].藥物評(píng)價(jià)研究，2014，37(4)：309-317.

[12] 謝沈陽，楊曉源，丁章貴，等.蒲公英的化學(xué)成份及其藥理作用[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2012，24:141-151.

[13] 施高翔，邵 菁，汪天明，等.黃芩及其有效成分抗菌作用新進(jìn)展[J].中國中藥雜志，2014，39(19):3713-3718.

[14] 馬毅敏，李 娜，劉承偉，等.板藍(lán)根不同提取部位抗炎鎮(zhèn)痛活性比較研究[J].中草藥，2014，45(17)：2514-2518.

[15] 杜迎翔，翟小婷，朱粉霞，等.苦地丁藥材超高效液相色譜指紋圖譜研究[J].中藥材，2015，38(8)：1630-1633.