劉志科，張 潔，楊寧寧，徐錦鳳，徐明國，荊明龍，吳文星，曹旭東，任 艷，石 峰，陳創(chuàng)夫*

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832003；2.石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆石河子 832003；3.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆石河子 832002)

在最新的研究報(bào)告中，由沙門菌引起人食物中毒的病例居于首位，其中腸炎沙門菌占85%以上，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全球每年報(bào)道的沙門菌食物中毒的病人大約為170萬人，死亡人數(shù)大約在1 000人以上，且呈上升趨勢(shì)[1]，對(duì)公共衛(wèi)生安全構(gòu)成威脅。由此造成的醫(yī)療費(fèi)用每年約114億美元，給各國政府帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。因此，迫切需要建立一種快速、準(zhǔn)確診斷沙門菌食物中毒的方法。

目前，對(duì)沙門菌的檢測(cè)方法主要有傳統(tǒng)的分離鑒定方法、免疫學(xué)方法及分子生物學(xué)方法。傳統(tǒng)的沙門菌檢測(cè)方法是根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)(GB4789.4-2016)進(jìn)行的，其步驟比較繁瑣，耗時(shí)較長，至少需要4 d～7 d才能得出明確的診斷結(jié)果，雖然此方法為“金標(biāo)準(zhǔn)”，但已不能滿足實(shí)際工作的需要。免疫學(xué)方法主要利用抗原-抗體之間的特異性反應(yīng)，是一種定性或定量的診斷技術(shù)，其靈敏性和特異性比較高，但其操作復(fù)雜、試驗(yàn)條件要求高等因素，在臨床應(yīng)用上帶來了較大的不便 。分子生物學(xué)方法需要昂貴的儀器設(shè)備，且受人為操作技術(shù)影響較大，不能區(qū)別核酸來源于死菌還是活菌，在基層單位也很難普及和推廣應(yīng)用[3-7]。Notomi T等[8]研究者開發(fā)了一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)，具有靈敏度高、特異性好、操作簡單和方便快捷等優(yōu)點(diǎn)，其擴(kuò)增原理是利用一種具有鏈置換特性的Bst DNA聚合酶，該酶具有5′→3′聚合酶活性,可以針對(duì)特異性靶基因序列上的6個(gè)不同區(qū)域的4條引物和環(huán)引物，在簡單的恒溫裝置上即可快速實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增核酸的方法。LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過借助濁度儀、電泳及在反應(yīng)管中加入熒光染料進(jìn)行結(jié)果判斷[9-10]，檢測(cè)時(shí)間在60 min左右，與常規(guī)PCR方法[11-12]相比，克服了重復(fù)的熱變性并縮短了反應(yīng)時(shí)間，且靈敏度和特異性在一定程度上也得到了很大的提高，具有良好的應(yīng)用前景和發(fā)展?jié)摿13]。研究發(fā)現(xiàn)，invA基因是沙門菌重要的毒力因子，參與大多數(shù)沙門菌的入侵，并與致病性密切相關(guān)。在所有沙門菌侵襲機(jī)體的過程中，invA基因在毒力島SPI-1的侵襲功能上發(fā)揮不可替代的作用，同時(shí)也是沙門菌的主要標(biāo)記基因之一，該基因在沙門菌屬中的同源性高達(dá)99%以上，且與其他物種同源性較小[14]。

本研究根據(jù)沙門菌invA靶基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)LAMP引物，優(yōu)化檢測(cè)條件，建立一種切合實(shí)際的沙門菌LAMP檢測(cè)方法。通過對(duì)感染雞白痢沙門菌的病雞進(jìn)行剖檢，采集的臟器組織和人工污染沙門菌的魚粉作為樣品，用建立的沙門菌LAMP可視化檢測(cè)方法與常規(guī)PCR和real-time PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)其檢出率和靈敏度，旨在建立一種特異性強(qiáng)、敏感性高和操作簡便的沙門菌LAMP檢測(cè)方法，為沙門菌病原的快速檢測(cè)提供一種更便捷、可靠和適合基層的臨床應(yīng)用技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌種及來源 腸炎沙門菌(CVCC 3949)購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心；多殺性巴氏桿菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌、鏈球菌、無乳鏈球菌、變形桿菌、痢疾桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌和放線桿菌均由石河子大學(xué)微生物教研室保存。

1.1.2 主要儀器與試劑 紫外凝膠成像分析系統(tǒng)，Molecular Imager公司產(chǎn)品；超級(jí)恒溫水浴鍋，常州金壇精達(dá)儀器制造有限公司產(chǎn)品；Nanodrop-2000微量核酸蛋白檢測(cè)儀，美國Thermo Scientific公司產(chǎn)品；LightCycler?480II 實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)，羅氏公司產(chǎn)品；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、2×ESTaqMasterMix 、dNTP混合液，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；Bst 2.0 DNA聚合酶大片段(M0538)，New England Biolads(Beijing) 有限公司產(chǎn)品；鈣黃綠素、甜菜堿、MgSO4，Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物及探針的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI中GenBank公布的沙門菌invA基因(登錄號(hào)：NC003197.1)，并用生物學(xué)在線軟件分析該基因的保守核苷酸序列。針對(duì)invA基因的保守區(qū)域，結(jié)合環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法的引物設(shè)計(jì)原則，利用PrimerExplorer V3(http://primer exp lorer.jp/e/)在線引物設(shè)計(jì)軟件篩選出一套特異性較好的引物(圖1)；根據(jù)real-time PCR引物和探針的設(shè)計(jì)原則，利用Beacon Designer 軟件設(shè)計(jì)1對(duì)引物和探針，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為278 bp。試驗(yàn)所用得引物和探針見表1，均有Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd合成。

1.2.2 細(xì)菌培養(yǎng)和DNA模板制備 將試驗(yàn)涉及的沙門菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌、變形桿菌、痢疾桿菌、鏈球菌、多殺性巴氏桿菌、無乳鏈球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌和放線桿菌分別劃線接種于LB或血液固體培養(yǎng)基，放到37℃培養(yǎng)箱里，培養(yǎng)16 h～24 h，挑取單個(gè)菌落于LB或血液培養(yǎng)液里，在37℃、180 r/min條件下，振蕩培養(yǎng)16 h～48 h后，平板涂布培養(yǎng)法對(duì)各培養(yǎng)物進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，調(diào)整菌液濃度至1.0×108CFU/mL，然后按10倍梯度稀釋，其濃度分別為1.0×108CFU/mL～1.0×101CFU/mL等8個(gè)不同濃度的菌液。分別取不同濃度的菌液1 mL按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的操作步驟，提取細(xì)菌基因組DNA，作為LAMP、PCR及real-time PCR反應(yīng)模板，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 沙門菌invA基因的LAMP引物設(shè)計(jì)示意圖Fig.1 Schematic diagram of LAMP primer design for Salmonella invA gene表1 本試驗(yàn)檢測(cè)沙門菌所使用的特異性引物和探針Table 1 The specific primers and probes designed for Salmonella detection

類型Item引物名稱Primername引物序列(5′→3′)Primersequence(5′→3′)長度/bpSizePCR/real?timePCRinvAFAAAAGAAGGGTCGTCGTTAGG21invARCCACTCGCATCAAATCAAAA20探針ProbeFAM?TCAGTTCTTTATTGATTATGGC?TAMRA22LAMPinvAF3AGCTGTTGAACAACCCATTTG20invAB3TCGGCACAAGTAATATCAAC19invAFIP(F1c+F2)CTCAATACTGAGCGGCTGCTCTTTTTGTTGTTACGGCTATTTTGA45InvABIP(B1c+B2)GGTGGTTTTAAGCGTTTTTGTCTCTGTAGAGACTTTAT43LBTCCGTGAAGCAAAACGTAGCGCCG24

1.2.3 LAMP檢測(cè)方法的建立及反應(yīng)條件優(yōu)化 根據(jù)文獻(xiàn)[15]，初步確定LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，建立沙門菌LAMP檢測(cè)方法。反應(yīng)體系為：2.5 μL 10×ThermoPol緩沖液，1.5 μL MgSO4, 3 μL引物(包括內(nèi)引物(20 μmol/L)、外引物(10 μmol/L)和環(huán)引物(15 μmol/L)各1 μL)，3.5 μL dNTPs，2.5 μL甜菜堿(10 mol/L),1 μL Bst 2.0 DNA聚合酶，2 μL模板，1 μL鈣黃綠素，最后加ddH2O水補(bǔ)足25 μL；同時(shí)設(shè)置1個(gè)空白對(duì)照，用水替代模板。放入60℃恒溫水浴鍋擴(kuò)增1 h，80℃ 5 min使酶失去活性。取5 μL的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行30 g/L瓊脂糖凝膠電泳判斷結(jié)果。在此反應(yīng)體系和條件的基礎(chǔ)上對(duì)內(nèi)外引物濃度比例、dNTPs體積、Mg2+濃度、反應(yīng)溫度和擴(kuò)增時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，其中內(nèi)外引物的比例分別為5∶1、4∶1、3∶1、2∶1；dNTPs的體積為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 μL；MgSO4分別為1.0、1.5、2、2.5、3.0、3.5 μL；反應(yīng)溫度為54、56、58、60、62、64℃；擴(kuò)增時(shí)間為30、40、50、60 min。LAMP反應(yīng)條件和體系都在前一步優(yōu)化的基礎(chǔ)上進(jìn)行反應(yīng)，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行30 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，確定最佳的反應(yīng)體系和條件。最后，通過電泳方法和熒光染料方法進(jìn)行判定，確定最佳條件和體系。

1.2.4 沙門菌LAMP的特異性和重復(fù)性試驗(yàn) 按照上述1.2.3優(yōu)化的LAMP反應(yīng)條件和體系，分別以提取的腸炎沙門菌、多殺性巴氏桿菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌、鏈球菌、無乳鏈球菌、變形桿菌 、痢疾桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特桿菌和放線桿菌等11種食源性致病菌的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物用30 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。同時(shí)，用建立的LAMP方法，以提取的腸炎沙門菌為模板進(jìn)行擴(kuò)增，至少重復(fù)3次，已確定建立的檢測(cè)方法的重復(fù)性。

1.2.5 LAMP、常規(guī)PCR和real-time PCR方法的靈敏度比較 以腸炎沙門菌不同培養(yǎng)物(1.0×108CFU/mL～1.0×101CFU/mL)所對(duì)應(yīng)的DNA為模板，空白對(duì)照用水代替。利用上述1.2.3優(yōu)化的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，反應(yīng)產(chǎn)物通過電泳或鈣黃綠素可視化檢測(cè)，進(jìn)行方法的靈敏度試驗(yàn)。以invAF和invAR為上、下游引物進(jìn)行PCR反應(yīng)， PCR反應(yīng)體系20 μL，包括2×ESTaqMasterMix 10 μL，上、下游引物invAF和invAR各0.3 μL，模板2 μL， ddH2O 7.4 μL；PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 5 min；95℃ 40 s，59℃ 30 s,30個(gè)循環(huán)；72℃ 1 min 50 s。擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行電泳，根據(jù)目的條帶的亮度判斷其靈敏度。在常規(guī)PCR引物基礎(chǔ)上增加1個(gè)水解探針，進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系10 μL：包括2×PCR Master Mix 5 μL，上、下游引物invAF和invAR各0.2 μL，探針0.2 μL，模板1 μL，ddH2O 3.4 μL;反應(yīng)條件為95℃ 5 min,94℃ 15 s,58℃ 30 s，72℃ 10 s,同時(shí)捕捉FAM信號(hào)，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)“S”形曲線而變化的熒光信號(hào)強(qiáng)度，求出Ct值，然后把Ct值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以計(jì)算出該樣品檢測(cè)的起始濃度。

1.2.6 沙門菌病原人工污染的魚粉及臨床樣品檢測(cè) 取經(jīng)檢測(cè)未被沙門菌污染的魚粉(10 g)9份,取1.2.2稀釋好的不同濃度的腸炎沙門菌菌液(1.0×108CFU/mL～1.0×101CFU/mL)1 mL,與魚粉勻漿液等體積混勻，其中陰性對(duì)照用PBS代替菌液。按照細(xì)菌基因組提取試劑盒說明提取細(xì)菌核酸，利用Nanodrop-2000微量核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定其濃度，各取2 μL作為LAMP、PCR和real-time PCR方法檢測(cè)時(shí)的模板。

為了評(píng)價(jià)所建立的LAMP檢測(cè)方法的優(yōu)勢(shì)，對(duì)新疆某種雞場(chǎng)有一定沙門菌病臨床癥狀的25只病雞，用平板凝集試驗(yàn)方法進(jìn)行初篩，結(jié)合細(xì)菌分離鑒定方法進(jìn)行確診。剖檢后取肝臟、脾臟和腸內(nèi)容等樣品，并對(duì)這些樣品進(jìn)行病原分離鑒定，同時(shí)用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒分別提取這些組織的核酸。分別進(jìn)行LAMP、PCR和real-time PCR檢測(cè)，比較3種方法的檢出率，并與病原分離的結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 沙門菌LAMP檢測(cè)方法的建立

以提取的腸炎沙門菌(濃度為1.0×105CFU/mL)DNA為模板，進(jìn)行LAMP反應(yīng)，其產(chǎn)物進(jìn)行熒光染料顯色觀察和30 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析。陽性結(jié)果熒光染料顯色呈綠色，而空白對(duì)照為橙黃色(圖2A)。瓊脂糖凝膠電泳可見明顯的特異性大小不一的梯形條帶(圖2B)，而空白對(duì)照無梯形條帶。結(jié)果表明，所建立的LAMP方法擴(kuò)增的梯形條帶為腸炎沙門菌invA的基因片段。

2.2 LAMP擴(kuò)增最佳反應(yīng)條件的確定

當(dāng)內(nèi)外引物濃度比例為3∶1(圖3A)時(shí)，目的條帶最亮；通過對(duì)反應(yīng)試劑中加入的不同dNTPs和MgSO4的體積進(jìn)行摸索，最終確定dNTPs為3.5 μL(圖3B)，MgSO4為1.5 μL(圖3C)，擴(kuò)增溫度為62℃(圖3D)，其LAMP擴(kuò)增效率最佳，呈現(xiàn)典型的梯形條帶；同時(shí)對(duì)反應(yīng)的時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化結(jié)果表明，當(dāng)擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間在40 min時(shí)，即可以出現(xiàn)明顯的梯形條帶，50 min時(shí)條帶幾乎沒有任何的變化趨于飽和(圖3E)，而在試驗(yàn)檢測(cè)時(shí)可能會(huì)遇到樣品模板濃度較低的情況，為了確保在較低濃度的沙門菌病原作為模板進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，依然可以擴(kuò)增出條帶，因此確定最佳的反應(yīng)時(shí)間為50 min。通過對(duì)反應(yīng)體系和條件優(yōu)化，最終確定25 μL的最佳反應(yīng)體系為：2.5 μL 10×ThermoPol緩沖液，1.5 μL MgSO4, 4 μL引物(包括內(nèi)外引物比例為2∶1和環(huán)引物為1 μL)，3.5 μL dNTPs，2.5 μL甜菜堿(10 mol/L),1 μL Bst 2.0 DNA聚合酶，2 μL模板質(zhì)粒，1 μL鈣黃綠素，最后加ddH2O水補(bǔ)足25 μL；混勻并簡短瞬離后，在60℃恒溫水浴條件下擴(kuò)增50 min后，80℃ 5 min使酶失去活性。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000；1. LAMP產(chǎn)物；2.陰性對(duì)照；A.鈣黃綠素-可視化LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物；B.AMP擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析

M.DNA Marker DL 1 000；1. LAMP products；2.Negative control；A.Calcein-visualization LAMP products；B.LAMP product electrophoresis

圖2沙門菌LAMP檢測(cè)方法的建立

Fig.2 The establishment of LAMP forSalmonelladetection

2.3 LAMP檢測(cè)方法的特異性和重復(fù)性試驗(yàn)

采用已經(jīng)優(yōu)化好的沙門菌LAMP反應(yīng)體系和條件，對(duì) 11株試驗(yàn)菌株進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，來確認(rèn)方法的特異性。圖4電泳結(jié)果顯示，只有沙門菌有預(yù)期的特征性梯形條帶，而其他非沙門菌均沒有條帶，此方法的特異性較好。以沙門菌基因組DNA為模板進(jìn)行多次重復(fù)試驗(yàn)，LAMP產(chǎn)物電泳結(jié)果均為陽性，空白對(duì)照結(jié)果為陰性 ，表明該方法重復(fù)性較好(圖5)。

A.內(nèi)外引物濃度比例的優(yōu)化；M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000；1～4.引物比例分別為5∶1、4∶1、3∶1、2∶1；5.陰性對(duì)照；B.反應(yīng)體系中dNTPs的優(yōu)化；M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.陰性對(duì)照；2～9. 1.0 μL、1.5 μL、2.0 μL、2.5 μL、3.0 μL、3.5 μL、4.0 μL、4.5 μL；C.反應(yīng)體系中MgSO4的優(yōu)化；M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～6.1.0 μL、1.5 μL、2 μL、2.5 μL、3.0 μL、3.5 μL；7.陰性對(duì)照；D.反應(yīng)溫度的優(yōu)化；M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.陰性對(duì)照；2～7.54℃、56℃、58℃、60℃、62℃、64℃的擴(kuò)增產(chǎn)物；E.反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化；M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.陰性對(duì)照；2、4、6、8. 30 min、40 min、50 min、60 min的擴(kuò)增產(chǎn)物；3，5，7.空白對(duì)照

A.Optimization of the primer ratios;M.DNA Marker DL 1 000; 1-4.Primer ratios of 5∶1,4∶1,3∶1,2∶1;5.Negative control; B.Optimization of the dNTPs concentration; M. DNA Marker DL 2 000; 1:Negative control; 2-9.dNTPs of 1.0 μL,1.5 μL,2.0 μL,2.5 μL,3.0 μL,3.5 μL,4.0 μL; C:Optimization of MgSO4;M.DNA Marker DL 2 000;1-6. MgSO41.0 μL,1.5 μL,2 μL,2.5 μL,3.0 μL,3.5 μL; 7.Negative control;D.Optimization of reaction temperature;M.DNA Marker DL 2 000; 1.Negative control; 2-7.Temperature 54℃,56℃,58℃,60℃,62℃,64℃ amplification products; E.Optimization of reaction time；M.DNA Marker DL 2 000; 1.Negative control; 2,4,6,8. 30 min,40 min,50 min,60 min amplification products; 3,5,7. The blank control

圖3 LAMP方法檢測(cè)沙門菌最適反應(yīng)條件的優(yōu)化

Fig.3 Optimization of reaction conditions of the LAMP for detectionSalmonella

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000；1.以無菌水作為模板；2.以腸炎沙門菌的核酸作為模板；3～12.分別以多殺性巴氏桿菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌、鏈球菌、無乳鏈球菌、變形桿菌 、痢疾桿菌、單增李斯特菌和放線桿菌的基因組DNA作為模板

M.DNA Marker DL1 000; 1.Sterile water as template; 2.Salmonellaenteritidisas template; 3-12.Templates fromPasteurellamultocida,Escherichiacoli,Staphylococcusaureus,Bacillussubtilis,Streptococcus,Streptococcusagalactiae,Proteus,Shigella,ListeriamonocytogenesandActinobacillussp,respectively

圖4 LAMP檢測(cè)方法特異性分析結(jié)果

Fig.4 Analysis of specificity results of LAMP detection method

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000；1.以無菌水為模板作為陰性對(duì)照；2～11.分別以腸炎沙門菌CVCC 3949的基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增

M.DNA Marker DL 1 000; 1.Sterile water as a template as a negative control; 2-11.Template fromSalmonellaenteritidisCVCC 3949 genomic DNA,respectively as positive control

圖5 LAMP檢測(cè)方法的重復(fù)性分析結(jié)果

Fig.5 Analysis of reproducibility of results of LAMP detection method

2.4 LAMP、PCR和real-time PCR靈敏度比較

以提取的不同濃度的腸炎沙門菌基因組為模板，進(jìn)行LAMP反應(yīng)，肉眼可視化和電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)(圖6A和6B)，其最低檢測(cè)濃度為1.0×102CFU/mL；而PCR最低可檢測(cè)到1.0×105CFU/mL(圖6C)。real-time PCR最低可檢測(cè)模板的濃度為1.0×101CFU/mL，比LAMP方法靈敏度高1個(gè)數(shù)量級(jí)(圖6D)。結(jié)果表明，建立的沙門菌LAMP方法的靈敏度與real-time PCR方法的靈敏度基本相當(dāng)，比常規(guī)PCR方法高1 000倍。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn) DL 1 000；1.陰性對(duì)照；2～9.腸炎沙門菌CVCC 3949濃度分別為1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101CFU/mL; A.鈣黃綠素-LAMP；B.LAMP產(chǎn)物電泳；C.普通PCR產(chǎn)物電泳;D.real-time PCR

M. DNA Marker DL 1 000; 1.Negative control; 2-9.SalmonellaCVCC 3949 diluted of 1×108，1×107，1×106，1×105，1×104，1×103，1×102，1×101CFU/mL; A.Calcium chlorophyll-LAMP products; B.Electrophoresis of LAMP products; C.Electrophoresis of conventionl PCR products;D.real-time PCR

圖6 LAMP(A，B)、普通PCR(C)和real-time PCR(D)方法檢測(cè)沙門菌的靈敏度分析

Fig.6 Sensitivity comparison analyses of LAMP (A,B)，common PCR(C) and real-time PCR (D) methods for detectingSalmonella

2.5 LAMP、PCR和real-time PCR方法檢測(cè)沙門菌人工污染魚粉及臨床樣品結(jié)果

不同濃度的腸炎沙門菌人工污染魚粉后，用所建立的LAMP方法和real-time PCR方法進(jìn)行檢測(cè)其結(jié)果(表3)，兩種方法均可以從5.0×102CFU/mL的人工污染的沙門菌魚粉中檢測(cè)到該菌，而陰性對(duì)照魚粉中未能檢測(cè)到該菌；且與傳統(tǒng)的細(xì)菌分離方法檢測(cè)結(jié)果一致。而常規(guī)PCR方法檢測(cè)的靈敏度為5.0×105CFU/mL ，陰性對(duì)照也未檢測(cè)出該病原體。

表3 腸炎沙門菌人工污染魚粉檢測(cè)結(jié)果

注：+.陽性；-.陰性。

Note：+.Postive；-.Negative.

對(duì)臨床疑似沙門菌病的病雞，解剖后取肝臟、脾臟和腸內(nèi)容物等共獲的75份可疑病料。傳統(tǒng)的細(xì)菌分離方法結(jié)果顯示(表4)49份為陽性，26份為陰性，陽性率為65.4%；應(yīng)用PCR檢測(cè)方法得到陽性46份，陰性為29份，陽性率為61.3%；而LAMP技術(shù)和real-time PCR方法的檢測(cè)結(jié)果一致，其陽性率為65.4%。說明LAMP檢測(cè)方法對(duì)臨床樣品的檢出率比常規(guī)PCR方法的高，與傳統(tǒng)的細(xì)菌分離結(jié)果相符。3種方法檢測(cè)結(jié)果與國家標(biāo)準(zhǔn)方法(GB4789.4-2016)檢測(cè)結(jié)果的符合率分別為100%、93.7%、100%，LAMP檢測(cè)方法的臨床檢出率比常規(guī)PCR方法的要高。

表4 細(xì)菌分離鑒定、LAMP、PCR和real-time PCR方法對(duì)臨床樣本的檢測(cè)結(jié)果

3 討論

沙門菌可以引起不同動(dòng)物的多種多樣的急性和慢性疾病，給人類經(jīng)濟(jì)和公共衛(wèi)生造成了巨大的威脅。據(jù)美國疾病控制和預(yù)防中心(CDC)報(bào)告，美國公民每年由于感染沙門菌病而住院的病人達(dá)到1.5萬多人，其中400多人死亡 ，而大多數(shù)感染者為老人和幼齡兒童；而這些食物中毒病例中大多數(shù)源于食用了污染沙門菌的禽產(chǎn)品和牛奶[15]。因此，在食品安全或者沙門菌食物中毒的臨床診斷中，非常有必要建立一種快速、可靠和高靈敏的沙門菌檢測(cè)方法。

本研究以沙門菌的invA為靶基因，利用軟件設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物和一個(gè)環(huán)引物，建立了一種快速、高效檢測(cè)沙門菌的LAMP方法，該方法操作簡單，可目視化，通過電泳和熒光染料等途徑都可以判定結(jié)果。其優(yōu)點(diǎn)是其他分子生物學(xué)方法不可替代的，用該方法對(duì)臨床樣本的檢測(cè)結(jié)果與行業(yè)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)方法的檢出率一致；對(duì)人工污染的魚粉樣品檢測(cè)的靈敏度為5.0×102CFU/mL，比常規(guī)PCR方法高1 000倍，比real-time PCR方法檢測(cè)靈敏度結(jié)果低一個(gè)數(shù)量級(jí)，這可能是real-time PCR的引物設(shè)計(jì)增加了一個(gè)特異性的水解探針的緣故[11]；但熒光定量PCR對(duì)試驗(yàn)技術(shù)和條件要求相對(duì)較高。LAMP技術(shù)的核心環(huán)節(jié)是引物設(shè)計(jì)、穩(wěn)定的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件以及操作加樣無菌區(qū)域的控制。引物必須同時(shí)滿足特異性好和高度保守的核苷酸特異性區(qū)域，是保證LAMP檢測(cè)方法成功與否的一個(gè)關(guān)鍵因素。而本研究選擇的靶基因invA高度保守，國內(nèi)外學(xué)者利用該基因，設(shè)計(jì)PCR和LAMP特異性引物的相關(guān)研究報(bào)道比較多。Kokkios P A等[16]學(xué)者建立了LAMP方法用于檢測(cè)食品中沙門菌的含量；Abdelaziz N M等[17]建立PCR方法檢測(cè)雞肉中沙門菌，以上兩種方法都是以高度保守的invA基因?yàn)闄z測(cè)靶標(biāo)。本試驗(yàn)對(duì)LAMP反應(yīng)組分中的Mg2+濃度、dNTP濃度、擴(kuò)增溫度和反應(yīng)時(shí)間等都進(jìn)行了優(yōu)化，確定了最佳的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。LAMP擴(kuò)增反應(yīng)效率較高，當(dāng)反應(yīng)液中加入鈣黃綠素后，有擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)為綠色，反之，為橙黃色。另外，在對(duì)臨床采集的75個(gè)樣本(陰性26個(gè))進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)所建立的LAMP方法的檢出率與常規(guī)的細(xì)菌分離鑒定方法一致。

目前，判定某種檢測(cè)方法的優(yōu)劣主要從靈敏度、操作方便和實(shí)用性這3個(gè)指標(biāo)去衡量，能否在基層推廣應(yīng)用也是重要因素。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法是基于微生物學(xué)知識(shí)，通常需要增菌培養(yǎng)，得出確切的診斷結(jié)果至少需要1周左右。就目前對(duì)沙門菌病診斷技術(shù)的研究趨勢(shì)來看，其檢測(cè)方法的研究方向主要圍繞經(jīng)濟(jì)和高效這兩個(gè)方面。而當(dāng)前的分子生物學(xué)檢測(cè)方法主要包括PCR、real-time PCR、套式PCR及PCR-基因芯片等方法，都具有較高的靈敏度和精確度，但需要借助昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)的技術(shù)人員操作等，一般的基層單位很難滿足[18-20]。Chen Z等[21]基于沙門菌的目標(biāo)invE基因和3個(gè)血清型特異性的基因(flic、lygD和STM4495)建立了LAMP技術(shù)，最低可檢測(cè)出2.0×101CFU/mL沙門菌，而常規(guī)PCR方法的最低檢測(cè)限為2.33×103CFU/mL。本研究建立的沙門菌LAMP方法其靈敏度為1.0×102CFU/mL。Less D等[22]利用免疫膠體金技術(shù)原理，建立了一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增聯(lián)合橫向流動(dòng)試紙條檢測(cè)ZiKa病毒的方法，該方法無需電泳，35 min內(nèi)肉眼直接可以讀出結(jié)果，其靈敏度高，對(duì)于2 μL的LAMP反應(yīng)產(chǎn)物作為樣品，其最低可檢測(cè)到單個(gè)拷貝數(shù)。但目前該方法僅局限于血液樣本的檢測(cè)。Wang D等[23]應(yīng)用氧化還原反應(yīng)建立了快速檢測(cè)沙門菌的電化學(xué)方法，其最低檢測(cè)限為7.6×102CFU/mL～6.0×102CFU/mL。Wu G P等[24]將LAMP技術(shù)與熒光定量PCR方法結(jié)合，結(jié)合各自方法的優(yōu)缺點(diǎn)并進(jìn)行改善，建立了一種Rti-LAMP方法應(yīng)用于食物表面沙門菌檢測(cè)，最低可以檢測(cè)出6 CFU/2.5 μL(模板)，整個(gè)反應(yīng)在3.5 h內(nèi)就可以完成。Yang Q等[25]建立的LAMP-BART技術(shù)，需要在反應(yīng)體系中加入特定的熒光素酶，其數(shù)據(jù)處理復(fù)雜，反應(yīng)時(shí)間較長，容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，應(yīng)用于食品和飼料樣品的檢測(cè)，其靈敏度達(dá)到了104CFU/25 g～106CFU/25 g樣品。本研究建立的可目視化LAMP方法，增加了一條環(huán)引物，提高了擴(kuò)增效率，縮短了反應(yīng)時(shí)間，擴(kuò)增反應(yīng)在1 h內(nèi)就可以完成，其靈敏性和特異性比較好；并且整個(gè)反應(yīng)結(jié)束后，無需開蓋通過顏色變化即可判斷結(jié)果，避免了二次污染產(chǎn)生的假陽性問題。

本研究以沙門菌高度保守且特異性較強(qiáng)的invA基因?yàn)闄z測(cè)靶標(biāo)，建立的可目視化環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法具有特異性強(qiáng)、敏感度高和結(jié)果可目視等優(yōu)點(diǎn)，可以在62℃恒溫條件下，60 min內(nèi)完成對(duì)沙門菌的檢測(cè)，對(duì)儀器和試驗(yàn)條件要求比較低，其靈敏度可以達(dá)到1.0×102CFU/mL，該方法對(duì)于沙門菌的臨床檢測(cè)、食品安全和公共衛(wèi)生機(jī)構(gòu)監(jiān)控提供了一個(gè)有效的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)技術(shù)保障。

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