梁正敏，文雪梅，廖曉光,2，徐楊峰，顏國慶，鄧 鑫，何家康*

(1.廣西大學動物科學技術學院，廣西南寧 530005；2.廣西畜牧研究所，廣西南寧 530001)

鼠類動物哮喘模型一直是國內外研究哮喘的重要手段和工具，目前國外多選用Balb/c小鼠來建立哮喘模型，多數(shù)以誘發(fā)哮喘氣道炎癥為目的。另外，有研究報道經肺吸入的過氧化氫(H2O2)對小鼠產生氧化損傷作用[1-2]。本研究在前期建立的哮喘模型[3]上進行了改進，用過氧化氫和卵清蛋白(ovalbumin, OVA)建立氧化應激特征性哮喘模型目的是為了模擬外源氧化性物質對哮喘的影響。摸索出了一種新的、效果良好的小鼠氧化應激特征性哮喘模型建立方法，為研制抗畜禽慢性呼吸道新獸藥提供藥效學研究方法和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 Balb/c小鼠，雌性，30只，SPF級，20 g±2 g，購自廣東實驗動物中心。合格證號：SCXK(粵)2013-0002，試驗前適應性飼養(yǎng)1周。

1.1.2 藥品與試劑 液態(tài)鋁佐劑，Pierce公司產品；卵清蛋白(OVA)，Sigma公司產品；過氧化氫(H2O2)，成都科龍化工試劑公司產品；活性氧(ROS)和超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒、BCA檢測試劑盒，Beyotime公司產品；小鼠 IL-4、IL-5、IL-13 ELISA 試劑盒，Neobioscience公司產品；總RNA提取試劑、RNA反轉錄試劑、熒光定量PCR試劑，寶生物工程(大連)有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 氧化應激特征性哮喘模型的建立 將30只18 g～20 g雌性 Balb/c小鼠隨機分成3組，每組10只，分組如下：正常對照組(Cont)、OVA對照組(OVA)和氧化應激特征性哮喘模型組(OVA+H2O2)。在第 0、7、14天，除空白對照組外，其余各組小鼠腹腔注射含液態(tài)鋁佐劑的100 μg/mL OVA致敏液，每只小鼠0.2 mL，空白對照組的小鼠注射等量的PBS。在第22～27天，除正常對照組外，其余各組小鼠經乙醚麻醉后滴鼻2 mg/mL OVA激發(fā)液，每只小鼠50 μL，1 h后氧化應激特征性哮喘模型組小鼠滴鼻1 mL/L H2O2，每只小鼠50 μL，空白對照組小鼠滴鼻等量PBS。在最后1次滴鼻激發(fā)結束24 h后，收集血清、BALF及肺組織進行后續(xù)的試驗。具體的試驗方案見圖1。

1.2.2 氧化應激特征性哮喘模型的評價 試驗模型小鼠出現(xiàn)明顯的鼻部搔癢、抓鼻、呼吸加快、點頭呼吸、焦躁不安、嘴唇發(fā)紺等癥狀?？瞻捉M小鼠無明顯癥狀。另外，氧化應激特征性哮喘小鼠肺臟組織學觀察可見支氣管腔內有大量炎性細胞和黏液分泌物，明顯多于OVA單獨激發(fā)對照組；氧化應激特征性哮喘模型組小鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13濃度極顯著升高，且明顯高于OVA對照組；肺組織中過氧化氫酶(Cata-lase，CAT)mRNA相對表達水平極顯著低于空白對照組和OVA對照組，還原型輔酶Ⅱ氧化酶-2(NOX-2)mRNA相對表達水平極顯著低于空白對照組和OVA對照組。通過以上結果可以判定氧化應激哮喘模型建立成功。

圖1 小鼠氧化應激特征性哮喘模型建立方案Fig.1 Experimental protocol for development of characteristic asthmatic model of oxidative stress in mice

1.2.3 小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)的收集 小鼠在最后1次激發(fā)24 h后，乙醚過度麻醉處死小鼠，固定好小鼠，剪開小鼠頸部皮膚、分離并充分暴露氣管，在氣管上方做一“V”形切口，插入自制插管，用注射器注入 0.5 mL 預冷PBS，輕柔肺部組織，沖洗后吸出置1.5 mL的離心管中，重復3次，將肺泡灌洗液以3 000 r/min離心10 min，吸取上清液，置-80℃冰箱保存用于測定肺泡灌洗液上清液中細胞因子含量。

1.2.4 病理組織學觀察 小鼠末次激發(fā)24 h后，乙醚深度麻醉處死小鼠，解剖取出左肺葉，用PBS清洗，40 mL/L多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片展片、HE染色，光學顯微鏡下觀察肺組織基本病理變化。

1.2.5 測定肺組織中ROS和SOD水平 準確稱取左肺組織重量，用PBS清洗肺組織表面血跡，剪碎；按重量(g)∶體積(mL)=1∶20的比例加入預冷PBS，用超聲破碎儀充分破碎至無可見組織塊狀態(tài)；4℃、1 000 r/min離心30 min，收集上清液，分裝，取少量上清液用于總蛋白測定。其余上清液用于ROS和總SOD水平檢測，按試劑盒說明書操作。

1.2.6 ELISA法測定BALF中IL-4、IL-5、IL-13濃度 用小鼠的IL-4、IL-5、IL-13 ELISA檢測試劑盒進行檢測，按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.7 RT-PCR檢測肺組織CAT和NOX-2基因mRNA表達水平 小鼠末次激發(fā)24 h后，乙醚深度麻醉處死小鼠，解剖取出右肺葉，用預冷PBS洗去表面血跡，立即置于液氮中速凍，之后放于-80℃保存用于提取RNA。RNA提取、反轉錄和RT-PCR嚴格按照試劑盒說明書進行，所用引物如表1所示。

表1 熒光定量PCR所用引物

1.2.8 數(shù)據處理分析 用SPSS21.0軟件進行分析，結果用平均值±標準差表示，組間比較采用單因素ANOVA分析及t檢驗。以P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 過氧化氫對哮喘小鼠肺組織中ROS和SOD水平的影響

肺組織中炎癥細胞產生的活性氧(ROS)在哮喘氣道的發(fā)病機制和炎癥反應中起重要作用。為了評估過氧化氫對OVA誘導的哮喘小鼠肺組織產生ROS的影響，測定了肺組織中的ROS水平。結果如圖2所示，與空白對照組相比，氧化應激哮喘模型組肺組織中的ROS水平極顯著升高(P<0.01)，且極顯著高于OVA對照組(P<0.01)。基于以上試驗結果，檢測了肺組織中的抗氧化物酶如SOD水平。結果如圖2所示，與空白對照組相比，氧化應激哮喘模型組SOD水平極顯著低于空白組(P<0.01)，且顯著低于OVA對照組(P<0.05)。表明H2O2能明顯促進ROS的產生，明顯抑制SOD的活性，嚴重破壞氧化/抗氧化平衡。

2.2 過氧化氫對哮喘小鼠BALF中細胞因子濃度影響

為了觀察過氧化氫對OVA誘導的氧化應激哮喘小鼠BALF中Th2細胞因子如IL-4、IL-5、IL-13分泌的影響，本研究用ELISA法檢測了BALF中的細胞因子濃度。結果如圖3所示，氧化應激哮喘模型組BALF的IL-4、IL-5、IL-13水平極顯著高于空白組(P<0.01)，且IL-4和IL-5濃度顯著高于OVA對照組(P<0.05)，IL-13濃度顯著高于OVA對照組(P<0.01)。表明相對于OVA對照組，H2O2可明顯促進IL-4、IL-5、IL-13的分泌(P<0.05)。

“#”表示與空白對照組比較差異極顯著(P<0.01)；“*”表示與OVA對照組比較差異顯著(P<0.05)，“**”表示與OVA對照組比較差異極顯著(P<0.01)

“#” indicates extremely siginificant difference compared with normal control group (P<0.01); “*” indicates siginificant difference compared with OVA control group (P<0.05),“**” indicates extremely siginificant difference compared with OVA control group (P<0.01)

圖2過氧化氫對哮喘小鼠肺組織中ROS和SOD的影響

Fig.2 Effects of H2O2on levels of ROS and SOD in lung tissues of asthmatic mice

“#”表示與空白對照組比較差異極顯著(P<0.01)；“*”表示與OVA對照組比較差異顯著(P<0.05)，“**”表示與OVA對照組比較差異極顯著(P<0.01)

“#” indicates extremely siginificant difference compared with normal control group (P<0.01);“*” indicates siginificant difference compared with OVA control group (P<0.05),“**” indicates extremely siginificant difference compared with OVA control group (P<0.01)

圖3過氧化氫對哮喘小鼠BALF中細胞因子濃度的影響

Fig.3 Effects of H2O2on concentrations of cytokines in BALF of asthmatic mice

2.3 過氧化氫對哮喘小鼠肺組織中CAT和NOX-2基因mRNA表達的影響

為了進一步驗證過氧化氫對抗氧化物酶水平的影響，檢測氧化應激肺組織中CAT mRNA相對表達水平。結果如圖4所示，與空白對照組相比，氧化應激哮喘模型組CAT水平極顯著低于空白組(P<0.01)，且極顯著低于OVA對照組(P<0.01)。此外，本試驗檢測了氧化應激肺組織中促氧化因子NOX-2 mRNA相對表達水平。圖4結果顯示，氧化應激哮喘模型組NOX-2 mRNA水平極顯著高于空白對照組(P<0.01)，且極顯著高于OVA對照組(P<0.01)。

“#”表示與空白對照組比較差異極顯著(P<0.01)；“**”表示與OVA對照組比較差異極顯著(P<0.01)

“#” indicates extremely siginificant difference compared with normal control group (P<0.01);“**” indicates extremely siginificant difference compared with OVA control group (P<0.01)

圖4過氧化氫對哮喘小鼠肺組織中CAT和NOX-2 mRNA表達的影響

Fig.4 Effects of H2O2on the mRNA expressions of CAT and NOX-2 in lung tissues of asthmatic mice

2.4 過氧化氫對哮喘小鼠肺臟病理組織學變化的影響

如圖5所示，空白對照組小鼠肺泡壁結構完整，支氣管和血管周圍無炎性細胞浸潤，OVA刺激的小鼠可見支氣管和血管周圍有大量以嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞為主的的炎性細胞浸潤，且氣道管腔狹窄，伴有炎性產物生成，經OVA和H2O2雙重刺激的小鼠肺臟可見支氣管內外有大量炎癥細胞侵潤，炎性細胞和分泌物堵住了整個支氣管腔，炎性細胞數(shù)量明顯比OVA對照組多。

3 討論

目前，在哮喘發(fā)病機制中認為氣道炎癥和氧化應激與哮喘發(fā)病密切相關，也是近年來哮喘研究中的熱點。氧化應激與氣道炎癥、氣道高反應性、組織損傷和氣道重塑等密切相關[4]。氧化應激是形成哮喘的大多數(shù)分子途徑和機制的最終結果，會直接或間接地損傷肺組織，最終引起哮喘的不可逆損傷，形成氣道重塑[4]。有研究報道氧化應激上調Th2介導的炎癥反應，增加哮喘嚴重程度，增強了支氣管高反應性，促使氣道重塑形成[5]。目前，抗氧化治療哮喘成為治療哮喘的一個重要方向，因此，建立一種氧化應激特征性哮喘模型很有必要。本研究用過氧化氫與卵清蛋白聯(lián)合激發(fā)建立氧化應激特征性小鼠哮喘模型，目的是為了更加明確外源性氧化劑在支氣管哮喘中的作用，復制出一種更嚴重的哮喘模型，為臨床抗氧化治療支氣管哮喘奠定研究基礎。

A.空白對照組; B.OVA對照組; C.氧化應激哮喘模型組 A.Blank control group; B.OVA control group; C.Asthma with oxidative stress group圖5 過氧化氫對哮喘小鼠肺組織病理變化的影響(上圖為100×，下圖為400×)Fig.5 Effects of H2O2 on pulmonary histopathology in lung tissues of asthmatic mice(The above figure 100×，the following figure 400×)

ROS信號在哮喘發(fā)病的初始和維持階段起重要作用。有報道稱過敏性哮喘患者氣道的炎癥和結構細胞產生過量的ROS，這與氣道炎癥、氣道重塑和黏液高分泌密切相關[6]。在日常生活中很多因素都能誘發(fā)機體產生氧化應激，如吸煙、紫外線、有毒化學物質、飲酒或營養(yǎng)過剩等[7]，這些外界的氧化應激可能會刺激體內產生更多的ROS，加重哮喘癥狀。哮喘中的氧化/抗氧化失衡是炎癥過程的重要機制之一。過量的ROS生產超過肺組織正常的抗氧化能力，從而損害肺組織不同成分如上皮功能，內皮細胞和氣道平滑肌的生理功能?？寡趸瘎┑纳险{可能是必需的，以抵抗哮喘ROS的過量產生[8]。本研究結果顯示，H2O2能顯著促進OVA誘導的ROS的產生(P<0.01)。NADPH氧化酶是調節(jié)脂多糖誘導的肺炎、肺損傷、NF-κB活化及細胞因子產生的關鍵酶，例如，在肺炎情況下，NOX-2是控制ROS產生的主要亞型[9]。與ROS試驗結果一致，H2O2也能顯著促進OVA誘導的NOX-2的mRNA表達(P<0.01)。

有研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患者氣道上皮細胞SOD活性明顯降低，SOD的減少有助于氧化應激[10]。常見的抗氧化物酶有SOD、GPx、CAT，其中SOD可保護過量ROS產生對肺組織的損傷[11]，而CAT的作用是分解過氧化氫[12]。本試驗結果可見，H2O2能夠顯著抑制OVA誘導的SOD和CAT的活性(P<0.05)。ROS和NOX-2的過量產生和SOD和CAT活性的顯著抑制導致肺組織氧化/抗氧化平衡嚴重失調。另外，氧化應激也可以啟動和增強炎癥，突出了氧化劑在哮喘的發(fā)病機制中的重要性[13-15]。本研究結果顯示，OVA刺激后，哮喘小鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13濃度顯著升高(P<0.05)，明顯加重OVA誘導的肺組織病理變化。以上試驗結果表明用卵清蛋白和過氧化氫聯(lián)合刺激可成功建立氧化應激特征性小鼠哮喘模型。

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