李月秋，陸治名，王鑫超，毛 震，張競文，齊 暢，劉麗艷，邸科前*

(1.河北大學醫(yī)學綜合實驗中心，河北保定 071000；2.河北大學公共衛(wèi)生學院，河北保定 071000)

三聚氰胺常用于食品接觸材料中(層板、塑料)，也常用于動物飼料氮的補充劑，同時也是殺蟲劑環(huán)丙氨嗪的代謝物[1]，不法經(jīng)營者也會用于原料奶摻假以提高檢測蛋白含量。三聚氰酸是三聚氰胺工業(yè)生產(chǎn)中的水解產(chǎn)物[2]，其在食物鏈的各個環(huán)節(jié)均有存在，對人體的危害亦是全球共知的。

目前，國內(nèi)外有關應用各種方法對原料乳及乳制品[3-4]、雞蛋及肉[5]、水產(chǎn)品[6]等各種食品[7]、食品接觸產(chǎn)品[8]、飼料[9]中三聚氰胺、三聚氰酸含量測定的報道較多。已有大鼠血漿、肝組織[10]和尿液[11]中三聚氰胺及三聚氰酸同時檢測報道。有些研究表明了三聚氰胺、三聚氰酸攝入會最終進入泌尿系統(tǒng)，導致尿酸增多。目前，國內(nèi)外尚未見到雙波長高效液相色譜法同時對不同給藥劑量組大鼠腎臟、尿液中三聚氰胺、三聚氰酸及尿酸3種成分同時分離檢測的報道。本文研究建立雙波長高效液相色譜法，用于跟蹤檢測不同給藥劑量組大鼠腎臟、尿液中三者含量情況，為深入研究三聚氰胺對人體健康影響提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 三聚氰酸(98%)、三聚氰胺(99%)、尿酸(99%)均為分析純試劑，阿拉丁試劑(上海)有限公司產(chǎn)品；甲醇為色譜純，天津康科德公司產(chǎn)品；乙酸銨、磷酸氫二鉀、乙腈、硫酸鈉、檸檬酸鈉、高氯酸、三氯乙酸等試劑均為分析純。

1.1.2 實驗動物 80只成熟SD大鼠，購自河北省實驗動物中心，體重180 g～200 g。

1.1.3 主要儀器 LC-10ATvp高效液相色譜儀、SPD-M10Avp 二極管陣列檢測器、CLASS-VP工作站，日本島津公司產(chǎn)品；PT 2100臺式勻漿機，瑞士Kinematica 公司產(chǎn)品；DELTA-320型酸度計，梅特勒-托利多儀器有限公司產(chǎn)品；離心機(TGL-16G)，上海安亭科學儀器廠生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 80只成熟SD大鼠，隨機分為4組，每組20只，雌雄各半。第1組為正常對照組，第2組至第4組為給藥組。第1組按1 mL /(100 g·d)灌胃鮮牛奶；第2組為0.5 g/kg三聚氰胺組，第3組為1.5 g/kg三聚氰胺組，第4組為2.5 g/kg三聚氰胺+2.5 g/kg三聚氰酸組。第2組至第4組按1 mL/(100 g·d)給予三聚氰胺或三聚氰胺及三聚氰酸鮮牛奶。第1組至第4組均連續(xù)灌胃3 d，每組大鼠均自由飲水。

1.2.2 標準儲備液配制 精密稱定三聚氰胺、三聚氰酸、尿酸對照品適量，分別配成1 mg/mL、1 mg/mL、80 μg/mL標準儲備液，置于4℃冰箱中作為標準儲備液冷藏保存。使用時用超純水稀釋標準儲備液配制混合標準工作液。

1.2.3 樣品處理 分別取大鼠腎組織，稱重，置5 mL離心管，按1∶40(m/V)的比例加入0.6 mol/L高氯酸蛋白沉淀劑，勻漿、離心(12 000 r/min，15 min)，取上層清液，加入等體積高氯酸沉淀劑，在冰浴中放置10 min，12 000 r/min離心15 min，取上層清液，用0.45 μm濾膜過濾后進行分析。

取大鼠尿液，稱重，置5 mL離心管，按尿液及0.6 mol/L高氯酸體積比為1∶40的比例加入高氯酸蛋白沉淀劑，渦旋混合、冷凍離心(12 000 r/min，15 min)，取上層清液，加入等體積高氯酸沉淀劑，在冰浴中放置10 min，離心(12 000 r/min，15 min)，取上層清液，用0.45 μm濾膜過濾后進行分析。

1.2.4 色譜條件 色譜柱為Agela Promosil C18(250 mm×4.6 mm i.d.,5 μm)；流動相為：0.5 mmol/L磷酸鹽(pH 7.4)-甲醇(95:5)，流速1 mL/min，柱溫25℃，進樣量10 μL，三聚氰胺和三聚氰酸檢測波長為213 nm，尿酸檢測波長為285 nm。

1.2.5 標準曲線繪制 量取1.2.1標準儲備液，用超純水稀釋配制成一系列濃度不同的標準混合溶液(三聚氰胺、三聚氰酸、尿酸的濃度范圍分別為0.10～100、0.50～100、0.20～100 μg/mL，按照1.2.4色譜條件依次進樣測定。以質量濃度x(μg/mL)對峰面積y作圖，繪制標準曲線。

1.2.6 方法學驗證

1.2.6.1 檢出限 按3倍信噪比(S/N=3)計算檢出限(LOD)。

1.2.6.2 回收率和精密度 取空白腎臟樣品50.0 mg 9份，空白尿液50 μL 9份，分別加入高、中、低3種濃度的混合標樣各3份，按照1.2.3條件對樣品進行前處理，然后按照1.2.4色譜條件測定三聚氰胺、三聚氰酸、尿酸的加標回收率及精密度(RSD)。

1.2.6.3 穩(wěn)定性試驗 在腎臟組織勻漿液和尿液中分別加入含有一定量的三聚氰胺、三聚氰酸、尿酸混合標樣，按照1.2.3對樣品進行處理，分別在0、6、12、24、48、72 h時取樣進行測定。

1.2.6.4 專屬性試驗 取正常組腎臟、尿液樣品各2份，其中1份分別添加混合標準品，按照1.2.3項下的樣品處理條件處理腎臟和尿液，將處理好的腎臟、尿液樣品及混合標準品按照1.2.5試驗條件進樣測定。

2 結果

2.1 流動相

2.1.1 緩沖體系 以甲醇為有機相，以磷酸鹽為緩沖體系，三者均能出峰，而且分離度能夠達到要求。

2.1.2 磷酸鹽緩沖液pH 以1 mmol/L磷酸鹽-甲醇(95∶5，V/V)作為流動相，三聚氰酸、尿酸隨pH增加靈敏度稍有增加；pH為7.4時，三者分離效果最好。如圖1所示，磷酸鹽緩沖液pH選為7.4。

圖1 pH對保留時間及峰面積影響Fig.1 Effects of pH on retention time and peak area

2.1.3 磷酸鹽緩沖液濃度 以磷酸鹽(pH 7.4)-甲醇(95∶5)作為流動相，磷酸鹽濃度為0.5 mmol//L時，三者分離效果最好(圖2)。

2.1.4 流速 以0.5mmol/L磷酸鹽(pH 7.4)-甲醇(95∶5)作為流動相，三者隨流速增加，遷移時間均減小，流速大于1 mL/min時，三者分離情況變差；

流速小于1 mL/min時，分離情況受流速影響不大，因此選擇1 mL/min。

圖2 磷酸鹽濃度對保留時間影響Fig.2 Effect of phosphate concentration on retention time

2.2 檢測波長

在ClASS-VP工作站中，對三者色譜峰進行分析，表明三聚氰胺、三聚氰酸、尿酸的靈敏檢測波長分別為213、213、285 nm?？紤]到提高3種物質的檢測靈敏度及二極管陣列檢測器的優(yōu)點，由于三聚氰胺、三聚氰酸在285 nm幾乎沒有吸收，尿酸在285 nm靈敏度明顯高于213 nm處，因此選擇213 nm作為三聚氰胺、三聚氰酸檢測波長，285 nm作為尿酸檢測波長(圖3)。

2.3 標準曲線和檢出限

三聚氰胺、三聚氰酸、尿酸的線性方程、線性范圍及檢出限(LOD)見表1。

表1 三聚氰胺及其代謝物線性方程、線性范圍及檢出限

2.4 回收率和精密度

三聚氰胺、三聚氰酸、尿酸的加標回收率及精密度(RSD)見表2。

2.5 穩(wěn)定性試驗

3種物質含量的RSD范圍為0.86%～1.03%，說明樣品溶液在3 d內(nèi)檢測穩(wěn)定性良好。

2.6 專屬性試驗

腎臟、尿液中的內(nèi)源物質不干擾測定，見圖3。

2.7 樣品測定

腎臟和尿液中三聚氰胺及其代謝物的測定結果見表3。結果表明，同時攝食三聚氰胺與三聚氰酸，產(chǎn)生腎臟結石的可能性顯著高于單純攝食三聚氰胺(P<0.001)，此結果與已報道的結果有相同之處。三聚氰胺高劑量組產(chǎn)生腎臟結石的可能性顯著高于低劑量組(P<0.001)。表明體內(nèi)蓄積三聚氰胺、三聚氰酸的量與灌胃給藥中所含三聚氰胺的量呈正相關。另外，攝食三聚氰胺、三聚氰酸造成腎臟結石的同時，也會造成尿液中尿酸含量增多(P<0.001)。

A.混合標準品；B.正常組尿液;C.正常組尿液加標;D.正常組腎臟;E.正常組腎臟加標

1.三聚氰酸 2.尿酸 3.三聚氰胺

A.Mixed standard;B.Urine of normal group;C.Added standard to urine of normal group; D.Kidney of normal group; E.Added standard to kidney of normal group

1.Melamine 2.Uric acid 3.Cyanuric acid

圖3 213 nm和285 nm波長下尿液和腎臟色譜圖

Fig.3 Chromatography of urine and kidney at 213 nm and 285 nm

3 討論

3.1 流動相選擇

鹽離子容易堵塞色譜柱及整個流路系統(tǒng)，試驗結束沖洗體系時，需要時間較長，因此不宜選擇較高濃度。已報道的三聚氰胺、三聚氰酸同時分離檢測的高效液相色譜法的流動相中多含有乙酸銨[3，10]。李玉玉等[12]以純磷酸鹽作為流動相，三者能夠同時分析檢測。

本研究以磷酸鹽(pH 7.4)-甲醇(95∶5)作為流動相，考察磷酸鹽濃度(0.5、1、5、10、20 mmol/L)對分離效果影響。如圖2所示，三者遷移時間在濃度小于10 mmol/L時，均隨濃度增加而增大。濃度大于10 mmol/L時，三者遷移時間均減小。濃度為5 mmol/L時，三聚氰酸和尿酸完全重合，不能分開。磷酸鹽濃度為0.5 mmol//L時，三者分離效果最好。綜合考慮，選擇磷酸鹽濃度為0.5 mmol/L。此流動相與李玉玉等人建立的方法相比[12]，可以避免純緩沖液流動相體系對流路系統(tǒng)的損害。

表2 平均回收率及相對標準偏差(n=6)

3.2 樣品處理

3.2.1 勻漿器 組織樣品在分析檢測前需要勻漿處理。因此，試驗中分別用手動玻璃勻漿器、勻漿機處理腎臟樣品。用手動勻漿處理腎臟樣品費時費力、勻漿不易徹底，且會有一部分生物樣品粘在勻漿器內(nèi)壁造成樣品直接損失，回收率降低；用均漿機研磨腎臟，能分散生物組織，破碎細胞，同時省時省力，可較好地提高樣品回收率。

3.2.2 蛋白質沉淀劑選擇 腎臟及尿液中含有蛋白質等成分，組成復雜，因此樣品中蛋白質沉淀方法選擇非常重要。徐玲[13]選用乙腈作為尿液沉淀劑，乙腈和尿液體積比為1∶1時，沉淀基本完全。何君等[10]對大鼠血漿及組織勻漿液采用乙腈對蛋白質進行沉淀。

表3 腎臟和尿液中三聚氰胺及其代謝物含量測定結果

注：①與0.5 g/kg三聚氰胺組比較，△P<0.05，△△P<0.01，△△△P<0.001；②與1.5 g/kg三聚氰胺組和0.5 g/kg三聚氰胺組比較，*P<0.05，**,P<0.01，***P<0.001。

Note：①Compared with 0.5 g/kg melamine group, △P<0.05, △△P<0.01, △△△P<0.001;②Compared with 1.5 g/kg and 0.5 g/kg melamine group, *P<0.05，**P<0.01，***P<0.001.

本試驗考察了乙腈、100 g/L三氯乙酸、0.6 mmol/L高氯酸[14]對蛋白質的沉淀效果。結果表明，前兩種作為蛋白質沉淀劑時，在4 min～ 6 min雜質峰較多，干擾測定；而選用高氯酸處理樣品時，雜質峰較少，除蛋白質效果較好，這與趙燕燕等[14]應用高效液相色譜法測定大鼠不同腦區(qū)中的8種單胺類神經(jīng)遞質所選用的除蛋白質方法相同。

本試驗同時考察了高氯酸濃度(0.1 mol/L～0.8 mol/L)、樣品和高氯酸比例(0.05∶1、0.05∶2、0.05∶3，m/V)對沉淀蛋白效果影響。試驗結果表明，高氯酸濃度低于0.6 mol/L時，蛋白質除不干凈，雜質峰較多，高氯酸濃度過高會引起三聚氰胺分解。當0.6 mol/L高氯酸與待分析樣品以0.05∶2質量體積比混合時，雜質峰干擾小，基本能達到基線分離。因此，選擇0.6 mol/L高氯酸，以0.05∶2質量體積比處理腎臟樣品。

3.3 檢測結果分析

梁毅文等[2]對大鼠進行三聚氰胺、三聚氰酸聯(lián)合灌胃，發(fā)現(xiàn)大鼠腎臟內(nèi)會形成一種不溶于水的晶體, 堵塞腎小管造成腎臟損害甚至急性腎功能衰竭, 并可能與尿酸等成分一起誘發(fā)泌尿系結石。Dorne J L等[1]的研究結果也表明三聚氰胺、三聚氰酸同時存在于體內(nèi)的毒性大于單獨存在。應用本試驗建立的方法對大鼠腎臟、尿液進行檢測，結果表明攝食三聚氰胺、三聚氰酸造成腎臟結石的同時，也會造成尿液中尿酸含量增多，與梁毅文等研究結果有相同之處。

綜上所述， 本研究建立的雙波長高效液相色譜法同時檢測大鼠體內(nèi)三聚氰胺及其代謝物含量，具有操作簡便、靈敏度高、結果準確可靠等優(yōu)點，是測定動物體內(nèi)三聚氰胺及其代謝物含量的有效方法，可監(jiān)測攝食三聚氰胺后對腎臟、尿液產(chǎn)生的影響，進一步監(jiān)測對人體健康產(chǎn)生的影響。

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