毛會秀，桑 曉，管西芹，張 瑞，王彥多，李 麗，曹廣超，劉金虎，蔡梅超

(山東中醫(yī)藥大學 藥學院，山東 濟南 250355)

1 儀器與材料

1.1 儀器

KDN-2C定氮儀配四孔消化爐(上海纖檢儀器有限公司)； MSM-2008型超濾器(上海摩速科學器材)；MemmentCO2培養(yǎng)箱(北京五洲東方科技發(fā)展有限公司)等。

1.2 試劑

土鱉蟲粉(山東中醫(yī)藥大學實驗室自制，批號20150501)，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學高德民副教授鑒定為鱉蠊科昆蟲地鱉(EupoLyphaga sinensis WaLker)；胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶(上海源葉生物科技有限公司)；改良型RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(賽默飛世爾生物制品北京有限公司)；所有試劑為分析純。

1.3 實驗細胞

喉癌細胞(Hep-2)、肝癌細胞(Bel-7402)等細胞株由山東省立醫(yī)院提供。

2 方法

2.1 土鱉蟲酶解工藝最佳用酶的初步篩選

精密稱取中藥土鱉蟲粉五份，每份1.0000 g，按料液比1∶40加入蒸餾水，超聲提取30 min，按表1進行處理，因正常情況下，胃液pH值為1.3～1.8，最高pH值可達到3.5，選擇胃蛋白酶的適宜pH值為2.0，胰蛋白酶的pH值為7.8～8.4，選擇胰蛋白酶的適宜pH值為8.0。酶解完全后在3000 r/min離心10 min，抽濾，定容至100 mL容量瓶中，得土鱉蟲酶解液。并將每種酶解液一部分用于測蛋白質(zhì)的水解度，另一部分制備凍干粉。

表1 四種蛋白酶的水解條件Table 1 Hydrolysis conditions of four kinds of protease

2.2 氨基肽氮的含量測定

2.2.1 茚三酮顯色劑的配制

精密稱取茚三酮0.5 g，果糖0.3 g，磷酸氫二鈉10 g，磷酸二氫鉀6 g，定容至100 mL。

2.2.2 標準曲線的繪制

精密稱取干燥過甘氨酸0.1000 g，溶解完全后，定容到100 mL的容量瓶中，取2.0 mL定容至100 mL得20 μg/mL的溶液，然后分別取1，2，3，4，5 mL定容至10 mL，配成2，4，6，8，10 μg/mL的標準溶液，再分別取2 mL稀釋液于試管中，同時做空白試驗，加入1.00 mL顯色劑，搖勻后放入沸水浴中加熱15 min，冷水冷卻至與乙醇溫度相同，加入40%乙醇溶液5.00 mL搖勻，放置15 min,在570 nm下測定吸光度A，繪制標準曲線。

2.2.3 樣品含量的測定

分別取土鱉蟲酶解液和土鱉蟲水提液，定量的稀釋到一定濃度，按照“2.2.2”方法測定酶解液和水提液的吸光度A，利用標準曲線計算出水解液中總氨基態(tài)氮的含量。

水解度(Degree of Hydrolysis，簡稱DH)%=已水解的肽鍵數(shù)/原料中總肽鍵數(shù)×100%=(B-C)/(A-C)×100%

式中：A：原料中的總氮數(shù)；B：水解液中的氨基氮數(shù)；C：原料中游離的氨基氮數(shù)。

2.3 MTT法測定土鱉蟲凍干粉對三個細胞株的抑制率

將處于對數(shù)生長期的細胞以每孔100 μL接種于96孔板中，在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后，棄去培養(yǎng)基，空白組加入100 μL不含血清的1640培養(yǎng)基，陽性對照組加入100 μL 100 μg/mL的順鉑，其他孔分別加入100 μL不同濃度的藥物，每個濃度的藥物重復5個孔，將細胞放在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后，在避光的條件下每孔加入20 μL 5 mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)，4 h后，吸掉上清液，加入100 μL DMSO溶液，設置六個調(diào)零孔，然后在492 nm酶標儀下測定OD值，計算細胞抑制率。

細胞抑制率(%)=[1-(加藥組OD-調(diào)零組OD)/(空白組OD-調(diào)零組OD)]×100 %。

3 結(jié)果

3.1 氨基態(tài)氮的含量測定

3.1.1 標準曲線的繪制

茚三酮法在570 nm下測定蛋白質(zhì)中游離-NH2的吸光度，然后以甘氨酸的濃度(μg/mL)為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制標準曲線,得到回歸方程為y=0.0412x-0.0008，R=0.9993。

3.1.2 樣品中氨基肽氮的含量測定

由表2可知，彈性蛋白酶酶解液中-NH2含量最高，依次是胰蛋白酶酶解液、胃蛋白酶酶解液，胰凝乳蛋白酶酶解液-NH2含量最少。

表2 土鱉蟲水解液中氨基態(tài)氮的含量Table 2 Contents of amino nitrogen in Eupolyphaga sinensis Hydrolysates

3.2 樣品中蛋白質(zhì)水解度的測定

用半微量凱氏定氮法測定1.0000 g土鱉蟲粉總氮量為85.2437 mg，依據(jù)水解度的計算公式求解出四種不同蛋白酶的水解度，如圖1。

圖1 四種蛋白酶的水解度
Fig.1 The degree of hydrolysis of four proteases

由圖1可得，彈性蛋白酶的水解能力最高，水解度達到9.95%，依次從大到小的順序為胰蛋白酶、胃蛋白酶，水解度為6.76%、4.94%，最小的水解度是胰凝乳蛋白酶，達到2.29%。

3.3 MTT法測定土鱉蟲酶解產(chǎn)物對不同腫瘤細胞的抑制率

3.3.1 不同濃度的土鱉蟲酶解液對肝癌Bel-7402細胞株的抑制效果

見圖2。

圖2 水解液對Bel-7402的抑制率
Fig.2 Hydrolysis of Bel-7402 inhibition rate

由圖2可知，胰蛋白酶水解液和彈性蛋白酶水解液對肝癌細胞的抑制曲線是直線上升的，當胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和彈性蛋白酶三者水解液濃度最大時，抑制效果最好；而胃蛋白酶水解液對肝癌細胞抑制效果并不明顯，有的濃度甚至出現(xiàn)了負增長的現(xiàn)象，所以得出胃蛋白酶水提液對肝癌細胞無作用效果。在最大濃度時，純水提液對Bel-7402的抑制率很大，是對肝癌細胞有抑制作用的成分累積，使得在最大濃度比低濃度的抑制效果明顯。所以得出四種蛋白酶水解液在高濃度時對肝癌細胞抑制效果明顯的是胰蛋白酶水解液、彈性蛋白酶水解液和胰凝乳蛋白酶水解液。

3.3.2 不同濃度的土鱉蟲酶解液對喉癌Hep-2細胞株的抑制效果

見圖3。

圖3 水解液對Hep-2的抑制率
Fig.3 Hydrolyzate inhibition rate of Hep-2

由圖3可得，胰蛋白酶水解液和彈性蛋白酶水解液對喉癌細胞的抑制率隨濃度的升高而逐漸升高，且在最大濃度時，抑制效果達到最好；胰凝乳蛋白酶水解液、胃蛋白酶水解液和純水提液的抑制率均低于零，對喉癌細胞有負增長現(xiàn)象，因此三者水提液對喉癌細胞的藥理作用無效。由此得出對喉癌細胞抑制效果最佳的蛋白酶是：胰蛋白酶和彈性蛋白酶。

4 討論

通過本實驗結(jié)果顯示，酶解土鱉蟲得到水解度最高的是彈性蛋白酶，其他依次為胰蛋白酶、胃蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，而采用MTT法的藥理實驗結(jié)果顯示，蛋白酶水解液對不同腫瘤細胞的抑制效果不同，對于肝癌細胞，在最高濃度時，胰蛋白酶、彈性蛋白酶和胰凝乳蛋白酶三者水提液的抑制作用最為明顯；對于喉癌細胞，胰蛋白酶水解液和彈性蛋白酶水解液的抑制效果最好，且隨濃度的升高而升高，在最高濃度時抑制率達到最大值。本實驗的水解度和MTT法藥理實驗結(jié)果也有一定關(guān)聯(lián)性，如胃蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的水解度都較低，對喉癌細胞的抑制效果不明顯；不同酶解液對不同腫瘤細胞的抑制效果不同，進而本實驗篩選出土鱉蟲對肝癌細胞的最佳用酶為胰蛋白酶，依次為彈性蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，對喉癌細胞的最佳用酶是胰蛋白酶和彈性蛋白酶，進而為下一步土鱉蟲最佳用酶的工藝打下了基礎。

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(本文文獻格式：毛會秀，桑曉，管西芹，等.基于半仿生及體外抗腫瘤細胞株實驗技術(shù)對土鱉蟲最佳用酶的篩選[J].山東化工,2018,47(7):10-12.)