劉向楠，饒 丹，叢 鋒，練月曉，曾繁文，黃 韌，張 鈺，郭鵬舉，羅滿林，陳梅麗*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510642；2.廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所，廣東廣州 510663；3.廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510663)

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的豬的一種高度接觸性腸道傳染病，該病的主要特征是急性水樣腹瀉、嘔吐和脫水死亡；各種年齡階段的豬均易感，尤其對(duì)1周齡～2周齡哺乳仔豬危害最為嚴(yán)重，病死率高達(dá)90%～100%，給養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。亞洲一些國(guó)家如泰國(guó)、韓國(guó)、越南及中國(guó)多次報(bào)道了PED[2]。美國(guó)于2013年4月出現(xiàn)PED疫情并快速蔓延到整個(gè)國(guó)家，截止2014年底已累計(jì)造成至少 800萬(wàn)頭新生仔豬死亡，經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)18億美元[3]。

PEDV屬于冠狀病毒科，為單股正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)約 28 kb，纖突蛋白(S)是S基因編碼的位于病毒粒子表面的纖突糖蛋白，具有高度免疫原性和反應(yīng)原性，是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體和提供免疫保護(hù)作用的主要結(jié)構(gòu)蛋白，也是研發(fā)PEDV疫苗的一個(gè)主要候選蛋白[1,4]。S蛋白主要用來(lái)研究不同毒株的遺傳關(guān)系和多樣性，以及遺傳變異和病毒功能之間的關(guān)系。通過(guò)氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，與PEDV早期毒株和疫苗株等經(jīng)典毒株相比，近年來(lái)在中國(guó)、美國(guó)、韓國(guó)流行株的PEDV變異株突變集中在S基因的N端，在56-59 aa和144 aa處存在氨基酸的缺失，27-30、61-64、68-72、81-89、160-167、201-207 aa存在連續(xù)超過(guò)4個(gè)氨基酸的突變。這些缺失或突變可能是PEDV近年暴發(fā)流行的原因[5]。本研究基于PEDV經(jīng)典毒株和變異流行株在S基因序列的差異，建立了一種PCR結(jié)合高分辨率熔解曲線(high resolution melting-curve，HRM)分析技術(shù)方法，該方法能夠在實(shí)驗(yàn)室中簡(jiǎn)單、快速、低成本地鑒別PEDV經(jīng)典毒株與變異毒株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒和臨床樣本 CV777疫苗株作為經(jīng)典毒株代表株，GD株(由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所分離并保存)作為變異株代表株；2011年-2016年于廣東省收集的10份腹瀉仔豬小腸內(nèi)容物作為臨床樣本。豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV) 經(jīng)典毒株CH-1R、偽狂犬病病毒(Porcine pseudorabies virus，PRV)、豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus， PPV)、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus 2，PCV2)、口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)均為疫苗株，購(gòu)自廣東省動(dòng)物防疫物資儲(chǔ)備中心;豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)、A群豬輪狀病毒(Porcine rotavirus，PoRV)、豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、豬德爾塔冠狀病毒 (Porcine delta coronavirus, PDCoV)由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)馬靜云教授惠贈(zèng);豬流感病毒(Swine influenza virus，SIV)核酸由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)尹燕博教授惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑和儀器 pMD-19T載體、一步法反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒、DNA Marker，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；E.coliDH5α、核酸提取試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；飽和染料LC Green，BioFire公司產(chǎn)品；熒光定量PCR儀(Rotor-Gene Q)，德國(guó)凱杰公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 核酸提取 小腸內(nèi)容物用適當(dāng)量PBS混勻，以3 000 r/min離心，取上清200 μL用于抽提核酸。PEDV GD株接Vero細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，收獲病毒，細(xì)胞及上清經(jīng)3次凍融，取200 μL用于抽提核酸。商品疫苗株使用稀釋液溶解，取200 μL用于抽提核酸。用天根核酸自動(dòng)抽取儀及配套試劑盒分別提取豬繁殖與呼吸綜合征病毒經(jīng)典毒株、高致病性毒株、天津疫苗株及臨床組織樣本中的RNA。

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 應(yīng)用Oligo6.0軟件比對(duì)17株P(guān)EDV毒株的S基因序列，根據(jù)變異流行株與經(jīng)典毒株S基因的缺失位點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)引物，PEDV引物P1:CGGTTCTTTTCAAAATTTAATG；PEDV引物P2：ATACCATGAACGCCACTA。

1.2.3 一步法RT-PCR-HRM擴(kuò)增體系及條件 通過(guò)對(duì)引物RT-PCR反應(yīng)條件及反應(yīng)體系的優(yōu)化，確定了PCR最佳反應(yīng)體系。DNA反應(yīng)體系為20 μL：核酸模板 2 μL，2×Premix HSTaq10 μL，上游引物P1 (10 μmol/L)0.5 μL，下游引物P2 (10 μmol/L)0.5 μL， LC Green 1 μL，補(bǔ)水至20 μL。RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 35 s；循環(huán)35次；72℃ 5 min。HRM分析儀器熔解溫度設(shè)定是以每步升溫0.3℃的速率從70℃～90℃進(jìn)行熒光信號(hào)的收集。

1.2.4 特異性試驗(yàn) 采用建立的RT-PCR-HRM方法對(duì)豬瘟病毒(CSFV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬德爾塔病毒(PDCoV)、豬輪狀病毒(PoRV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬細(xì)小病毒(PRV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、口蹄疫病毒(FMDV)進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證該方法的特異性。

1.2.5 敏感性試驗(yàn) 將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品用Easy dilution(Takara公司)做10倍系列稀釋，得到1×108～1×101copies/μL系列標(biāo)準(zhǔn)模板。利用優(yōu)化后的反應(yīng)體系和條件，以各稀釋度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增及HRM分析。

1.2.6 臨床應(yīng)用 應(yīng)用建立的PCR-HRM方法10份對(duì)樣本進(jìn)行RT-PCR-HRM檢測(cè)，每次反應(yīng)同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。通過(guò)PCR產(chǎn)物熔解曲線來(lái)判斷結(jié)果。采用測(cè)序方法對(duì)部分陽(yáng)性樣本進(jìn)行測(cè)序，對(duì)檢測(cè)方法做進(jìn)一步驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 PCR-HRM方法的建立

圖1和圖2分別是經(jīng)典毒株與流行變異株的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)化熔解曲線與峰型熔解曲線圖。標(biāo)準(zhǔn)熔解曲線圖中，疫苗株與野毒株存在明顯的熔解曲線差異，野毒株的熒光信號(hào)減弱的起始溫度與最后趨于0的溫度明顯小于疫苗株。對(duì)比峰型化熔解曲線，即熒光信號(hào)導(dǎo)數(shù)化熔解曲線，經(jīng)典毒株的熔解曲線Tm值為83℃～83.5℃出現(xiàn)熔解峰，流行變異株擴(kuò)增的熔解曲線在84.25℃～84.75℃出現(xiàn)熔解峰。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化和峰型熔解曲線均能明顯的區(qū)分經(jīng)典毒株與流行變異毒株。

圖1 PEDV經(jīng)典毒株和變異毒株標(biāo)準(zhǔn)化熔解曲線Fig.1 Standard melting curves analysis of PEDV mutant strains and classic strains

圖2 PEDV經(jīng)典毒株和變異毒株峰型熔解曲線圖Fig.2 Conventional melting curves of PEDV mutant strains and classic strains

2.2 特異性試驗(yàn)

使用P1/P2引物對(duì)CSFV、TGEV、PDCoV、PoRV、PCV2、PPV、PRV、PRRSV、FMDV與PEDV經(jīng)典毒株和變異流行株一同進(jìn)行RT-PCR。結(jié)果除PEDV具有目的條帶外，其他病毒均無(wú)目的條帶，表明建立的方法具有良好的特異性(圖3)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)50 bp;1.陰性對(duì)照；2.豬流行性腹瀉病毒經(jīng)典株；3.豬流行性腹瀉病毒變異株；4.豬傳染性胃腸炎病毒；5.Delta冠狀病毒；6.豬圓環(huán)病毒2型；7.豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒；8.豬細(xì)小病毒；9.豬流感病毒；10.豬瘟病毒；11.口蹄疫病毒；12.豬偽狂犬病毒；13.豬輪狀病毒

M.DNA Marker 50 bp；1.Negative control；2.PEDV classic strain；3.PEDV mutant strain；4.TGEV；5.Delta CoV；6.PCV2；7.PRRSV；8.PPV；9.SIV；10.CSFV；11.FMDV；12.PRV；13.PoRV

圖3 PEDV毒株特異性試驗(yàn)

Fig.3 Specificity test of PEDV strains

2.3 敏感性試驗(yàn)

以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝濃度為1×108～1×101copies/μL為標(biāo)準(zhǔn)模板，在P1/P2引物為引物的反應(yīng)體系擴(kuò)增下評(píng)估RT-PCR-HRM方法的靈敏度，圖4和圖5分別是經(jīng)典株與變異株陽(yáng)性質(zhì)粒樣品的峰型化熔解曲線圖，經(jīng)典株陽(yáng)性質(zhì)粒從10-1稀釋至10-8均出現(xiàn)了特異性的熔解峰，變異株陽(yáng)性質(zhì)粒從10-1稀釋至10-9均出現(xiàn)了特異性的熔解峰。結(jié)果表明該方法的靈敏度較高，對(duì)經(jīng)典株與變異株陽(yáng)性質(zhì)粒的最低檢測(cè)限分別為1 350 copies/μL和192 copies/μL。

2.4 PCR-HRM在臨床樣本檢測(cè)中的應(yīng)用

利用PCR-HRM分析方法對(duì)10份臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，如圖6所示，通過(guò)對(duì)圖形的分析，發(fā)現(xiàn)其中有4份樣本熔解峰出現(xiàn)在83℃～83.5℃，判定為豬流行性腹瀉病毒經(jīng)典株；另外6份樣本熔解峰在84.25℃～84.75℃，判斷為豬流行性腹瀉病毒變異流行株。在99%置信區(qū)間，Tm值無(wú)交叉，兩者差異極顯著(P<0.01)。隨機(jī)選擇8份樣品，測(cè)序結(jié)果與HRM分析結(jié)果一致。

圖4 PEDV經(jīng)典株質(zhì)粒梯度熔解曲線峰型圖Fig.4 Conventional melting curves of gradient plasmids of PEDV classic strains

圖5 PEDV變異株質(zhì)粒梯度熔解曲線峰型圖Fig.5 Conventional melting curves of gradient plasmids of PEDV mutant strains

圖6 高分辨率溶解曲線分析臨床樣本Fig.6 Analysis of clinical samples by PCR-HRM

3 討論

自2010年起，中國(guó)主要養(yǎng)豬省份陸續(xù)暴發(fā)了PED，不同PEDV基因組全序列比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)自2010年以后的流行毒株多個(gè)基因發(fā)生變異，表明此次中國(guó)乃至世界范圍內(nèi)流行的PED是由PEDV變異株引起的[6-8]；與此同時(shí)PEDV經(jīng)典毒株仍存在。

傳統(tǒng)的PEDV鑒定方法主要有病毒的分離培養(yǎng)、間接ELISA、雙抗夾心膠體金、RT-PCR以及實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR等方法。其中病毒的分離培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，但Vero細(xì)胞加胰酶的方法分離PEDV困難，成功率低；分子生物學(xué)方法成為鑒定PEDV的主要方法，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR相比普通PCR靈敏度高，目前在各實(shí)驗(yàn)室廣泛使用。鑒定為PEDV陽(yáng)性的樣品，通常需要測(cè)序才能進(jìn)一步確定為PEDV變異毒株還是經(jīng)典毒株，該方法耗時(shí)久，費(fèi)用高。

高分辨熔解曲線分析技術(shù)(HRM)是一種用于單核苷酸多態(tài)性(SNP)和基因分型研究的方法，該方法是簡(jiǎn)單、快速、低成本的PCR擴(kuò)增后檢測(cè)技術(shù)，主要用于高通量的突變掃描和基因分型[9]。目前，在動(dòng)物病原鑒別檢測(cè)中報(bào)道逐年增加。

本研究根據(jù)PEDV經(jīng)典毒株與變異株在S基因的175-185位缺失11個(gè)核苷酸,建立了RT-PCR-HRM方法用于鑒別PEDV經(jīng)典毒株與變異株，該方法可以在2 h內(nèi)鑒定毒株為經(jīng)典毒株或是變異株，對(duì)CSFV、PRV、PPV和PRRSV等均無(wú)特異性擴(kuò)增且靈敏度較高，在臨床樣品檢測(cè)中驗(yàn)證該方法有效。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可以在Rotor-Gene Q儀器上直接分析，無(wú)需開蓋，避免了凝膠污染問(wèn)題，同時(shí)也提高了分析的靈敏度。

RT-PCR-HRM方法克服了病毒分離鑒定、基因測(cè)序繁瑣、成本高、耗時(shí)長(zhǎng)的缺點(diǎn)，也解決了傳統(tǒng)RT-PCR特異性低、靈敏性差的問(wèn)題。既能檢測(cè)發(fā)病動(dòng)物機(jī)體感染PEDV是否為變異毒株，更能定性檢測(cè)病料中PEDV的存在與否，極大地方便了生產(chǎn)中對(duì)PEDV區(qū)分是否為變異毒株的檢測(cè)技術(shù)，也豐富了實(shí)驗(yàn)室對(duì)PEDV研究的內(nèi)容。

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