阮文強(qiáng)，寶志鵬，覃思楠，陳新諾，何 歡，岳 華,2，張 斌,2*

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 四川成都 610041；2.國(guó)家民族事務(wù)委員會(huì)青藏高原動(dòng)物疫病防控創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，四川成都 610041；3.云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650212 )

豬細(xì)環(huán)病毒(Torque teno susvirus，TTSuV)是一種小的無囊膜包裹、環(huán)狀、單股負(fù)鏈DNA病毒，基因組大小為2.7 kb～2.9 kb，該病毒是利用代表性差異分析方法(representational difference analysis,RDA)發(fā)現(xiàn)的一種與其他已發(fā)現(xiàn)的病毒基因型不同的DNA病毒[1]。目前，TTSuV主要分為TTSuV1和TTSuV2兩種基因型，其中TTSuV1有4種亞型，即TTSuV1a、TTSuV1b、TTSuV1c和TTSuV1d，TTSuV2也包含4種亞型，即TTSuV2a、TTSuV2b、TTSuV2c和TTSuV2d。TTSuV的基因組結(jié)構(gòu)主要由非編碼區(qū)(untranslated region，UTR)和編碼區(qū)兩部分組成，非編碼區(qū)的高GC含量區(qū)域形成具莖環(huán)狀的二級(jí)結(jié)構(gòu)，在病毒復(fù)制中可能存在重要調(diào)控作用[2-3]；TTSuV的編碼區(qū)中包含3個(gè)開放閱讀框(ORF1～ORF3)、1個(gè)TATA盒和1個(gè)PolyA，變異率較高[4-5]。TTSuV廣泛存在于人類、家畜、野生動(dòng)物及一些伴侶動(dòng)物體內(nèi)，國(guó)內(nèi)外都有關(guān)于TTSuV感染的報(bào)道，而且其感染宿主具有多樣性，其生物學(xué)特性和致病性仍然不清楚，所以該病毒仍然是一個(gè)值得關(guān)注的新病原。有學(xué)者調(diào)查了四川省和江西省TTSuV的流行情況，結(jié)果顯示TTSuV的總感染率分別為18.03%和52.4%～92.3%[6-7]。有學(xué)者對(duì)泰國(guó)、韓國(guó)、西班牙等國(guó)進(jìn)行了TTSuV的檢測(cè)，結(jié)果顯示陽性率高達(dá)66.2%[8]。由此可見，TTSuV在世界豬群中存在廣泛的流行。

本研究采用PCR對(duì)TTSuV1a和TTSuV1b在四川省健康豬群中的流行情況進(jìn)行了調(diào)查，分段擴(kuò)增了TTSuV1的2個(gè)亞型TTSuV1a和TTSuV1b的近似全基因序列，并對(duì)TTSuV1的主要基因序列與NCBI已發(fā)表的參考毒株做了核苷酸同源性和進(jìn)化樹的比對(duì)分析，有助于更好地了解TTSuV在四川省內(nèi)的流行情況，并為進(jìn)一步研究TTSuV的遺傳進(jìn)化情況奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 QuickTaqHS DyeMix，東洋紡(上海)生物科技有限公司產(chǎn)品；感受態(tài)細(xì)胞DH5α，北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品；pMD-19-T、DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品； PCR產(chǎn)物純化試劑盒，北京鴻躍創(chuàng)新有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 引物 參考GenBank上已發(fā)表的TTSuV1全基因組序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)檢測(cè)和擴(kuò)增TTSuV1a(登錄號(hào)KT968712.1)、TTSuV1b(登錄號(hào)JX535328.1)的特異性引物，TTSuV1b檢測(cè)引物則參照已發(fā)表的文獻(xiàn)[9]，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物信息見表1。

表1 檢測(cè)和分段擴(kuò)增TTSuV1a和TTSuV1b引物信息

注：F1、R1和F2、R2分別為TTSuV1a和TTSuV1b的上、下游引物，其他為分段擴(kuò)增TTSuV1a和TTSuV1b的上、下游引物，其中引物序列中的字母W代表A or T；R代表A or G；H代表A or C or T；Y代表C or T；S代表C or G。

Note：F1,R1 and F2,R2 mean upstream and downstream primers of TTSuV1a and TTSuV1b，others mean upstream and downstream primers of TTSuV1a and TTSuV1b，letter W in primers means A or T；R means A or G；H means A or C or T；Y means C or T；S means C or G.

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 樣品采自2016年初至10月間，四川省不同地區(qū)的5個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)的140份臨床健康豬血清，保存于-40℃冰箱。

1.2.2 DNA提取 對(duì)140份臨床健康豬血清采用酚氯法提取DNA，將提取到的DNA置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 TTSuV1a和TTSuV1b的檢測(cè)及近似全基因的擴(kuò)增 用酚氯法提取到的DNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下：QuickTaqHS DyeMix 5 μL，上、下游引物均為10 pmol/L各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 3 μL；PCR反應(yīng)條件為：94℃ 2 min；94℃ 30 s，57℃ 30s，68℃ 1 min，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；最后72℃ 10 min；4℃終止反應(yīng)。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像掃描儀進(jìn)行檢測(cè)與分析。

1.2.4 PCR產(chǎn)物的純化、克隆及轉(zhuǎn)化 對(duì)檢測(cè)呈陽性的PCR產(chǎn)物按照DNA純化試劑盒說明書進(jìn)行操作純化目的條帶，并按照pMD19-T載體說明書進(jìn)行加樣，反應(yīng)體系如下：4.5 μL回收產(chǎn)物，0.5 μL pMD-19T vector，5 μLSolutionI,16℃，連接10 h～12 h。將上述的連接產(chǎn)物按照感受態(tài)細(xì)胞操作說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將菌液涂布在加了氨芐青霉素的LB平板上，37℃過夜培養(yǎng)。

1.2.5 菌落PCR鑒定及測(cè)序 在37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)的平板上隨機(jī)挑取白色單菌落置于10 μL的無菌水中，并取2 μL 作為模板DNA做菌落PCR鑒定，將鑒定為陽性的菌液加入含氨芐的LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，并將擴(kuò)大培養(yǎng)的的菌液送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 TTSuV1a和TTSuV1b在四川地區(qū)的流行情況

對(duì)采集的140份臨床健康豬血清樣本用特異性引物經(jīng)過PCR擴(kuò)增后，用凝膠電泳法對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行觀察，并對(duì)樣品檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，在140份血清樣本中共有124份血清樣本呈陽性，說明這5個(gè)豬場(chǎng)均有不同程度的TTSuV1感染，其中B豬場(chǎng)感染豬TTSuV1的陽性檢出率最低為3.33%～6.67%(95%CI：0.1%～11.8%)，C豬場(chǎng)的檢出率較低為63.33%(95%CI：43.9%～80.1%)，最高為96.67%(95%CI：82.8%～99.9%)(表2)。

2.2 TTSuV1a和TTSuV1b近似全基因的PCR擴(kuò)增

將通過普通PCR檢測(cè)的140份臨床健康豬血清樣本中呈陽性的樣本作為模板DNA進(jìn)行TTSuV1近似全基因序列的擴(kuò)增，采用分段設(shè)計(jì)引物的方式擴(kuò)增，分別設(shè)計(jì)了3對(duì)和5對(duì)特異性引物擴(kuò)增TTSuV1a和TTSuV1b的近似全基因組序列，其中F3～R5分別為擴(kuò)增TTSuV1a的上、下游引物；F6～R10分別為擴(kuò)增TTSuV1b的上、下游引物。引物序列如表1所示，將分段擴(kuò)增得到的片段，都經(jīng)NCBI-Blast序列比對(duì)正確后接著用DNA Star軟件將送去測(cè)序得到的基因序列到NCBI上與GenBank上已發(fā)表的相關(guān)序列進(jìn)行核苷酸序列分析，確認(rèn)基因片段已得到正確擴(kuò)增，最后將分段擴(kuò)增得到的正確序列拼接起來獲得了TTSuV1兩個(gè)亞型TTSuV1a和TTSuV1b的近似全基因序列，并將獲得的序列提交到GenBank，其中TTSuV1a型毒株擴(kuò)增得到2 497 bp(GenBank登錄號(hào)：KY937993)；TTSuV1b型毒株擴(kuò)增得到2 693 bp(GenBank登錄號(hào)：KY937994)。

表2 四川地區(qū)5個(gè)豬場(chǎng)血清樣本中TTSuV1a、TTSuV1b的陽性率

2.3 序列分析

本試驗(yàn)下載了多對(duì)NCBI公布的TTSuV1全基因組序列，并對(duì)試驗(yàn)分段擴(kuò)增得到的近似全基因組序列使用MegAlign6.0分子生物學(xué)軟件對(duì)TTSuV1的兩個(gè)亞型TTSuV1a和TTSuV1b的主要基因序列進(jìn)行同源性分析，其中TTSuV1a的ORF1與國(guó)內(nèi)外已發(fā)表的參考株的ORF1的同源性為79.3%～97.5%，ORF2與其他參考株的同源性為92.7%～98.2%，ORF3與其他參考株的同源性為55.8%～92.2%，可以看出本試驗(yàn)擴(kuò)增得到的TTSuV1a主要基因的ORF1、ORF3與國(guó)內(nèi)外參考毒株間的差異較大，而ORF2與其他參考毒株間的差異則較?。籘TSuV1b的ORF1與已發(fā)表的參考株的同源性為100%，ORF2與其他參考株的同源性為97.1%～98.6%，ORF3與其他參考株的同源性為99.0%～99.2%。說明TTSuV1b與其他參考毒株的同源性較近，差異很小。

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

為了分析比較本試驗(yàn)分段擴(kuò)增得到的TTSuV1兩個(gè)基因亞型的序列與國(guó)內(nèi)外其他參考毒株之間的遺傳變異及與其他毒株的親緣關(guān)系，在本試驗(yàn)中，根據(jù)NCBI已經(jīng)發(fā)表的TTSuV全基因組序列，下載了多對(duì)與其相對(duì)應(yīng)的TTSuV1兩個(gè)基因亞型的ORF1、ORF2、ORF3基因序列，并制作其系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1和圖2)。

從系統(tǒng)進(jìn)化樹中可以看出，本試驗(yàn)中擴(kuò)增出來的TTSuV1a的ORF1序列與美國(guó)分離株KT968712.1親緣關(guān)系較近，TTSuV1a的ORF2序列與HM633247.1和HM633255.1分離株具有較近的親緣關(guān)系，TTSuV1a的ORF3序列與中國(guó)分離株HM633244.1和KT037083.1的親緣關(guān)系較近，但它們都獨(dú)立成為一支，表明本試驗(yàn)擴(kuò)增得到一株新的TTSuV毒株；TTSuV1b的ORF1序列與中國(guó)北京分離的JX173486.1株具有很近的親緣關(guān)系，而TTSuV1b的ORF2序列與HM633221.1和HM633219.1分離株雖然有較近的親緣關(guān)系較近，但卻獨(dú)立成為一支，且覆蓋率極低，TTSuV1b的ORF3序列則與多株參考毒株有較近的親緣關(guān)系。從該試驗(yàn)擴(kuò)增得到的主要序列與其他參考株做進(jìn)化樹分析比較可以看出，擴(kuò)增得到的毒株序列與某些毒株類屬同一分支，親緣關(guān)系較近，而有些則組成一個(gè)支，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，表明了不同地區(qū)毒株可能存在著一些變異毒株。

3 討論

TTSuV廣泛存在于人和其他動(dòng)物之間，目前關(guān)于該病毒能否直接引發(fā)豬相關(guān)疾病的發(fā)生，至今沒有相關(guān)報(bào)道，但是有研究證明豬群中TTSuV可以與其他病原協(xié)同感染，而導(dǎo)致疾病的發(fā)生，并且還可以加重原有疾病的癥狀[10]。一些報(bào)道證實(shí)TTSuV與高致病性豬繁殖與呼吸綜合癥病毒、豬圓環(huán)病毒2型協(xié)同感染有一定的聯(lián)系，而且相關(guān)研究也表明該病毒能導(dǎo)致斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)和豬皮炎腎病綜合征(PDNS)發(fā)病[10-11]。

本試驗(yàn)主要針對(duì)2016年2月～10月采集自四川省5個(gè)豬場(chǎng)的140份臨床健康豬血清樣本，采用PCR進(jìn)行TTSuV1感染情況的調(diào)查，結(jié)果顯示四川省各個(gè)豬場(chǎng)均有不同程度的感染，而且TTSuV1a在豬群中的檢出率要高于TTSuV1b的檢出率，該檢測(cè)結(jié)果與國(guó)內(nèi)已報(bào)道的檢測(cè)結(jié)果相吻合[12-13]。也有報(bào)道稱在調(diào)查意大利豬群的膽汁和肝臟中TTSuV的流行情況時(shí)，發(fā)現(xiàn)TTSuV1a的感染率比TTSuV1b要高[14]。本研究是在四川省內(nèi)進(jìn)行的，因此，該研究結(jié)果能夠更好地幫助人們了解TTSuV在四川省的流行情況。

A、B、C分別代表TTSuV1a的ORF1、ORF2、ORF3與參考株的的進(jìn)化樹圖，SC為本研究擴(kuò)增得到的基因序列

A，B，C represent phylogenetic trees based on ORF1，ORF2，ORF3 of TTSuV1a and reference strains,SC means amplification gene sequences for this study

圖1 TTSuV1a的ORF序列與參考株的系統(tǒng)進(jìn)化樹

Fig.1 Phylogenetic tree of TTSuV1a ORF sequences with the reference strains

D、E、F分別代表TTSuV1b的ORF1、ORF2、ORF3與參考株的的進(jìn)化樹圖，SC為本研究擴(kuò)增得到的基因序列

D,E,F represent phylogenetic trees based on ORF1，ORF2，ORF3 of TTSuV1b and reference strains,SC means amplification of gene sequences for this study

圖2 TTSuV1b的ORF序列與參考株的系統(tǒng)進(jìn)化樹

Fig.2 Phylogenetic tree of TTSuV1b ORF sequences with the reference strains

本試驗(yàn)通過將檢測(cè)為TTSuV陽性的DNA進(jìn)行近似全基因組的擴(kuò)增，并對(duì)其ORF1、ORF2、ORF3基因做了核苷酸同源性和系統(tǒng)進(jìn)化樹的分析，通過基因組序列測(cè)定發(fā)現(xiàn)可將TTSuV1分為TTSuV1a和TTSuV1b兩個(gè)基因亞型，這與國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的分型結(jié)果一致。另外，從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，本研究擴(kuò)增得到TTSuV1a的ORF1基因序列與國(guó)內(nèi)外某些參考株間的差異較大，而ORF2與其他參考株間的差異則較小。TTSuV1b的ORF基因序列與其他參考毒株的同源性差異很小，有較近的親緣關(guān)系。通過基因組序列測(cè)定和系統(tǒng)進(jìn)化樹可以看出TTSuV1a的ORF1與KT968712.1分離株親緣關(guān)系較近；TTSuV1b的ORF3序列與比對(duì)的多株參考株親緣關(guān)系最近，但是覆蓋率較低，造成這種現(xiàn)象的原因可能是不同地區(qū)的豬群攜帶的TTSuV1存在一定的差異，也有可能是TTSuV1基因的變異所導(dǎo)致。

總而言之，本次分子流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果可以更好地了解TTSuV在四川省豬群中的流行情況，為豬與其他動(dòng)物之間的疫病防控提供一定的科學(xué)依據(jù)。通過對(duì)擴(kuò)增得到的TTSuV1近似全基因序列的分析，在一定程度上可以了解該病毒的遺傳變異情況和進(jìn)化關(guān)系，為進(jìn)一步研究該病毒的基因組成結(jié)構(gòu)提供一定的基礎(chǔ)依據(jù)和數(shù)據(jù)參考。

參考文獻(xiàn):

[1] Nishizawa T,Okamoto H,Konishi K,et al.A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase levels in posttransfusion pepatitis of unknown etiology[J].Biochem Biophys Res Commun,1997,241(1):92-97.

[2] Kadayifci A,Guney C,Uygun A,et al.Similar frequency of TT virus infection in patients with liver enzyme elevations and healthy subjects[J].Int J Clin Pract,2001,55(7):434.

[3] Tanaka Y,Hayashi J,Ariyama I,et al.Seroepidemiology of TT virus infection and relationship between genotype and liver damage[J].Digest Dis Sci,2000,45(11):2214.

[4] Verschoor E,Langenhuijzen S J.TT viruses (TTV) of non-human primates and their relationship to the human TTV genotypes[J].J Gene Virol,1999,80(Pt9)(9):2491-2499.

[5] Espasa M,González-Martín J,Alcaide F,et al.Direct detection in clinical samples of multiple gene mutations causing resistance ofMycobacteriumtuberculosisto isoniazid and rifampicin using fluorogenic probes[J].J Antimic Chemother,2005,55(6):860-865.

[6] 梅 淼.四川省豬細(xì)環(huán)病毒的分子流行病學(xué)調(diào)查及其Ⅱ型致斷奶仔豬的病理組織學(xué)觀察[D].四川成都：四川農(nóng)業(yè)大學(xué),2012.

[7] 田光玲,何后軍,張 黎,等.江西省豬細(xì)環(huán)病毒1型和2型流行情況調(diào)查及全基因組克隆與序列分析[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2016,36(7):1098-1102.

[8] Mckeown N E,Fenaux M,Halbur P G,et al.Molecular characterization of porcine TT virus,an orphan virus,in pigs from six different countries[J].Vet Microbiol,2004,104(104):113-117.

[9] Zhang B,Tang C,Yue H,et al.Viral metagenomics analysis demonstrates the diversity of viral flora in piglet diarrhoeic faeces in China[J].J Gene Virol,2014,95(7):1603-1611.

[10] Ellis J A,Allan G,Krakowka S.Effect of coinfection with genogroup 1 porcine torque teno virus on porcine circovirus type 2-associated postweaning multisystemic wasting syndrome in gnotobiotic pigs[J].Am J Vet Res,2008,69(12):1608-1614.

[11] Okamoto H,Takahashi M,Nishizawa T,et al.Genomic characterization of TT viruses (TTVs) in pigs,cats and dogs and their relatedness with species-specific TTVs in primates and tupaias[J].J Gene Virol,2002,83(Pt6):1291-1297.

[12] 南文金,婁高明,黃健強(qiáng),等.華南地區(qū)豬輸血傳播病毒流行病學(xué)調(diào)查與分析[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,40(12):145-148.

[13] 劉建波.豬細(xì)環(huán)病毒與豬圓環(huán)病毒2型分子生物學(xué)特性研究[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2014.

[14] Monini M,Vignolo E,Ianiro G,et al.Detection of torque teno sus virus in pork bile and liver sausages[J].Food Environ Virol,2016,8(4):1-6.