蔣增海，趙攀登，鄧同煒，陳 益，徐耀輝

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南鄭州 450046；2.河南省豬病防控工程技術(shù)研究中心，河南鄭州 450046)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起豬的一種繁殖障礙和呼吸系統(tǒng)的傳染病，其特征為母豬厭食、發(fā)熱、妊娠后期發(fā)生流產(chǎn)，產(chǎn)死胎和木乃伊胎；仔豬發(fā)生呼吸系統(tǒng)疾病和大批死亡[1]。其中高致病性豬繁殖與呼吸綜合征(HP-PRRS)是由PRRSV變異株引起的一種急性高致死性疫病，感染豬發(fā)熱、皮膚發(fā)紅、呼吸困難和急性死亡[2]。童光志等[3]證明了PRRSV變異株是2006年南方豬“高熱綜合癥”流行的主要病因，以NSP2發(fā)生30氨基酸的不連續(xù)缺失為特征。自從高致病性PRRSV毒株出現(xiàn)，全國(guó)各地均有高致病性豬繁殖與呼吸綜合征發(fā)生的報(bào)道[4-7]，2016年11月份河南某中小規(guī)?；i場(chǎng)，飼養(yǎng)基礎(chǔ)母豬300余頭，連續(xù)16窩妊娠后期母豬發(fā)生產(chǎn)死胎現(xiàn)象，懷疑為豬繁殖與呼吸綜合征感染所致流產(chǎn)，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)，最終確診為豬繁殖與呼吸綜合征所致。為了分析豬繁殖與呼吸綜合征免疫失敗原因，進(jìn)行ORF5基因序列及其推導(dǎo)氨基酸序列的遺傳變異分析與比較，以及GP5抗原性分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 選擇2頭死產(chǎn)胎兒(分別來(lái)自2窩流產(chǎn)母豬所產(chǎn)死胎)，編號(hào)HeNan-XinY1和HeNan-XinY2，分別采集肺臟，反復(fù)凍融3次，用于提取病毒RNA。

1.1.2 主要試劑 RNA提取試劑Trizol，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；5X All-In-one RT Master Mix，Abm公司產(chǎn)品(Applied Biological Materials Inc，Canada)；2×TaqPlus Master Mix(Dye Plus),南京諾唯贊生物科技有限公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2 000等,寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 引物 按照參考文獻(xiàn)[8]合成引物，其中一對(duì)引物能夠擴(kuò)增ORF5全部基因和部分ORF4、ORF6序列(PRRSV-ORF5F:5-TGGCAATTTGAATGTTCAAGTATG-3，PRRSV-ORF5R:5-CTGTGCTATCATTGCAGAAGTCGT-3)；另外一對(duì)引物擴(kuò)增NSP2部分序列(PRRSV-Nsp2-del-F：5-TGGGCGACAATGTCCCTAAC-3); PRRSV-Nsp2-del-R：5-GCTGAGTATTTTGGGCGTGTG-3，擴(kuò)增產(chǎn)物508 bp(經(jīng)典毒株)或418 bp(高致病性毒株)。

1.2 方法

1.2.1 病毒RNA提取和反轉(zhuǎn)錄 按照RNA提取試劑Trizol說(shuō)明書(shū)提取病毒RNA。反轉(zhuǎn)錄按照說(shuō)明書(shū)操作，5×All-In-one RT Master Mix 2 μL，病毒RNA模板3 μL，Nuclease-free H2O 5 μL，總體積為10 μL；混合后，離心數(shù)秒；反應(yīng)條件為25℃ 10 min，50℃ 42 min，85℃ 5 min,然后放冰上冷卻，進(jìn)行下一步試驗(yàn)，或置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR反應(yīng)與產(chǎn)物測(cè)序 PCR反應(yīng)體系為2×TaqPlus Master Mix(Dye Plus)12.5 μL，上游引物(10 μmol/L)0.5 μL，下游引物(10 μmol/L)0.5 μL，cDNA模板2 μL，滅菌去離子水9.5 μL。PCR反應(yīng)條件參照參考文獻(xiàn)[8]進(jìn)行：95℃ 5 min；94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。取PCR產(chǎn)物5 μL，經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用Bio-Rad成像系統(tǒng)觀察擴(kuò)增片段是否與預(yù)期大小一致。將ORF5 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.2.3 遺傳進(jìn)化分析 利用MEGA5.05和DNA Star軟件對(duì)獲得的ORF5基因序列進(jìn)行分析。從GenBank下載PRRSV部分毒株ORF5基因序列(表1)做進(jìn)化分析。

表1 參考毒株信息

1.2.4 GP5蛋白抗原分析 用DNA Star Protean軟件對(duì)病料檢測(cè)株GP5蛋白的抗原指數(shù)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

從2頭胎兒肺臟組織提取核酸，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，均擴(kuò)增到PRRSV NSP2大小約418 bp片段，同時(shí)也擴(kuò)增到大小約為700bp包含ORF5基因全長(zhǎng)的片段，與預(yù)期一致。根據(jù)文獻(xiàn)[8]，判定為高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染(圖1)。

1.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;2、3.HeNan-XinY1、HeNan-XinY2的NSP2基因部分片段；5、6.HeNan-XinY1、HeNan-XinY2的ORF5基因；4、7.陰性對(duì)照

1.DNA Marker DL 2 000;2,3.PCR-based amplification targeting part of NSP2 genes from HeNan-XinY1 and HeNan-XinY2 PRRSV strains ；5,6.PCR-based amplification targeting ORF5 genes from HeNan-XinY1 and HeNan-XinY2 PRRSV strains；4,7.Negative control

圖1 Nsp2基因部分片段和ORF5基因擴(kuò)增結(jié)果

Fig.1 Results of PCR-based amplification targeting part of NSP2 genes and ORF5 gene from HeNan-XinY1 and HeNan-XinY2 PRRSV strains

2.2 OFR5基因測(cè)序

將擴(kuò)增的包括ORF5全長(zhǎng)的基因片段，純化后進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)過(guò)BLAST分析比對(duì)，2份病料中檢測(cè)到ORF5基因序列完全一致，其大小603 bp，與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中PRRSV毒株FJYR ORF5基因同源性最高，為97.0%。

2.3 ORF5序列分析

病料檢測(cè)毒株的ORF5序列與2015年福建分離毒株FJYR、河南分離毒株TJbd14-2的同源性最高，分別為97.2%和97.0%；與美洲型經(jīng)典毒株VR-2332、BJ-4、CH-1a的同源性分別為87.7%、86.9%、93.2%,與高致病毒株HuN4、JXA1、WUH1的同源性為96.7%、96.7%、95.7%，與歐洲型毒株Lelystad Virus、NMEU09-1的同源性為62.8%和62.6%(圖2和圖3)。因此，本研究檢測(cè)的引起胎兒流產(chǎn)的PRRSV毒株屬于美洲型，與近年中國(guó)福建和中國(guó)河南分離的毒株同源性最高。

HeNan-XinY1、HeNan-XinY2為病料檢測(cè)毒株,其他毒株信息見(jiàn)表1 HeNan-XinY1 and HeNan-XinY2 PRRSV strains tested in this study，other PRRSV strains included in the table 1圖2 PRRSV不同毒株ORF5基因遺傳進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree based ORF5 gene sequences of different PRRSV strains

圖3 PRRSV不同毒株同源性比較結(jié)果Fig.3 Percent identity between different PRRSV strains

2.4 ORF5序列推導(dǎo)氨基酸序列分析

根據(jù)DNA Star MegAlign比較，病料檢測(cè)毒株推導(dǎo)的GP5蛋白氨基酸序列與高致病PRRSV毒株Em2007、HB-1(sh)/2002、JXA1、WUH1、Henan-1、HeNan-A9、HUN4、TJbd14-2、FJYR的同源性為88.6%～95.5%，共13個(gè)位點(diǎn)的氨基酸發(fā)生了變異：L-S2、F-S23、S-T32、N-H35、D-E54、Q-E58、F-L87、A-V94、Y-C102、V-G124、R-K151、R-K191、Q-R196(圖4)；與VR-2332毒株的同源性為84.1%；與Lelystad virus毒株的同源性為58.5%。根據(jù)參考文獻(xiàn)[9]，與毒力相關(guān)的13位和151位氨基酸，病料檢測(cè)毒株為R13、R151，與強(qiáng)毒株相同；區(qū)分野毒株與疫苗株的137位氨基酸，病料檢測(cè)毒株為S137，說(shuō)明導(dǎo)致該豬場(chǎng)母豬流產(chǎn)的毒株是野毒株。

2.5 GP5蛋白抗原分析

應(yīng)用DNA Star Protean軟件對(duì)病料檢測(cè)株GP5蛋白的抗原指數(shù)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)病料檢測(cè)毒株HeNan-XinY1抗原表位主要分布與其他9種PRRSV強(qiáng)毒株的類(lèi)似，但存在一定差距，第1-5 aa出現(xiàn)抗原指數(shù)高于零，與其他毒株不同，第30-40、51-63 aa抗原指數(shù)明顯低于其他高致病性毒株(圖5)。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)病料檢測(cè)毒株HeNan-XinY1 GP5在1-5 aa有較好的親水性及表面可及性(圖6和圖7)，結(jié)合該處有較高的抗原指數(shù)，根據(jù)文獻(xiàn)[10]預(yù)測(cè)，在該處可能出現(xiàn)B細(xì)胞抗原表位，而其他毒株在該處無(wú)抗原表位。

圖4 HeNan-XinY1毒株與其他高致病性PRRS毒株ORF5推導(dǎo)氨基酸變異分析Fig.4 Analysis of ORF5 genes-deduced amino acid mutations between HeNan-xinY1 PRRSV strain in this study and other HP-PRRSV strains

圖5 HeNan-XinY1毒株與其他高致病性PRRS毒株GP5抗原指數(shù)比較Fig.5 Comparison of GP5 antigen indexes between HeNan-XinY1 PRRSV strain in this study and other HP-PRRSV strains

圖6 HeNan-XinY1毒株GP5親水性分布圖Fig.6 Hydrophilicity plot about GP5 of PRRSV HeNan-XinY1 strain

圖7 HeNan-XinY1毒株GP5表面可及性分布圖Fig.7 Surface probability plot about GP5 of PRRSV HeNan-XinY1 strain

3 討論

目前，我國(guó)已批準(zhǔn)上市的疫苗種類(lèi)繁多，亂用疫苗嚴(yán)重，多種疫苗間或疫苗株與野毒株間容易發(fā)生重組與變異[2]，當(dāng)前豬繁殖與呼吸綜合征疫苗在保護(hù)流行毒株感染方面，完全沒(méi)效或者部分有效[11-12]，估計(jì)是導(dǎo)致免疫失敗的根本原因。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病料檢測(cè)毒株與我國(guó)流行的其他9種高致病性PRRSV毒株ORF5推導(dǎo)的氨基酸同源性為88.6%～95.5%，共有13個(gè)位點(diǎn)的氨基酸發(fā)生了變異，即使進(jìn)行了豬繁殖與呼吸綜合征高致病性弱毒疫苗的免疫，也無(wú)法保護(hù)懷孕母豬的健康而導(dǎo)致流產(chǎn)，證明了上述觀點(diǎn)正確性。

本研究從使用過(guò)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征弱毒疫苗的豬場(chǎng)流產(chǎn)胎兒體內(nèi)，檢測(cè)出了PRRSV，根據(jù)其ORF5基因序列和推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行了分析和比對(duì)，發(fā)現(xiàn)病毒發(fā)生了較大變異，不屬于疫苗毒株，是一種高致病性美洲型的野毒株，與2015福建分離毒株FJYR、河南分離毒株TJbd14-2同源性最高，分別為97.2%和97.0%。據(jù)此推斷，該P(yáng)RRSV毒株可能是由中國(guó)分離的上述2株高致病性毒株演變而來(lái)。

GP5蛋白抗原指數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，與其他9種同源性相近的高致病毒株相比，病料毒株GP5第1-5 aa抗原指數(shù)高于零， 并且有較好的親水性和表面可及性，推測(cè)該處出現(xiàn)B細(xì)胞抗原表位，與其他毒株不同；第30-40、51-63 aa抗原性明顯低于其他高致病性毒株。據(jù)此，筆者推測(cè)，這是導(dǎo)致本豬場(chǎng)免疫高致病性豬繁殖與呼吸綜合征失敗的根本原因。

普遍認(rèn)為，豬繁殖與呼吸綜合征弱毒疫苗可以保護(hù)豬群，免于PRRSV毒株感染而引起的臨床癥狀，但是目前還沒(méi)有豬繁殖與呼吸綜合征弱毒疫苗能夠完全阻止同源性毒株引起呼吸道感染、胎盤(pán)傳播及豬與豬之間傳播;使用豬繁殖與呼吸綜合征弱毒疫苗造成毒力返強(qiáng)的例子已經(jīng)有多次報(bào)道；同時(shí)，對(duì)于野毒株感染，豬繁殖與呼吸綜合征弱毒疫苗也不能提供完全交叉保護(hù)[12]。本研究結(jié)果同樣表明，高致病性豬繁殖與呼吸綜合征弱毒疫苗免疫接種，也無(wú)法抵御高致病性豬繁殖與呼吸綜合征變異毒株的感染而致病。

因此，豬場(chǎng)應(yīng)慎重選用高致病性豬繁殖與呼吸綜合征弱毒疫苗免疫接種，田克恭[2]認(rèn)為對(duì)于疫情相對(duì)穩(wěn)定的豬場(chǎng)，一般不推薦使用高致病性豬繁殖與呼吸綜合征弱毒疫苗。周磊等[13]認(rèn)為采用生物安全控制措施、閉群技術(shù)、后備母豬馴化、PRRSV 檢測(cè)與淘汰等措施綜合措施，是防控PRRS的明智之舉。

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